Introduction
Blærekreft er en av de vanligste kreftformene i urogenitaltraktus, med nesten 75 000 nye tilfeller hvert år i USA 1. Høy forekomst av tilbakefall krever livslang oppfølging, noe som gjør blærekreft en av de dyreste formene for kreft på. Gullstandarden behandling for høyverdig NMIBC er trans-urethral reseksjon, etterfulgt av intravesikal immunterapi med BCG. Selv om den nøyaktige mekanisme av anti-tumor aktivitet av BCG er fortsatt ikke helt klarlagt, er det akseptert at aktivering av en celle-mediert immunrespons anriket på T-hjelpeceller (Th) og en cytotoksisk T (Tc) 1-celler er viktig for suksessen av terapien to.
Til tross for at BCG fortsatt behandling av valget for NMIBC, en høy andel av pasientene ikke responderer på behandlingen; Dessuten kan det føre til en rekke bivirkninger: ca. 70% av behandlede tumorer gjenoppstår etter noen tid og ~ 15% fremdriften til muskel-invasiv form avsykdom. Andre bivirkninger forbundet med BCG behandling omfatter dysuri, blærekatarr og nyreinfeksjon 3-6.
Utviklingen av nye terapeutiske strategier må ta hensyn til bruk av prekliniske modeller, etter innledende in vitro vurdering; Dette er særlig relevant i svulster som mikromiljøet i betydelig grad kan påvirke deres utvikling og respons på behandling.
I løpet av det siste tiåret har vi adressert flere aspekter av immunmodulerende aktivitet av HP-NAP, et protein som produseres av bakterien Helicobacter pylori, først identifisert som kan fremme endothelial vedheft av polymorfonukleære celler (PMN) 7. Strukturelt representerer HP-NAP til DNA-beskyttende proteinet under betingelser sultet (DPS) familie 8 og består av 12 identiske subenheter som er anordnet i en dodecameric skall.
Vi har vist at HP-NAP eren Toll-lignende reseptor (TLR) agonist 2, med en sterk immun-modulerende aktivitet er ansvarlig for å drive differensieringen av T-lymfocytter mot Th1 fenotype, både in vitro og in vivo 9-10. I kraft av denne aktiviteten, er HP-NAP i stand til å omdirigere Th2 immunrespons i det mer gunstig Th1 respons i en murine modell av allergisk astma 11.
For å evaluere Th1-avhengige anti-tumor potensialet i HP-NAP, vi tok fordel av en musemodell for blærekreft utviklet flere år siden av O'Donnel og kolleger 12 for å evaluere effekten av BCG administrasjonen.
Med denne protokollen, viser vi at HP-NAP har en sterk anti-tumor potensial mot blærekreft, og at effekten av HP-NAP administrasjon paralleller betydelig opphopning, innen kreft og regionale lymfeknuter, både Th1 og TC1 lymfocytter produserer Interferon ( IFN) -γ 13
Denne rapporten gir en stepbystep protokoll, med informasjon om fremstillingen av dyrene, deres urethral kateterisering, kjemisk brenning er nødvendig for å feste celler til blæren mucosa, og injeksjon av tumorcellene. Vi beskriver også topisk administrering av HP-NAP som kan betraktes som en prototype av eventuelle terapeutiske midler som er utviklet for behandling av blærekreft. Det oppnådde ved å sammenligne svulster isolert fra kontroll og HP-NAP-behandlede dyr bevis understreker ikke bare det faktum at HP-NAP kan være en god kandidat for blærekreft immunterapi, men også den generelle effektiviteten av den eksperimentelle oppstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene for dyr behandling har blitt godkjent av det italienske helsedepartementet (DM 204/2011-B).
1. Dyr
- Grow C57BL6 / J hunnmus til 8 ukers alder i individuelt ventilerte bur med microisolation filtre.
Note: Kvinner er foretrukket fordi den anatomiske konformasjon av deres ekstern uro-genital apparat gjengir kateterisering enklere enn hos menn.
2. Cell Culture
- Opprettholde mus uroteliale carcinoma cellelinje MB49 i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum og 50 pg / ml gentamicin ved 37 ° C i fuktet 5% CO2.
- Grow MB49 celler i T-75 kolber 80% samløpet. Trypsineres og resuspender på 0,5 × 10 5 til 0,5 × 10 6 celler per 150 mL PBS før implantasjon hos mus.
3. Intravesikal Tumor Implant
- Bedøve mus ved bruk av en blanding av bedøvelses zoletil og xylor (33 mg / kg og 20 mg / kg, henholdsvis), injisert intraperitonealt.
- Plasser dyr i liggende stilling og fikse bakbena til puten med scotch tape. Poter må bli tilstrekkelig separert til å gjengi urethral meatus godt synlig og lett tilgjengelig for innføring av kateteret.
- Merk: For kateterisering, er en 24 G pediatrisk venekateter egnet for 8 til 10 uker gamle mus. Valget av kateteret er svært viktig for å unngå lekkasje av væske mellom urinrørsveggen og kateteret. Større bore kateter må brukes for større eller eldre mus.
- Ved hjelp av en liten Nipper, klemme den ene kanten av ytre del av urinrøret og vri det veldig forsiktig mot "hodeenden" av mus. Denne handlingen avslører urethral meatus.
- Fjern den innvendige nål av kateteret og sette sistnevnte i urinrøret i en vinkel på 45 °, noe orientertmot "halen slutten" av mus. Ikke tving inngangen av kateter; i tilfelle av motstand, bare vri kateteret meget forsiktig, inntil det glir inne i urinrøret. Når omtrent 0,5 til 0,8 cm av kateteret i urinrøret, forsiktig kateteret parallelt med halen av musene og sette det helt.
- Ved hjelp av en 1 ml sprøyte, nål som må settes inn i kateteret, vask blæren fra resturin ved å injisere 200-300 ul steril PBS og Aspirer all væske fra blæren.
- Merk: Ved injeksjon PBS, vil blæren fylles opp, og en hevelse vil være synlig mellom bakbena av mus; Dette bekrefter at kateterisering er riktig. De fleste katetre har et dødvolum som må tas i betraktning ved beregning av injeksjonsvolumet.
- Ved hjelp av en steril 1 ml sprøyte, injisere 200 ul 0,1 N HCl. Fyll blæren for å brenne hele sin vegg. Etter 10 sek, fjern all syren og umiddelbart neutralize ved å injisere 200 ul 0,1 N NaOH med en steril sprøyte. Ved injeksjon av det høyeste antall celler (0,5 x 10 6), blir surgjøringstrinnet ikke nødvendig.
- Aspirer all gjenværende væske og umiddelbart skylle hulrom med 300 ul steril PBS.
- Tømme blæren ved aspirasjon, og injisere 150 ul PBS inneholdende MB49-celler (området 0,5 x 10 5 til 0,5 x 10 6) inn i blæren. La sprøyten montert til kateteret for å unngå lekkasje av celler. Det er bedre å sikre sprøyten ved å feste den til puten med scotch tape.
- Etter 1 time, forsiktig trekke kateteret fra urinrøret, og plassere mus i buret, under en glødelampe inntil de våkner: dette skjer vanligvis mellom 1 og 2 timer etter slutten av behandlingen.
4. Intravesikal Levering av HP-NAP
- Merk: Minst tre dager etter celle drypping, er det mulig å begynnebehandling.
- Kateterisere som beskrevet i trinn 3.1 til 3.4. På dette stadium er det ikke nødvendig å brenne i blæreveggen med HCl.
- Ved hjelp av en 1 ml sprøyte, vask blæren fra resturin ved å injisere 200-300 ul steril PBS og Aspirer all væske fra blæren.
- Injiser 50 ug av HP-NAP per 150 ul PBS inn i blæren. La sprøyten er festet til kateteret for å unngå lekkasje av proteinløsningen. Fest sprøyten ved å feste den til puten med scotch tape.
- Etter 1 time, forsiktig trekke kateteret fra urinrøret og plasser mus i bur under en glødelampe, før de våkner.
5. Tumor eksplantater og Histologisk analyse
- På slutten av behandlingen, ofre dyr, plassere dem i liggende stilling og fikse bakbena til puten med scotch tape.
- Ved hjelp av en kirurgisk skalpell, gjør et vertikalt snitt omtrent 1,52 cm lang gjennom huden ogbukhinne, som starter like over ytre kjønnsorganene til "hodeenden" av mus. For å minimere risikoen for å skade blæren, være spesielt oppmerksom på dybden på kuttet.
- Blæren vil bli plassert i sentrum-venstre på kuttet og svulsten vil være synlig som en mørk rosa / fiolett masse. Ved sin excision, plasserer hele blæren i en histologisk bur og fikse i 10% bufret formalin før innstøping i parafin.
- For histologisk og histokjemisk immunanalyse, fremstille serielle seksjoner av blæren (46 um tykkelse) ved bruk av en standard mikrotom.
- Flekk seksjoner med hematoksylin / eosin og fortsette med beregning av tumorstørrelsen (D XD 2) og bestemmelse av prosentandelen av nekrose per tverrsnittsareal ved hjelp av et datamaskinassistert bildeanalysator.
- For fartøy telling, fortsetter ved farging seksjonene for endothelial markør CD31 / PECAM, ved hjelp av en standard immunoperoxidase teknikk. Skanne seksjonene ent lavt strømforbruk (4 ×) for å identifisere område av høyeste vaskulær tetthet. Innenfor denne regionen, telle individuelle microvessels i fem separate tilfeldige felt med høy effekt (20 ×).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser kateterisering teknikk; musen er kateteriseres og innpodet med 0,5 × 10 6 MB49 celler. Behandling med HP-NAP startes 3 dager etter injeksjon av kreftceller, for å gjøre dem i stand til å feste til blæreveggen og sprer. Alle dyrene som hører til kontrollgruppen utvikle tumoren; noen av dem kan dø før slutten av 13 dagers perioden på grunn av okklusjon av urinrøret.
Etter den første injeksjonen med HP-NAP blir dyrene behandlet hver tredje dag, for en total av fire injeksjoner. Ved slutten av eksperimentet på dag tretten, avlives dyrene, og blærene samlet for histologisk og histokjemisk immunanalyse. Som vist i figur 2A, er volumet av tumoren i blæren fra HP-NAP-behandlede mus betydelig mindre enn den for tumor av bærer-behandlede mus (220 ± 62 mm vs 3 830 ± 180 mm 3).
Interessant nok, mens det i vehikkelbehandlede dyr tumor invaderer den underliggende fettvevet, i 7 av de 8 HP-NAP-behandlede dyr svulst er begrenset innenfor blæreveggen (figur 2B). Til slutt blir redusert vaskularitet og omfanget av nekrose er økt i HP-NAP-behandlede mus, i forhold til kontrolldyr (figur 2B og C).
Figur 1. Mus kateterisering. Hunnmus bedøves og kateterisert anvendelse av en 24 G steril kanyle. Høyre panel er forstørrelsen av den svarte boksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Anti-tumor aktivitet av HP-NAP. Mus implantert på dag 0 med MB49-celler (0,5 x 10 6), blir behandlet med 50 ug av HP-NAP eller PBS (kjøretøy) på dagene 3, 6, 9 og 12. Alle dyrene drepes på dag 13. (A) Representative histologisk analyse på blærene isolert fra kontrollmus og HP-NAP-behandlede dyr, og tumorvolumet kvantifisering. (B) Forstørrelse av seksjonene i panel A og prosentandel av nekrose i de to gruppene av dyr. (C) resected blærer, farget for CD31 / PECAM; representative seksjoner fra kontroll og HP-NAP-behandlede dyr blir vist. Kvantifisering av microvessel tetthet (C, høyre panel); HPF, highpower felt. Data representerer middelverdi ± SD; n = 8 mus per gruppe. Statistisk signifikans ble bestemt ved Students t-test (** p <0,01). Figur modifisert fra Codolo etal. 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flertallet av fremskrittene i kreftbehandling krever tester i dyremodeller før kliniske studier. Muligheten for å studere tumorbiologi in vivo, drar nytte av dyremodeller, representerer et viktig verktøy for forskere som undersøkte kreft patogenesen, slik at vurderingen av ulike terapeutiske tilnærminger. Ortotopisk modell forbli gullstandarden 14-15, både på grunn av den enorme mengden av cellelinjer tilgjengelig for å sette opp en tumormodell, og fordi de etterligner miljøet av det naturlig forekommende 16 tumor.
Videre setter opp ortotopiske modeller av kreft i syngeniske mus, som beskrevet her, er spesielt relevant når det gjelder studier som tar sikte på å undersøke nye terapeutiske strategier basert på immunterapi, siden sistnevnte er ikke mulig i immunmangel mus som gjennomgår xenoimplants.
Metodikken avbildet i denne protokollen beskriver tHan kateterisering av et kvinnelig urinrør mus som tillater både inokulering av tumorceller, og administrering av terapeutiske midler inn i blæren hulrom.
Fordelen ved prekondisjonering blæreveggen gjennom en syre brenne (som beskrevet ovenfor, i stedet for andre metoder, som for eksempel bruk av trypsin eller poly-lysin), er det for å fremme utvikling av store og meget invasive tumorer. Tvert imot, prekondisjonering med trypsin og poly-lysin, resulterer i mindre og mindre invasive tumorer, sannsynligvis på grunn av en ugunstig effekt av rester av disse stoffene på levedyktigheten av tumorceller 17. Syren brenne er også foretrukket til en annen preconditioning system basert på elektrisk kauterisering fordi sistnevnte kan føre til perforering av blæreveggen og spredning av svulsten i peritoneum 18.
Protokollen er optimalisert for korttidsstudier (~ 13 dager). Implantering av prOper antall celler er kritisk, siden en høyere celleantall vil resultere i mer hurtig tumorvekst og eventuelt tap av dyr på grunn av stor tumorbyrde. Videre, inntil brukeren blir trygg med teknikken, er det en viss risiko i skade urinrøret eller urinblæren, og dermed forårsaker død av dyrene. Etter vår erfaring er imidlertid, hvis dyrene er tilstrekkelig drives (og således ikke dør under prosedyren), de lever uten lidelse for varigheten av forsøkene (13 dager). Videre, ved å redusere antall celler injisert, er det mulig å forlenge varigheten av forsøkene.
Vi brukte denne modellen for å evaluere den anti-tumor aktivitet av proteinet HP-NAP produseres av Helicobacter pylori, med det formål, å forbedre, og eventuelt erstatte dagens terapi basert på BCG med en ny utrustet med en høyere ytelser / bivirkninger forhold. Mer generelt kan dette eksperimentell tilnærming vedtas i alle pre-clinical evalueringer som krever levering av terapeutiske midler i blæren hulen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italienske departementet for universitet og forskning, PRIN prosjekter og Progetti di Ricerca di Ateneo, gi N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo, gi N ° 2011-0485 til MDB, og ved Finanziamento Giovani Studiosi, Universitetet i Padova, til Gaia Codolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
| MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
| RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
| Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
| Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
| Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
| Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
| Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
| Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
| 24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
| HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
| NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
| Equipment | |||
| Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
| Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
| Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
| Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System | |
References
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Cancerstatistics Jemal, A. CA Cancer J Clin. 64, 9-29 (2014).
- Saint, F., et al. Prognostic value of a T helper 1 urinary cytokine response after intravesical bacillus Calmette-Guerin treatment for superficial bladder cancer. J Urol. 167, 364-367 (2002).
- Shahin, O., Thalmann, G. N., Rentsch, C., Mazzucchelli, L., Studer, U. E. A retrospective analysis of 153 patients treated with or without intravesical bacillus Calmette-Guerin for primary stage T1 grade 3 bladder cancer: recurrence, progression and survival. J Urol. 169, 96-100 (2003).
- Lamm, D. L.
- De Jager, R., et al. Long-term complete remission in bladder carcinoma in situ with intravesical TICE bacillus Calmette Guerin. Overview analysis of six phase II clinical trials. Urology. 38, 507-513 (1991).
- Dovedi, S. J., Davies, B. R. Emerging targeted therapies for bladder cancer: a disease waiting for a drug. Cancer Metastasis Rev. 28, 355-367 (2009).
- Evans, D. J., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect Immun. 63, 2213-2220 (1995).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat Struct Biol. 5, 294-303 (1998).
- Amedei, A., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori promotes Th1 immune responses. J Clin Invest. 116, 1092-1101 (2006).
- Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe. Toxicon. 56, 1186-1192 (2010).
- Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori down-modulates Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell Microbiol. 10, 2355-2363 (2008).
- Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
- Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol Immunother. 61, 31-40 (2012).
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J Cell Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Loi, M., et al. The use of the orthotopic model to validate antivascular therapies for cancer. Int J Dev Biol. 55, 547-555 (2011).
- Miyazaki, K., et al. Preconditioning methods influence tumor property in an orthotopic bladder urothelial carcinoma rat model. Mol Clin Oncol. 2, 65-70 (2014).
- Horiguchi, Y., et al. Establishment of orthotopic mouse superficial bladder tumor model for studies on intravesical treatments. Hum Cell. 21, 57-63 (2008).
