Abstract
Opptreden styres av nervesystemet. Kalsium avbildning er en grei metode i den gjennomsiktige nematoden Caenorhabditis elegans for å måle aktiviteten av neuroner i løpet av forskjellige virkemåter. Å korrelere neural aktivitet med virkemåten, bør dyret ikke bli immobilisert, men bør være i stand til å bevege seg. Mange atferdsendringer oppstår under lange tidsskalaer og krever opptak over mange timer med atferd. Dette gjør det også nødvendig å kultur ormer i nærvær av mat. Hvordan kan ormer være kultivert og deres nevrale aktiviteten avbildes over lange tidsskalaer? Agarose mikrokammeret Imaging (AMI) ble tidligere utviklet til kultur og observere små larver og har nå blitt tilpasset for å studere alle livsstadier fra tidlig L1 til det voksne stadiet av C. elegans. AMI kan utføres på ulike livsstadier av C. elegans. Langsiktig kalsium bildebehandling oppnås uten å immobilisere dyrene ved hjelp av kort eksternt utløst eksponeringer comkombinert med et elektron multiplisere CCD (EMCCD) kamera opptak. Zoome ut eller skanner kan skalere opp denne metoden til bilde på opptil 40 ormer i parallell. Således er en metode beskrevet for å bilde oppførsel og neural aktivitet over lengre tidsskalaer i alle livsstadier C. elegans.
Protocol
1. Instrumenter, Culture Media og retter
- Bruke et mikroskop som er i stand til å holde prøven i fokus, og som er utstyrt med en automatisk trinn. Bygge en skreddersydd lokk varmeapparat eller kjøpe en kommersiell løsning. Sett opp en LED-EMCCD kamera system der eksponeringen av kameraet utløser LED-belysning gjennom en TTL signal ved hjelp av produsentens instruksjoner.
Merk: Se diskusjon for detaljer. - Polydimethylsiloxan (PDMS) frimerker:
- Dikte PDMS frimerker i en MicroFluidics anlegget eller har PDMS frimerker produsert av en kommersiell støperi. For å bruke en kommersiell produsent, send en autocad fil til selskapet og angi dybden (15 mikrometer, for eksempel) på enheten. Etter levering fra støperiet, kutt PDMS chip i sine 16 frimerker med en skalpell.
- Binde hver enkelt stempel i et glass lysbilde med luft plasma. For liming, utsetter både PDMS stempel og glass-slide til luft plasma for enbout 1 min (med de høyeste plasma innstillingene på 0,5 mbar). Sørg for at overflatene for bonding vende oppover under plasma behandling. Deretter plasserer den PDMS stempel på glasset lysbilde.
- Ta en 3,5 cm nederst fatet og kutte ut et firkantet område på 18 x 18 mm fra midten av bunnen av fatet ved hjelp av en vertikalfres og skarpe roterende kniver. Bruk lav rotasjonshastighet på stålet og langsom foring for å hindre at plasten smelter på grunn av varmen produsert av friksjon. Forberede flere retter samtidig.
Merk: Den nederste fatet kan brukes om igjen mange ganger etter forsøket hvis det er renset etter soaking i ren etanol O / N. - Agarose:
- Oppløs 3 g høyt smeltepunkt agarose i 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 g K HPO 2 4, 6 g KH 2PO 4, 1 ml kolesterol (5 mg / ml i etanol), H 2 O til 1 L, sterilisere ved autoklave) ved koking. Gjør alikvoter av agarose ble oppløst i 2 ml Eppendorf-rør og Store. Også fremstille en gruppe med lavt smeltepunkt agarose nøyaktig samme måte som den høye smeltepunkt agarose.
- Før bruk, plasserer tre alikvoter av høyt smeltepunkt agarose på en varmeblokk ved 95-98 ° C. Før bruk, plasserer en porsjon av lavt smeltepunkt agarose på en varmeblokk ved 95-98 ° C inntil den har smeltet, og deretter på en varmeblokk ved 30 - 35 ° C.
2. Valg av Dyr
- Vokse ormer på en lav tetthet på seeded NGM plater for å få rene dyr. Sørg for at det er rikelig med mat og bare noen få dyr på tallerkenen.
- For bildebehandling L1 larver, overføre ca 30 egg inneholder embryo på pretzel scenen på en fersk seeded NGM plate. For å overføre senere larvestadier eller voksen C. elegans, overføre ca 30 ormer på en fersk seeded NGM plate.
3. Utarbeidelse av agarose Microchambers
- Utarbeidelse av fatet:
- Ta en plastskål med en firkantet åpning på 18 x 18 mm i bunnen og legg den opp ned med åpningen vendt oppover. Lukk åpningen ved å plassere et stykke dobbeltsidig tape på 20 x 20 mm på åpningen. Snu fatet rundt slik at tape er på bunnen og sett formen på et hardt underlag. Skjær åpningen gratis ved hjelp av en skalpell.
- Ved hjelp av en P1000 pipette, fyll 2 ml 3% høy smeltepunkt agarose i S-Basal i formen. Plasser agarose på det området som omgir åpningen, og lar stivne. Vent til agarose er solid.
- Snu deg rundt fatet og skrelle av beskyttelsesfilmen som dekker dobbeltsidig tape slik at den klebrige siden vil forbli på parabolen, og vil bli utsatt for.
Merk: Som et resultat, vil en fin ring av selvklebende tape omgir utsiden av åpningen. Agarose tjener som en fuktighets reservoar som senere vil omgir prøven.
- Avstøpning av microchambers:
- Expose the PDMS overflate for støping med luft plasma for 20 - 60 sek.
Merk: Denne plasma behandling gjengir PDMS overflaten hydrofile, som hindrer fangst av luftbobler og gir skarpere utskrifter. - Konstruer to avstandsstykker av lik høyde ved å stable 5-9 glass. Place, parallelt med sine langsider, den første avstands stabelen, da en enkelt glassplate, og deretter igjen et avstandsstykke stabel. Sett glasset lysbildet som inneholder PDMS stempel orthogonally over avstandsstykkene. Justere høyden på avstandsholderne, slik at det er et mellomrom på omtrent 1,5 mm mellom støpeoverflaten PDMS stempel og enkelt glass-slide.
- Plassere en dråpe av varm væske høyt smeltepunkt agarose på enkelt glass-slide i nærheten av PDMS stempel og raskt skyv PDMS stempel vertikalt ned i væsken agarose. La agarose stivne. Sjekk at det blir en ugjennomsiktig utseende, noe som vanligvis tar ca 2 min. Trekk av stempel vertikalt med ett trekk.
Merk: Det er praktisk å glue avstands glir sammen med dobbeltsidig tape. Den vertikale bevegelse av stempelet hindrer luftbobler fra å bli fanget i agarose.
- Expose the PDMS overflate for støping med luft plasma for 20 - 60 sek.
- Overfør egg eller ormer sammen med OP50 bakterier på agarose med en fin platinatråd hakke. Distribuere ett egg eller en orm per kammer sammen med mat ved hjelp av en øyenvippe. Fyll rundt 30 egg på en agarose pad.
- Kutt agarose skive som inneholder de fylte microchambers til en firkant på ca 15 x 15 mm, slik at den passer fint inn i åpningen av fatet. Plukk opp plassen agarose skive med pinsett og legg den opp ned på et glass dekkglass på 20 x 20 mm. Når droppet, ikke løfte den opp igjen eller skyv den rundt fordi dette kan føre til at bakterier og ormer å bli skjøvet ut av sine kamre.
- Montering av parabolen:
- Plasser glass dekkglass på åpningen av plastskål. Trykk forsiktig ned dekkglass på ring laget av dobbeltsidig tape.Pass på å ikke bryte glasset.
- Snu fatet opp ned og bruke en P1000 pipette for å fylle gapet mellom agar plate som inneholder microchambers og agarose reservoar med væske med lavt smeltepunkt agarose avkjølt til ca. 30 ° C. Vent til agarose har stivnet.
- Forsegle fatet med lokk. For inverterte mikroskoper bruke et oppvarmet lokk. For stående mikroskoper bruke en vanlig lokket og forsegle fatet med Parafilm.
- Etter endt utarbeidelse av microchambers, sjekk dem under et stereomikroskop. Den riktige fylling er avgjørende. Se diskusjon for detaljer.
4. Kalsium Imaging
- Bruk transgene stammer som uttrykker genetisk kodet kalsium sensorer som HBR16 (goeIs5 [pnmr-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3'UTR, unc-119 (+)]) 27.
- Bruk en sammensatt mikroskop utstyrt for bredt felt epifluorescence. Koble TTL utgang av EMCCD kameraet tilTTL inngangen av LED, slik at hver gang kameraet registrerer en ramme prøven vil bli belyst. Bruk en eksponeringstid på omtrent 5 millisekunder. Bruk EM gevinst i størrelsesorden 50-300.
- Angi en burst film kjører i 24 timer med hver orm som avbildes hver 15-30 min første for 20 sek med DIC, deretter i 20 sekunder med en GFP fluorescens å registrere GCaMP, og deretter ta et endelig bilde av mKate2 signal er tatt til kontroll for uttrykket nivåer. Bruk en bildefrekvens på 2 / sek i løpet av hver burst.
- For visuell data inspeksjon, bruke en falsk-farge kartet for å øke synligheten av små endringer i fluorescens intensitet. Plott fluorescerende data som AF / F, med F være gjennomsnittlig baseline verdi av fluorescens. En detaljert beskrivelse av kalsium dataanalyse kan bli funnet i litteraturen 20.
5. Parallell AMI av flere Worms
- Sett fatet inneholder microchambers på mikroskopet, fokus på prøven og engasjere autofocus. Sett opp et programvareprotokoll slik at kameraet får et utbrudd av 40 bilderammer i 20 sek hver halve time i 24 timer, noe som vil resultere i 1920 bilder per orm, en rimelig mengde data. Sett opp skanningen slik at det besøk hver ormen bruker scenen. Mål å filme ca 30 ormer i ett løp.
- Bilde flere ormer ved å zoome ut, dvs. med en lavere forstørrelse. Bruk en lavere forstørrelse for å dekke flere microchambers med kameraet chip og filme flere tilstøtende microchambers samtidig. Etter utløpet av bildet oppkjøpet, skille data for hver enkelt kammeret ved å beskjære et interesseområde dekker ett dyr.
- For å vurdere raskt mobilitet data, bruke rammen subtraksjon 28-32.
6. Imaging ulike stadier C. elegans
- Bruk agaroseplater microchambers for alle livsstadier av C. elegans fra L1 til voksen og inkludert dauers. Bruk egnede kammer dimensjoner for diflige livsstadier som er vist i tabell 1.
| Livsfase | Chamber størrelse | Chamber dybde | Typisk opptakstid | Forstørrelse |
| L1 | 190 x 190 mikrometer | 10 - 15 um | egg - mid L2 | 400X |
| L2 | 370 x 370 mikrometer | 15 um | egg - L3 | 200X |
| Dauer larve | 370 x 370 mikrometer | 25 um | 4 dager | 200X |
| L3 | 700 x 700 mikrometer | 45 um | L2 - L4 | 200X |
| L4 | 700 x 700 mikrometer | 45 um | ung L4 - ung voksen | 100X |
| Ung voksen | 700 x 700 mikrometer | 45 um 12-24 timers | 100X |
Tabell 1. Chamber størrelser for ulike livsfaser. Vist er kammerdimensjoner og forstørrelsene som er nyttige for forskjellige trinn som er optimalisert for en 8 x 8 mm kamera chip.
Representative Results
Agaroseplater microchambers kan brukes på alle livsstadium av C. elegans. Som kan sees i figur 1A, kan larveutvikling og sove oppførsel under L1 lethargus holdes. Vist er kammer størrelser som er 190 x 190 mikrometer, 10 mm dyp. Hvis lengre tidsskala er nødvendig, kan større kamre brukes. Som kan sees i figur 1 B, ved hjelp av et kammer med større dimensjon (370 x 370 mikrometer, 25 mikrometer dype) tillater utvikling av C. elegans fra egg til voksen. Figur 1C viser en analyse av langsiktige endringer i atferd ved hjelp ramme subtraksjon av en orm vokst i et kammer fra egg til voksen. Vist er middel intensiteter etter ramme subtraksjon for utvalgte pakker under våkne og lethargus. Jo lavere den midlere intensitet etter helbilde subtraksjon verdiene er, desto lavere er mobiliteten til ormen. Vist er valgt serie spor fra ett våkne tilstand og ett lethargus tilstand per larvestadiet. Denobserverte økningen i midlere intensitet under utvikling er for det meste på grunn av økt kontrast og størrelsen på dyret. Figur 1D viser et Dauer larve, en alternativ livsstadium som er engasjert under ugunstige miljøforhold 33. Chamber størrelse er 370 x 370 mikrometer, 15 mikrometer dyp. Legg merke til at Dauer larven ble plassert inn i kammeret uten bakterie mat, noe som ville føre utgangen fra Dauer larvestadiet. Figur 1E viser en voksen orm som allerede er lagt mange egg inn i kammeret. Kammerdimensjoner som brukes for den voksne var 700 x 700 um, 45 um dypt. Til slutt viser figur 1F en voksen hermafroditt og en mannlig parings inne en voksen kammer.
Kalsium bildebehandling i bevegelige ormer er mulig med GCaMP kalsium sensorer. 2A, B-show kalsium avbildning av kommandoen interneuron AVA for en L1 larve 27. Figurene 2C, D viser kalsium aktivitet for sameg type neuron i et voksent dyr.
Skalere opp langsiktig bildebehandling er mulig ved skanning og ved å zoome ut. Figur 3A viser bildekvaliteten samtidig avbildning av 30 ormer på ett kamera chip med et 5 megapiksel kamera. Figur 3B viser bildekvaliteten på fire ormer kalsium avbildes samtidig.
Figur 1. Tilpasning av AMI til alle livsstadier av C. elegans. (A) Larva fotografert fra tidlig L1 til tidlig L2 stadium i 190 x 190 mikrometer kamre. (B) Utvikling fra egg til voksen i et 370 x 370 mikrometer kammeret. (C) Mobilitet av en orm vurdert ved hjelp ramme subtraksjon. Vist er den gjennomsnittlige intensiteten av alle bilder av bildet etter rammen subtraksjon for en valgte serie film for hver larve stage for våkne og lethargus atferd. (D) En Dauer larven i fravær av mat i en 370 x 370 um kammer. (E) Voksen hermafroditt med mange egg som er lagt inn i en 700 x 700 mikrometer kammeret. (F) Mating av en mannlig og en hermafroditt inne i en 700 x 700 mikrometer kammeret. YA betyr ung voksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kalsium bildebehandling med AMI. (A) Kalsium bildebehandling med GCaMP3 i kommando interneuron AVA av L1 larver hjelp av NMR-en promoter. Vist er to falske fargebilder. I venstre bildet, er aktiviteten til AVA lav og ormen er ikke å gjøre en bevegelse bakover. I høyre bilde aktiviteten til AVA er høy, og ormen beveger seg bakover. (B) Kalsium transienter over tid for en L1 orm. (C, D) Kalsium transienter i en voksen dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Imaging flere ormer i parallell ved å zoome ut. (A) samtidig avbildning av 30 L1 ormer per bilde som bruker 190 x 190 mikrometer kamre og en 100X forstørrelse (ved hjelp av en 10X objektiv) og en 16,6 x 14 mm kamera chip. (B) samtidig avbildning av fire L3 ormer per bilde som bruker 370 x 370 mikrometer kamre og 100X forstørrelse og en region av interesse for en 16,6 x 14 mm kamera chip.et = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Hardware
Fokus for et mikroskop vil typisk drift ved langtids image oppkjøpet. For sammensatte mikroskoper, fokus bevarende systemer kan kjøpes fra de store mikroskop produsenter. I tilfelle et sammensatt mikroskop med fokusstyre er også dyrere, ville en enkel alternativ være å benytte et stereomikroskop. Sammensatte mikroskoper tillate bruk av målene med høy numerisk apertur (NA) og kan lett automatiseres. 40X olje målene er godt egnet. Nedsenking i vann linser er ikke ideelt på grunn av fordampning ved langtids bildebehandling. Differential forstyrrelser kontrast (DIC) genererer en fin kontrast som bidrar til å følge morfologiske og adferdsendringer, men enkel lysfelt-avbildning kan også brukes. For DIC eller lyse felt bildebehandling, bruke rødt lys ved å plassere et rødt lys filteret inn i dia-belysning banen til mikroskopet. For skanning av flere microchambers en automatisert scenen er nødvendig. Best ytelse er achieved når en scene er brukt som har ikke-lineær akselerasjon og retardasjon og kan settes til lav skannehastighet for å unngå å forstyrre dyrene under skanning. Vi har ikke observert atferdsmessige reaksjoner eller kalsium økning i mechanosensitive nevroner (ALM og PLM) under skanning, noe som tyder på at langsom skanning faktisk aktiverer ikke mechanosensitive system av ormen (data ikke vist). Kommersielle LED-systemer kan brukes. Flere selskaper tilbyr klar til bruk løsninger som inkluderer lysdiodene på forskjellige bølgelengder. Lampen skal ha mulighet til eksternt utløse LED med en TTL signal. En svært følsom kamera er nødvendig for kalsium avbildning av bevegelige dyr. EMCCD kameraene er de mest følsomme kameraer på markedet. Kameraet må ha en TTL utgang under eksponering (også kalt "ild" output). Et lokk varmeren er nødvendig for å hindre kondens på lokket ved bruk av et invertert mikroskop. På en oppreist mikroskop, vil fatet plasseres slik at lokket wivil være ved bunnen og således kondensasjon forhindres og uten lokk oppvarming er nødvendig. Lokket bør tett lukke retten for å hindre fordamping av vann ved langtids bildebehandling.
PDMS frimerker
Overflaten av PDMS stempel som inneholder strukturen for støping av agarose er møtt bort fra glass-slide, som støtter PDMS stempel. En liste med selskaper som tilbyr tilpassede microfluidic chips kan bli funnet på Wikipedia ( http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies ).
Påfylling av nematoder i sine kamre
Dette er den mest kritiske trinn i protokollen og følgende punkter bør vurderes: A) Den fuktighet av agarose er avgjørende for å overføre ormer og for bildebehandling. Dersom agarose er for fuktig, dvs. at det er en væske COVering et område av flere microchambers, vil det ikke være mulig å fordele bakteriell mat og ormer på en styrt måte, fordi væsken vil gjøre bakteriene strømme bort. Dersom agarose er for tørr da bakterier og ormer kan ikke gå av pick lett som betyr at økt kraft må brukes til å slippe ormer og bakterier som lett forårsaker skade på agarose. Når du fyller i en rekke ormer agarosen kan tørke opp. I verste fall agarose blir så tørr til slutt at kamrene vil kollapse. Dersom den er for tørr agarose det kan rehydrert ved å plassere en liten dråpe (ca. 2 ul) av S-Basal på siden av brikken, hvor det ikke er noen ormer. Deretter dypper den platinatråd plukke inn i væsken og til og med trekke noe av væsken i det område hvor kamrene er fylt med ormer. B) Hvor mye mat er avgjørende for vellykket langsiktig bildebehandling. Dersom det ikke er nok mat, kan ormer renne ut av den. Dersom det er for mye mat i hulrommet i kammeretvil ikke oppføre seg som en væske, men heller som en solid og vil tillate ormer å unnslippe fra kammeret ved å skyve av bakterier. Tar sikte på å oppnå en bakteriell suspensjon som fyller hele kammeret. De ormer er i konstant fysisk kontakt med agar og glassoverflaten langs det meste av sin lengde under eksperimentet og kryp oppførsel synes å være lik bevegelse på en plate og ulikt juling i væske. C) Mekanisk skade på agarose kan ødelegge forsøket. En fin pick er avgjørende. Det bør ikke ha skarpe hjørner. En myk øyen festet til en pipettespiss kan brukes til å flytte bakterier eller ormer inn i kamrene i stedet for å bruke en platina hakke. I de fleste tilfeller er imidlertid overdried agarose årsak til skader. Plukk eller øyevipper bør ideelt sett bare så vidt berører agarose selv, og vannet film på agarose overflaten bør trekke av ormer og bakterier. Ved forsegling av kamrene, igjen, er vesentlig fuktighet i agarose. Det bør ikkevære fri væske på agarose overflaten fordi dette kan vaske bort bakterier og ormer under forsegling. Store bobler kan fjernes ved forsiktig å løfte et hjørne av agar plate. Små bobler som er mindre enn kammeret ofte blir fanget inne i kamrene. Disse boblene er ikke et problem, og vil forsvinne ved absorpsjon. Etter montering fatet, sjekk igjen at agarose er ikke for tørt eller for vått. Kamrene bør være pent forseglet, og det bør ikke være noen strøm av væske mellom kamrene. Dersom agarose er for våt, vil kamrene ikke tetter skikkelig. Worms kan rømme eller deres mat vil bli vasket bort. Hvis prøven er for fuktig, enkel åpne lokket og la agarose tørke i et minutt eller to. Dersom agarose er for tørr, kan kamrene kollapse og ormer vil unnslippe.
Skalere opp ved å zoome ut
For fluorescens bildebehandling, er å zoome ut begrenset av lav mengde lys oppnås ved lavere forstørrelser. Også EMCCD kameraer er optimalisert for følsomhet og har ofte en forholdsvis lav oppløsning. Men skalere opp bilde fire-fold er godt mulig. For eksempel kan fire kamre av 190 mikrometer x 190 mikrometer passe inn på ett bilde når du bruker 140X forstørrelse (oppnås ved å bruke en 20X Mål og en 0,7X kamera mount) og en 512 x 512 piksler, 8 x 8 mm kamera. En høyoppløselig kamera med en stor brikke (som sCMOS kameraer, 16,6 mm x 14 mm chip, 2560 x 2560 piksler = 5,5 megapiksler) optimaliserer oppskalering av DIC og lyse felt bildebehandling. For eksempel, opp til 30 L1 ormer i 190 um x 190 um kamre kan passe inn på hver ramme av dette kameraet ved bruk av en 100x forstørrelse (se figur 3). I prinsippet zoome ut og scanning kan også kombineres for å oppnå enda større antall dyr. De fleste nevroner bli ganske bra i fokus, slik at bare en fokalplan må avbildes. Hvis det blir funnet nerveceller til å flytte ut av fokus, az skanning ved hjelp av en piezo-stasjonen kan tas hver gang point.
Tilpasning til ulike atferd
Denne protokollen gir et godt inntrykk av oppførselen over lange tidsskalaer. Selvfølgelig må tidspunktet for blokker som skal tilpasses til forskjellige virkemåter og livsstadier.
Begrensninger av teknikken
Flere faktorer begrense varigheten av imaging. Det viktigste er mengden av mat. Når maten er fortært, larver stoppe utviklingen. Derfor, i små kamre (190 x 190 mm) ormer utvikle inntil L3 scenen og arrestere da. Hvis lengre avbildning tiden er nødvendig, større kamrene må benyttes. Den maksimale varigheten av langsiktig bildebehandling er i størrelsesorden 2,5 til 3 dager. Hvis lengre avbildning er nødvendig, ormer må gjenvinnes og plasseres i nye kamre. Når bildebehandling voksne ormer, er en annen begrensning forårsaket av avkom av disse ormene. Voksne ormer legge egg fra hvor larvene klekkes. Disse larvene vil også bo inne i kammeret, Spis mat, og kan forstyrre bildeanalyse. Hvis avkom er et problem, er en løsning å enten bruke sterile voksne eller for å gjentatte ganger plassere ormer inn ferske kamre. For å gjenopprette ormer, blir agarose skive som inneholder kammeret skjæres løs med en skalpell, trekkes av dekkglass, og er plassert på en plate NGM hvorfra ormer kan utvinnes. En annen begrensning er en begrensning av ormer til relativt små områder. Dette kan være et problem hvis langtrekkende bevegelse må analyseres. Mens dyr i kamrene kan stimuleres mekanisk og optogenetically 21,27,34,35, blir den forseglede arten av kammeret gjør det vanskelig å anvende oppløselige eller flyktige stimulerende midler. Biologisk viktige gasser slik som oksygen eller karbondioksid kan diffundere fritt i agar. Den store luftreservoaret i fatet bør holde gasskonsentrasjonen i kamrene konstant over tiden som er nødvendig for eksperimenter. Det bør imidlertid være oppmerksom på at den lokale oksygen-konsentrasjonenn i kammeret kan ligne mer på forholdene som finnes i flytende kultur enn kultur på tallerkenen.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Microfluidic enheter har sterkt avansert atferds og utviklings studert i C. elegans. Ofte er microfluidic strukturer laget av PDMS 12. Her beskriver vi en protokoll for å generere microfluidic kulturkamre laget fra agarose. Styrken av denne teknikken er kombinasjonen av høy bildekvalitet, korrelasjon av atferd med fysiologiske målinger, langvarig avbildning, og en rimelig høy gjennomstrømning. Høy bildekvalitet oppnås ved å avbilde gjennom dekkglass ved hjelp av høye NA mål. Som et resultat, kan fluorescensavbildning som kalsium avbildning og konfokal avbildning av subcellulære strukturer utføres. Fordi dyrene ikke er immobilisert som i andre systemer, gir det en korrelasjon på oppførsel med fysiologiske målinger. Because dyrene har god mat, fortsetter de å utvikle slik langsiktig bildebehandling. Dette systemet kan bilde mange ormer i ett løp fordi dyrene er begrenset til sine definerte kamre. Således kan denne fremgangsmåte være lett skaleres opp 9,27,34-36.
Fremtidige søknader
Så langt har dette systemet blitt brukt hovedsakelig til å studere søvn atferd i C. elegans L1 larver. Imidlertid vil en tilpasning til alle trinn gjør det mulig å undersøke et bredt spekter av atferd også i dauers og voksne. Et bredt spekter av atferd kan studeres med denne teknikken som strekker seg fra parring til egglegging.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Max Planck Society og en Gött Graduate School Junior Gruppe stipend til HB finansiert dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High melting point agarose | Fisher Bioreagents | BP(E)164-1000 | |
| Top Vision low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| Stereomicroscope | Leica | M5 | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Plasma cleaner | Harrick | PDC-23G2 | |
| Lid heater | MPI workshop | custom made | |
| Plastic dish | Falcon | 08-757-100A | |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| PDMS stamp | Abbott Laboratories | custom made | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning | |
| Double sided sticky tape | Sellotape/Henkel | double sided 25 mm x 33 m | alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used. |
References
- Brenner, S.
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, 877-879 (2013).
- Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).
- Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. Tracking movement behavior of multiple worms on food. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A.
- Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS One. 3, e2208 (2008).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).
- Bringmann, H. Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae. Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).
- Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).
- Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. Non-microfluidic methods for imaging live. C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , 1-19 (2013).
- Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of. C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Hilliard, M. A., et al. In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents. EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, e198 (2008).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).
- Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in. C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).
- Singh, K., et al. C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence. Current Biology. 21, 825-834 (2011).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Iwanir, S., et al. The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron. Sleep. 36, 385-395 (2013).
- Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans. Methods. , (2014).
- Nagy, S., et al. A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling. eLife. 2, e00782 (2013).
- Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).
- Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 21, R983-R984 (2011).
- Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus. Worm. 1, 12-14 (2012).
- Schwarz, J., Bringmann, H. Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 8, e75853 (2013).
