Introduction
Urinblåsecancer är en av de vanligaste cancerformerna i urogenitalområdet, med nästan 75.000 nya fall varje år i USA 1. Höga hastigheter av återfall kräver livslång uppföljning, vilket gör blåscancer en av de mest kostsamma cancer att behandla. Guldmyntfoten behandling för hög kvalitet NMIBC är trans-uretral resektion följt av intravesikal immunoterapi med BCG. Även om den exakta mekanismen för anti-tumöraktivitet av BCG står att helt klarlagd, är det accepterat att aktiveringen av ett cellförmedlat immunsvar anrikad på T-hjälpar- (Th) 1 och cytotoxisk T (Te) 1-celler är avgörande för framgången av terapin 2.
Trots att BCG förblir behandlingen av valmöjligheten för NMIBC, en hög andel patienter svarar inte på behandlingen; dessutom kan den orsaka ett antal biverkningar: ca 70% av behandlade tumörer återkomma efter en tid och ~ 15% framsteg till muskeln-invasiv form avsjukdom. Andra biverkningar i samband med BCG behandling inkluderar dysuri, cystit och njurinfektion 3-6.
Utvecklingen av nya terapeutiska strategier måste ta hänsyn till användningen av prekliniska modeller, efter inledande in vitro-bedömning; Detta är särskilt relevant i tumörer vars mikro kan väsentligt påverka deras utveckling och lyhördhet för behandling.
Under det senaste årtiondet har vi riktat flera aspekter av immunmodulerande aktiviteten hos HP-NAP, ett protein som produceras av bakterien Helicobacter pylori, som ursprungligen identifierats som kan främja endotel vidhäftning av polymorfonukleära celler (PMN) 7. Strukturellt tillhör HP-NAP till DNA-skyddande protein under utsvultna förhållanden (DPS) familj 8 och består av 12 identiska subenheter arrangerade i en dodecameric skal.
Vi har visat att HP-NAP ären Toll-liknande receptor (TLR) 2-agonist, med ett starkt immunmodulerande aktivitet är ansvarig för drivning av differentieringen av T-lymfocyter mot Th1-fenotypen, både in vitro och in vivo 9-10. I samband med denna verksamhet, är HP-NAP kan omdirigera Th2 immunsvar i mer fördelaktigt Th1 svar i en musmodell av allergisk astma 11.
För att utvärdera Th1-beroende antitumörpotential HP-NAP, vi drog fördel av en musmodell av cancer i urinblåsan utvecklat flera år sedan av O'Donnel och kollegor 12 för att utvärdera effekterna av BCG administrationen.
Med detta protokoll, vi visar att HP-NAP har en stark antitumörpotential mot cancer i urinblåsan och att effekten av HP-NAP administration parallellt med signifikant ackumulering, inom tumör och regionala lymfkörtlar, både Th1 och TC1-lymfocyter som producerar interferon ( IFN) -γ 13
Denna rapport ger en stepbystep protokoll, med uppgifter om beredningen av djuren, deras urinrörets kateterisering, den kemiska förbränningen krävs för att fästa celler till urinblåsan slemhinnan, och injektion av tumörcellerna. Vi beskriver även topisk administration av HP-NAP som kan anses som en prototyp av eventuella terapeutiska medel som utvecklats för behandling av cancer i urinblåsan. Det bevis som erhållits genom att jämföra tumörer isolerade från kontroll och HP-NAP-behandlade djur betonar inte bara det faktum att HP-NAP kan vara en bra kandidat för cancer i urinblåsan immunterapi, men också den allmänna effektiviteten hos den experimentella inrättas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden för djurhantering har godkänts av det italienska hälsoministeriet (DM 204/2011-B).
1. Djur
- Väx C57BL6 / J honmöss till 8 veckors ålder i individuellt ventilerade burar med microisolation filter.
Not: Honorna är föredragna eftersom den anatomiska konformationen av deras yttre urogenitala apparaten gör kateterisering enklare än hos män.
2. Cellkultur
- Bibehåll mus uroteliala karcinomcellinjen MB49 i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 50 | ig / ml gentamicin vid 37 ° C i fuktad 5% CO2.
- Väx MB49-celler i T-75-kolvar till 80% konfluens. Trypsinisera och resuspendera vid 0,5 x 10 5-0,5 x 10 6 celler per 150 pl PBS före implantering i möss.
3. Intravesikal Tumörimplantat
- Söva möss med användning av en blandning av anestetika zoletil och xylor (33 mg / kg och 20 mg / kg, respektive), injicerades intraperitonealt.
- Placera djur i ryggläge och fixera bakbenen på dynan med tejp. Tassar måste vara tillräckligt separerade för att göra urinrörsmynningen väl synlig och lättillgänglig för införandet av katetern.
- Obs: För kateterisering, är en 24 G pediatrisk venkateter lämplig för 8 till 10 veckor gamla möss. Valet av katetern är mycket viktigt för att undvika läckage av vätska mellan urinrörsväggen och katetem. Större borr katetrar måste användas för större eller äldre möss.
- Med hjälp av en liten avbitartång, nyp en kant av den yttre delen av urinröret och vrid den mycket svagt mot "huvudänden" av mössen. Denna åtgärd exponerar urinrörsmynningen.
- Avlägsna den inre nålen av katetern och för in den senare i urinröret med en vinkel på 45 °, något orienteradmot "slutände" av mössen. Tvinga inte ingången till katetern; i fall av resistens, bara vrida katetern mycket försiktigt, tills den glider inne i urinröret. När ca 0,5-0,8 cm av katetern i urinröret, försiktigt placera katetern parallellt med svansen på möss och för in den helt.
- Med användning av en 1 ml spruta, vars nål måste införas i katetern, tvätta blåsan från återstående urin genom att injicera 200-300 il steril PBS och aspirera all vätska från blåsan.
- Anmärkning: Vid injektion PBS, kommer blåsan fylla och en svallning kommer att vara synlig mellan bakbenen hos möss; detta bekräftar att kateterisering är korrekt. De flesta katetrar har en dödvolym som måste beaktas vid beräkningen av injektionsvolymen.
- Med en steril 1 ml spruta, injicera 200 ul av 0,1 N HCl. Fyll blåsan för att bränna hela dess vägg. Efter 10 sekunder, ta bort all syra och omedelbart neutralize genom att injicera 200 pl 0,1 N NaOH med en steril spruta. Vid injektion av det högsta antalet celler (0,5 x 10 6), är surgörningssteget inte nödvändig.
- Aspirera all den kvarvarande vätskan och omedelbart spola kaviteten med 300 | il av steril PBS.
- Tömma blåsan genom aspiration, och injicera 150 | il av PBS innehållande MB49-celler (intervall 0,5 x 10 5 till 0,5 x 10 6) in i urinblåsan. Låt sprutan sammansatt med katetern för att undvika läckage av celler. Det är bättre att säkra sprutan genom att fastställa den till dynan med tejp.
- Efter 1 timme försiktigt ut katetern från urinröret och placera mössen i buren under en glödlampa tills de vakna: detta sker vanligen mellan en och två timmar efter slutet av behandlingen.
4. Intravesikal Leverans av HP-NAP
- Obs: Minst 3 dagar efter cellinstillation, är det möjligt att påbörjabehandling.
- ANVÄNDA KATETER som beskrivs i steg från 3,1 till 3,4. I detta skede är det inte nödvändigt att bränna blåsväggen med HCl.
- Med användning av en 1 ml spruta, tvätta blåsan från återstående urin genom att injicera 200-300 il steril PBS och aspirera all vätska från blåsan.
- Injicera 50 ^ g av HP-NAP per 150 pl PBS i blåsan. Låt sprutan fäst vid katetern för att undvika läckage av proteinlösningen. Säkra sprutan genom att fastställa den till dynan med tejp.
- Efter 1 timme, försiktigt extrahera katetern från urinröret och placera möss i buren, under en glödlampa, tills de vaknar.
5. Tumör explants och Histologisk analys
- Vid slutet av behandlingen, offra djuren, placera dem i liggande lägen och fixera bakbenen på dynan med tejp.
- Med användning av en kirurgisk skalpell görs ett vertikalt snitt ungefär 1,52 cm lång genom huden och denbukhinnan, med början strax ovanför genitalier till "huvudänden" av mössen. För att minimera risken för skador på urinblåsan, särskilt uppmärksamma djupet på snittet.
- Blåsan kommer att placeras i mitten-vänster i snitt och tumören kommer att synas som en mörkrosa / lila massa. Vid sin excision, placera hela blåsa i en histologiska bur och fixa i 10% formalin innan inbäddning i paraffin.
- För histologiska och immun histokemisk analys, förbereda seriesnitt i urinblåsan (46 um tjocklek) med en vanlig mikrotom.
- Färga sektioner med hematoxylin / eosin och fortsätta med beräkningen av tumörstorlek (D xd 2) och bestämma andelen nekros per tvärsnittsarea med hjälp av en datorstödd bildanalys.
- För fartyg räkning, fortsätter genom färgning sektionerna för endotel markör CD31 / PECAM, med en vanlig immunoperoxidasteknik. Skanna sektionerna ent låg effekt (4 ×) för att identifiera området för högsta kärltäthet. Inom denna region, räkna enskilda mikrokärl i fem separata slumpmässiga fält vid hög effekt (20 ×).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar den kateterisering teknik; musen kateteriserades och ingjutit med 0,5 × 10 6 MB49 celler. Behandling med HP-NAP startas 3 dagar efter injektion av tumörceller, så att de kan fästa på blåsväggen och föröka sig. Alla djur som hör till kontrollgruppen utvecklar tumören; några av dem kan dö innan slutet av den 13 dagars period på grund av tilltäppning av urinröret.
Efter den första injektionen med HP-NAP, behandlas djuren var tredje dag, under totalt fyra injektioner. Vid slutet av försöket, vid dag tretton, avlivas djuren och blåsorna samlas in för histologiska och immun histokemisk analys. Såsom visas i fig 2A, är betydligt mindre än den för tumören i vehikelbehandlade möss (220 ± 62 mm 3 vs 830 ± 1 volymen av tumören inuti blåsan med HP-NAP-behandlade möss80 mm 3).
Intressant, medan i vehikelbehandlade djur tumören invaderar den underliggande fettvävnad, i 7 av de 8 HP-NAP-behandlade djuren tumören arvet rör blåsväggen (Figur 2B). Slutligen vaskulariteten reduceras och graden av nekros ökas i HP-NAP-behandlade möss, med avseende på kontrolldjur (fig 2B och C).
Figur 1. Möss kateterisering. Honmöss bedövas och kateter med hjälp av en 24 G steril kanyl. Den högra panelen är förstoringen av den svarta lådan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Antitumöraktivitet av HP-NAP. Möss, implanteras vid dag 0 med MB49-celler (0,5 x 10 6), behandlas med 50 | j, g av HP-NAP eller PBS (vehikel) på dagarna 3, 6, 9 och 12. Alla djur avlivas på dag 13. (A) representant histologisk analys av blåsor som isolerats från kontrollmöss och HP-NAP-behandlade djur och tumörvolymen kvantifiering. (B) Förstoring av sektionerna av panel A och andelen nekros i de två grupperna av djur. (C) resekterade blåsor, färgas för CD31 / PECAM; representativa sektioner från kontroll och HP-NAP-behandlade djur visas. Kvantifiering av mikrokärlstäthet (C, högra panelen); HPF, High Power fält. Data representerar medelvärde ± SD; n = 8 möss per grupp. Statistisk signifikans bestämdes genom Students t-test (** p <0,01). Figur modifierad från Codolo etal. 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Majoriteten av framsteg inom cancerterapi kräver tester i djurmodeller innan kliniska prövningar. Möjligheten att studera tumörbiologi in vivo, att dra nytta av djurmodeller, utgör ett viktigt verktyg för forskare som undersöker cancer patogenes, som gör det möjligt att bedöma olika behandlingsmetoder. Ortotopisk modeller förblir guldmyntfoten 14-15, både på grund av den enorma mängd cellinjer tillgängliga att inrätta en tumörmodell och eftersom de efterlikna miljön i naturligt förekommande tumör 16.
Dessutom inrätta orthotopic modeller av cancer i syngena möss, som beskrivs här, är särskilt relevant när det gäller studier som syftar till att undersöka nya terapeutiska strategier baserade på immunterapi, eftersom de senare inte är möjligt i immunbrist möss som genomgår xenoimplants.
Den metod som skildras i detta protokoll beskriver than kateterisering av en kvinnlig mus urinröret som tillåter både ympning av tumörceller och administration av läkemedel i urinblåsan hålrum.
Fördelen med prekonditionering blåsväggen genom en syrabrännskada (såsom beskrivits i detalj ovan, i stället för andra metoder, såsom användningen av trypsin eller poly-lysin), är att för att främja utvecklingen av stora och starkt invasiva tumörer. Tvärtom, konditionering med trypsin och poly-lysin, resulterar i mindre och mindre invasiva tumörer, förmodligen på grund av en skadlig effekt av rester av dessa ämnen på lönsamheten av tumörceller 17. Den frätskador är också företräde framför ett annat iordningställande system baserat på elektrisk kauterisation eftersom de senare kan leda till perforering av blåsväggen och spridning av tumören i bukhinnan 18.
Protokollet har optimerats för korttidsstudier (~ 13 dagar). Implantera proper antal celler är kritisk, eftersom en högre cellantal kommer att resultera i snabbare tumörtillväxt och eventuellt förlust av djur på grund av stor tumörbörda. Dessutom, tills användaren blir trygg med tekniken, det finns en viss risk i att skada urinröret eller urinblåsan, vilket orsakar död djuren. I vår erfarenhet, men om djuren är tillräckligt drivs (och därför inte dö under förfarandet), de lever utan att lida under hela experimenten (13 dagar). Dessutom, genom att minska antalet injicerade celler, är det möjligt att förlänga varaktigheten av experimenten.
Vi använde denna modell för att utvärdera antitumöraktiviteten hos proteinet HP-NAP produceras av Helicobacter pylori, med syfte att förbättra, och så småningom ersätta, det nuvarande terapi baserat på BCG med en ny en begåvad med en högre fördelarna / biverkningar förhållande. Mer generellt kan antas detta experimentella tillvägagångssätt i samtliga pre-Clinical utvärderingar som kräver avgivning av terapeutiska medel in i blåsan håligheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italienska ministeriet för universitet och forskning, prin projekt och Progetti di Ricerca di Ateneo bevilja N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo bevilja nr 2011-0485 till MdB, och Finanziamento Giovani Studiosi, universitetet i Padua, till Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
