Introduction
膀胱癌は、米国1で約75,000の新たな症例は毎年で、尿生殖路の最も一般的な癌の一つです。再発の高い割合は、膀胱癌治療のための最も高価な癌のいずれかを行う生涯フォローアップを必要とします。高品位NMIBC金標準的な治療はBCG膀胱内での免疫療法に続いて、トランス尿道的切除です。 BCGの抗腫瘍活性の正確なメカニズムは完全には解明されないままであるが、それは、Tヘルパー（TH）1と、細胞傷害性T（TC）1細胞が濃縮された細胞性免疫応答の活性化のために重要であることが認められています治療2の成功。
BCGはNMIBCのための選択の治療法が残っているという事実にもかかわらず、治療に反応しない患者の割合が高いです。しかも、それは多くの副作用を引き起こす可能性があります。処理された腫瘍の約70％は、筋肉侵襲性の形態に〜15％の進捗状況をいくつかの時間後に再発し、病気。 BCG治療に関連する他の副作用は排尿障害、膀胱炎や腎感染3-6を含みます。
新たな治療戦略の開発は、最初のin vitroでの評価以下、考慮に前臨床モデルの使用を取る必要があります。これは、その微小環境大幅に処理し、その開発と応答性に影響を与えることができる腫瘍に特に関連します。
過去10年間、私たちはHP-NAP、細菌ヘリコバクター·ピロリによって産生されるタンパク質の免疫調節活性の複数の側面に対処している、最初に多形核細胞（PMNの）7の内皮接着を促進することができるように同定しました。構造的には、HP-NAPは、飢餓状態の条件（DPS）ファミリー8下のDNA保護タンパク質に属し、12量体シェル内に配置された12の同一のサブユニットから構成されています。
我々は、HP-NAPであることが実証されていますインビトロおよびインビボの両方で 9~10、のTh1表現型へのTリンパ球の分化を駆動するための責任強い免疫調節活性を有するToll様受容体（TLR）2アゴニスト。この活動のおかげで、HP-NAPは、アレルギー性喘息11のマウスモデルにおいて、より有益なTh1応答にTh2免疫応答をリダイレクトすることができます。
HP-NAPのにTh1依存性の抗腫瘍性を評価するために、我々は、BCG投与の影響を評価するためのオドネルと同僚12によって、数年前に開発膀胱癌のマウスモデルを利用しました。
このプロトコルでは、我々はHP-NAPは、膀胱癌に対する強力な抗腫瘍ポテンシャルを持っていること、およびHP-NAP投与の有効性は、（インターフェロンを生産両方のTh1とTc1のリンパ球、腫瘍および所属リンパ節内に、有意な蓄積と平行していることを実証しますIFN）は13-γ
本報告書では、動物の準備、それらの尿道カテーテル、膀胱粘膜への細胞の付着、および腫瘍細胞の注射のために必要な化学燃焼を詳述、stepbystepプロトコルを提供します。また、膀胱癌の治療のために開発された任意の治療薬の原型とみなすことができるHP-NAPの局所投与を記載しています。制御とHP-NAP-処置動物から単離された腫瘍を比較することによって得られた証拠はないだけで、HP-NAPは、膀胱癌免疫療法のための優れた候補だけでなく、実験設定の一般的な有効性とすることができるという事実を強調しています。
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Protocol
動物取扱すべての手順は、保健のイタリア省（DM 2011分の204-B）によって承認されています。
1.動物
- microisolationフィルターと個別換気ケージに生後8週間のC57BL6 / J雌マウスを育てます。
注：その外部泌尿生殖器装置の解剖学的立体構造が男性よりカテーテル簡単に描画するため、女性が好ましいです。
2.細胞培養
- 加湿5％CO 2中、37℃で10％熱不活化ウシ胎児血清および50μg/ mlのゲンタマイシンを補充したRPMI 1640培地中のマウスの尿路上皮癌細胞株MB49を維持します。
- 80％のコンフルエンスにT-75フラスコ中MB49細胞を成長させます。トリプシン処理し、0.5×10 5で再懸濁-マウスでは、移植前にPBSを150μlあたり0.5×10 6個の細胞。
3.膀胱内腫瘍インプラント
- （それぞれ、33ミリグラム/ kgおよび20mg / kg）麻酔薬のzoletilとxylorのミックスを使用して、マウスを麻酔、腹腔内に注射しました。
- 仰臥位で動物を置き、スコッチテープでパッドに後ろ足を固定します。足は十分に可視およびカテーテルの挿入のために簡単にアクセス尿道口をレンダリングするために分離しなければなりません。
- 注：カテーテルは、24 G小児静脈カテーテルは、8〜10週齢のマウスに適しています。カテーテルの選択は、尿道壁とカテーテルとの間の液体の漏れを回避するために非常に重要です。大きな穴カテーテルは大きくなったり、古いマウスを使用する必要があります。
- 小さなニッパーを使用して、尿道の外側部分の一方の端をつまんで、マウスの「ヘッドエンド」に向かって非常に軽くねじります。このアクションは、尿道口を露出させます。
- カテーテルの内部針を外し、45°の角度で尿道に後者を挿入し、少し指向マウスの「末尾」に向けました。カテーテルの入り口を無理に押し込まないでください。それは尿道の内側にスリップまで抵抗の場合には、ちょうど、非常に静かにカテーテルをねじります。カテーテルの約0.5〜0.8センチメートルが尿道内にある場合には、慎重にマウスの尾にカテーテル平行に配置し、それを完全に挿入します。
- 1mlシリンジを使用して、カテーテル内に挿入しなければならないそれらの針は、滅菌PBSの200-300μLを注入することにより、残存尿から膀胱を洗浄し、膀胱からすべての液体を吸引します。
- 注：PBSを注入すると、膀胱がいっぱいになり、腫れがマウスの後ろ足の間に表示されます。これは、カテーテルが正しいことを確認します。ほとんどのカテーテルは、注入量を計算するときに考慮しなければならないデッドボリュームを有しています。
- 滅菌1mlシリンジを使用して、0.1 N HClを200μLを注入します。その壁全体を燃焼させるために膀胱を埋めます。 10秒後、すぐにすべての酸を除去し、neutrali滅菌シリンジで0.1 N NaOHを200μLを注入することによりぜ。細胞（0.5×10 6）の最大数の注入の場合には、酸性化工程は不要です。
- 吸引し、すべての残液と直ちに滅菌PBS300μlの空洞を洗浄します。
- 吸引によって膀胱を空にし、MB49細胞（範囲0.5×10 5から0.5×10 6）を含むPBSを150μlを注入膀胱に。細胞の漏れを回避するために、カテーテルに組み立てられた注射器を残します。これは、スコッチテープでパッドにそれを固定することにより、シリンジを確保することをお勧めします。
- 1時間後、静かに尿道からカテーテルを抽出し、彼らが目を覚ましまで白熱灯の下で、ケージ内にマウスを置きます。これは通常、治療の終了後1及び2時間の間に発生します。
HP-NAPの4膀胱内デリバリー
- 注：細胞の点滴注入後、少なくとも3日、それを開始することが可能です治療。
- ステップ3.1から3.4に記載されているようにカテーテルを挿入します。この段階では、HClを用いて膀胱壁を燃焼させる必要がありません。
- 1ミリリットル注射器を用いて、滅菌PBSの200〜300μLを注入することにより、残留尿から膀胱を洗浄し、膀胱からすべての液体を吸引します。
- 膀胱内に150μlのPBSあたりHP-NAP50μgのを注入します。タンパク質溶液の漏れを回避するためにカテーテルに取り付けたシリンジのままにしておきます。スコッチテープでパッドにそれを固定することにより、注射器を固定します。
- 彼らが目を覚ましまで、白熱灯の下で、1時間後、静かに尿道からカテーテルを抽出し、ケージ内にマウスを置きます。
5.腫瘍外植片および組織学的分析
- 処理の終わりに、動物を犠牲に仰向けの位置にそれらを配置し、スコッチテープでパッドに後ろ足を固定します。
- 手術用メスを用いて、皮膚を通して約1.52センチメートル長い縦切開を作ります腹膜は、マウスの「ヘッドエンド」にちょうど外性器の上に出発します。膀胱を損傷する危険性を最小限に抑えるために、カットの深さに特に注意を払います。
- 膀胱は、カットの中央左に配置されますと、腫瘍は濃いピンク/バイオレット質量として表示されます。その切除の際に、組織学的ケージに膀胱全体を配置し、パラフィンに包埋する前に、10％緩衝ホルマリンで固定します。
- 組織学的および免疫組織化学的分析のために、標準的なミクロトームを用いて膀胱（46ミクロン厚）の連続切片を準備します。
- ヘマトキシリン/エオシンを持つセクションを染色し、腫瘍の大きさ（DのXD 2）、コンピュータ支援画像解析装置を用いて、断面積あたりの壊死の割合を決定するための計算を進めます。
- 血管計数は、標準的な免疫ペルオキシダーゼ技術を用いて、内皮マーカーCD31 / PECAMためのセクションを染色することによって進行します。セクションをスキャン最高の血管密度の領域を特定するために（4×）、低消費電力をトン。この領域内では、高出力（20×）で5つの別々のランダムな分野で個々の微小血管をカウントします。
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Representative Results
図1は、カテーテル法を示す図です。マウスは、カテーテルを挿入し、0.5×10 6 MB49細胞を点滴注入されます。 HP-NAPによる治療は、膀胱壁に付着し、増殖することを可能にするために、3日目の腫瘍細胞の注射後に開始されます。対照群に属する全ての動物は腫瘍を発症します。それらのいくつかは、尿道の閉塞による13日間の期間の終了前に死亡することがあります。
HP-NAPとの最初の注射後、動物を4回の注射の合計、3日ごとに処理されます。実験の終了時に、13日で、動物を屠殺し、膀胱を組織学的および免疫組織化学的分析のために収集しました。 図2Aに示すように、HP-NAPで処置したマウスからの膀胱内の腫瘍の体積は、ビヒクル処置マウスの腫瘍よりも有意に小さい（830±1 対 220±62ミリメートル380ミリメートル3）。
興味深いことに、ながら車両処理動物における腫瘍は8 HP-NAP処置動物の7に腫瘍が膀胱壁（ 図2B）内に閉じ込められて、基礎となる脂肪組織に浸潤します。最後に、血管分布が低減され、壊死の程度は、動物（ 図2BおよびC）を制御する点で、HP-NAP処置マウスで増加します。
図1.マウスのカテーテル。雌マウスを麻酔し、24 G滅菌カニューレを使用してカテーテルを挿入されています。右側のパネルには、ブラックボックスの倍率である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
HP-NAPの図2.抗腫瘍活性。MB49細胞（0.5×10 6）を用いて0日目に移植したマウスは、3日目、6日HP-NAPまたはPBS（車両）を50μgで処理され、9と12.全ての動物は13日目の対照マウスから単離した膀胱及びHP-NAPで処置した動物における（A）代表的な組織学的分析、および腫瘍容積の定量化で殺されます。 （B）パネルAの部分の拡大と2群の動物における壊死の割合。 CD31 / PECAMについて染色（C）切除ブラダー;コントロールとHP-NAPで処置した動物からの代表的な切片を示します。微小血管密度（C、右パネル ）の定量。 HPF、highpowerフィールド。データは、平均±SDを表します。群当たりn = 8匹のマウス。統計的有意性は、スチューデントの t検定（** p <0.01）によって決定しました。 Codolo らから変更図アル。13。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
癌治療の進歩の大部分は、臨床試験を開始する前に、動物モデルでテストを必要とします。動物モデルを利用して、 インビボでの腫瘍生物学を研究する可能性は、異なる治療法の評価を可能とする、癌の発病を調査する研究者のための重要なツールです。同所モデルは、腫瘍モデルを設定し、それらが天然に存在する腫瘍16の環境を模倣するためにするための細胞株の膨大な量の両方が利用可能な、ゴールドスタンダード14-15残ります。
後者はxenoimplantsを受ける免疫不全マウスでは不可能であるため、また、ここに記載されているように、同系マウスにおける癌の同所性モデルを設定し、免疫療法に基づく新たな治療戦略を調査することを目的とした研究の場合に特に関連します。
このプロトコルで示される方法は、Tを記述する腫瘍細胞の接種および膀胱腔への治療薬の投与の両方を可能に雌マウスの尿道の彼はカテーテル。
（代わりに、例えば、トリプシンまたはポリ - リジンの使用などの他のアプローチを、上に詳述したように）酸燃焼を通して膀胱壁の前処理の利点は、大きな、高度に浸潤性腫瘍の発達を促進するものです。逆に、おそらく腫瘍細胞17の生存率にこれらの物質の残留物の有害な影響に、トリプシンおよびポリリジンと小さく、低侵襲性の腫瘍で結果をプリコンディショニング。後者は膀胱壁の穿孔および腹膜18への腫瘍の普及を引き起こす可能性があるため、酸熱傷は、電気焼灼に基づいて、他の前処理システムに好適です。
プロトコルは、短期試験（〜13日）のために最適化されています。広報を注入高い細胞数が原因で、大きな腫瘍負荷をより迅速腫瘍増殖およびおそらく動物の損失をもたらすので、細胞のoperの数は、重要です。ユーザーは技術に自信がなるまでまた、尿道や膀胱に損傷を与えるリスクのある程度は、このように、動物の死を引き起こすことがあります。我々の経験では、しかし、動物を適切に操作される（したがって、手順の間に死ぬことはない）場合、それらは実験（13日）の期間中に受けずに生きています。また、注入した細胞の数を減少させることにより、実験の持続時間を延長することが可能です。
我々は、より高いメリット/副作用を持た新しいものとBCGに基づいて、現在の治療を改善し、最終的に代替する目的で、 ピロリ菌により産生されるタンパク質HP-NAPの抗腫瘍活性を評価するためにこのモデルを使用し比率。より一般的には、この実験的なアプローチは、すべての前cliniに採用することができます膀胱腔への治療剤の送達を必要的評価。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、者協会イタリアーナあたりラRicercaスルCancro、大学のイタリアの研究省、PrinプロジェクトとPROGETTIディRicercaディアテネオ、付与N°CPDA137871、Fondazione Cariploでサポートされていた、NはMDBに2011から0485を°、およびFinanziamento Giovaniによって付与ガイアCodoloにStudiosi、パドヴァ大学、。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
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