Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm Published: May 9, 2015 doi: 10.3791/52746
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

Abstract

Üretim ve reaktif oksijen türlerinin detoksifikasyon arasındaki dengesizliğin sonucudur Oksidatif stres, kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, yaşlanma ve kanser gibi kronik insan bozuklukları, büyük bir katkıda bulunuyor. Bu nedenle, hücre sistemlerinde değil, aynı zamanda bütün organizmalar kullanılarak sadece oksidatif stres çalışma için önemlidir. C. elegans yüksek evrimsel korunmuş olan oksidatif stres sinyal iletim yollarının, genetiğinin incelemek için cazip bir model organizmadır.

Burada, biz C. oksidatif stres direnci ölçmek için bir protokol sağlamak sıvı içinde elegans. Bu tür paraquat (PQ) ve H2O 2 Kısaca, ROS-indükleyici reaktifler M9 tampon içinde çözülür ve çözeltiler 96 gözlü bir mikrotitre plakasının gözenekleri içinde bölünür. Senkronize L4 / genç yetişkin C. elegans hayvanlar oyuklara transfer edilir (5-8 hayvan / oyuk) ve hayatta kalma ölçülürher saat en fazla solucanlar ölene kadar. Verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilecek oksidatif stres üzerine hayvanların davranışlarını etkileyebilecek yaşlanma, plakalarda streslerinin düşük konsantrasyonu kullanılarak bir oksidatif stres direnci deneyi yaparken. Bununla birlikte, bu tarifnamede tarif edilen deneyde, bu sorun yalnızca L4 / genç yetişkin hayvanlar kullanılmaktadır çünkü pek mümkün değildir. Ayrıca, bu protokol, ucuz ve sonuçlar genetik ekranlar cazip bu teknik kılan bir gün içinde elde edilmektedir. Genel olarak, bu oksidatif stres ile ilişkili insan bozukluklarının daha iyi karakterizasyonu tercüme edilebilir oksidatif stres sinyal iletim yollarını, anlamanıza yardımcı olacaktır.

Introduction

Ökaryotlarda, mitokondri elektron taşıma zincirinde yer alan oksidatif fosforilasyon ATP şeklinde enerji üretimi temel sürücüdür. Reaktif oksijen türleri (ROS) Bu işlem doğal bir yan ürünü bulunmaktadır. Sinyal molekülleri olarak önemli bir rolü olmasına rağmen, aşırı ROS DNA hasarı protein karbonilasyonu ve lipid oksidasyonuna neden olabilir. ROS üretimi ve detoksifikasyon arasında bir dengesizlik enerji tükenmesi, hücresel hasara yol açan oksidatif strese neden olur ve hücre ölümünü 1,2 tetikler. Oksidatif stres, yaşlanma ve kanser, diyabet, kalp-damar ve nörodejeneratif hastalıklar 3-9 dahil olmak üzere birçok yaşamı tehdit eden hastalıkların gelişimine katkıda bulunur.

Hücreler uygun ROS düzeylerini korumak için ve oksidatif hasara karşı 1,2 bileşenlerinin korumak için enzimatik ve non-enzimatik savunma stratejilerini geliştirmişlerdir. Süperoksit dismutaz (SOD) enzim conve ilk hareketDaha sonra, katalaz veya peroksidaz enzimleri tarafından suya dönüştürülür H2O 2, RT süperoksit. Sigara enzimatik savunma stratejilerinin daha çok temel hücresel bileşenleri korumak makromoleküllerle, karşılaştırıldığında ROS ile daha hızlı reaksiyona molekülleri içerir. ROS enzimler detoks koruyucu rolüne rağmen, bazı ROS molekülleri antioksidan savunma mekanizmalarını kaçış ve oksidatif hasara yol açar. Algılama, onarım ve hasarlı hücre bileşenlerinin bozulması oksidatif strese 1,2 sırasında gerekli savunma stratejileri vardır.

Stres direnci ve özellikle oksidatif stres yer alan sinyal yolları çok evrimsel 10,11 muhafaza edilir. Organizma koşullar sadece kısmen çoğaltılmış hücre kültürü deneyleri, 12,13 büyük önem taşımaktadır model organizmaların oksidatif stresin çalışmanın aksine. C elegans cul kolay ve ucuz olabilir serbest yaşayan nematod olanAgar medya üzerinde bir bakteri çim tured. Küçük boyutta normal olarak (yaklaşık 1 mm uzunluğunda) ve genetik manipülasyonlar kolaylaştıran kendiliğinden gübre hermafrodit olarak büyür. Bu hızlı bir yaşam döngüsü ve yüksek üreme kapasitesine, nesilden başına yaklaşık 300 yavru üreten o büyük ölçekli genetik ekranlar 14 gerçekleştirmek için güçlü bir araç yapma vardır. C. C. elegans genomunun tam dizilenmiş ve genlerin% 40-50, insan hastalığı ile ilişkili genlerin 15-18 homologları olduğu tahmin edilmektedir. RNAi kullanılarak ilgi genlerinin yok etme, hızlı ve C kolay elegans. Gene aşağı düzenleme E. hayvan besleme ile elde edilebilir İlgi 19 mRNA hedef çift iplikçikli RNA eksprese eden bir plazmide E. coli bakterileri. Bu nedenle, büyük ölçekli RNAi ekranlarını kullanarak gen fonksiyonu belirlenmesi kanseri 20,21 dahil olmak üzere insan hastalıklarının anlaşılması üzerinde büyük etkisi vardır.

O çalışmalarıC. xidative stres direnci elegans oksidatif stres 13,22 direnç muhafaza mekanizmaları tanımlanmasına yol açmıştır. Belirlenen bazı yollar hipoksi, ısı ve ozmotik stres gibi diğer stresler yanı gibi uzun ömürlü ve direnci modüle ortak yollar vardır. Bu yollar, insülin sinyalizasyon, TOR sinyalizasyon ve Otofaji sayılabilir. Diğer önemli yollar gibi, ya da hasar onarım gibi ısı şoku proteinleri ve şaperon 11,13,22 olarak süperoksit dismutaz enzim ve katalaz enzimleri olarak ROS detoksifikasyon içerir.

Bu protokol C. oksidatif strese karşı direnci nasıl belirleneceği açıklanır sıvı içinde elegans. Daha önce C'de kaybı ortaya FLCN-1 (ok975) oksidatif strese karşı artmış bir direnç göstermiştir beri protokol göstermek için FLCN-1 (ok975) ve vahşi tip hayvanlara kullanılan elegans 23. Ayrıca, bu daha iyi direnç gösterme bağlı olduğunu göstermiştirAMPK ve Otofaji hücresel biyoenerjitiklerinin artırır ve gerilme direnci 23 teşvik eden bir sinyal ekseninde. PQ reaktif oksijen türleri 24 üretmek için elektron taşıma zinciri engelleyen bir oksidatif stres olduğunu. Aynı deney, adapte edilebilir ve ROS kaynakları veya ROS üreten bileşikler, H2O 2 ve rotenone gibi kullanılabilir. Benzer deneyler, PQ düşük konsantrasyonlarda 25,26 kullanılan plakalar üzerinde geliştirilmiştir. Bu deneyde avantajı çok hızlı ve sonuçlar bir gün içinde elde edilebilir olmasıdır. Buna ek olarak, 96 gözlü plakalar içinde oksidatif stres direnci deneyi gerçekleştirmek için kullanılan sıvının toplam hacmi PQ-ihtiva eden plakalar hazırlamak için kullanılır hacmi ile karşılaştırıldığında düşüktür. Bu nedenle, kullanılan PQ miktarı sıvı analizde ise ucuz tahlil işler ve zehirli atıkların üretimini sınırlayan, düşük. Bununla birlikte, levha tahlilleri ile karşılaştırıldığında bu analizde sınırlamaları la bulunmaktadırSıvı deneyde gıda ve sıvı oksijen daha düşük bir konsantrasyonda CK hava ile karşılaştırıldığında. Bunlar bazı durumlarda, sonuçlar etkileyebilecek önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bu tahlilde elde edilen sonuçlar desteklemek için tavsiye edilir, oksidatif stres direnci diğer yöntemlerle tekrarlanabilirlik teyit etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Reaktifler 1. Hazırlık

  1. C. medyanın hazırlanması (Bu durumda, vahşi tip hayvan ve FLCN-1 (ok975) mutant hayvanlarda) elegans büyümesi.
    1. Tris HCI ve 5.5 g Tris baz, 2.4 g, Bactopetone 31 g, NaCl 20 g ve kolesterol 0.08 g 'ını ihtiva Youngren tek Bacto-pepton (MYOB), kuru bir karışım Modifiye hazırlayın. Sallayarak iyice karıştırın.
      NOT: Bu karışım MYOB ortamı 10 L hazırlamak için yeterlidir.
      Not: normal büyüme ortamı (NGM) plakaları MYOB plakalar 27 yerine kullanılabilir. Bununla birlikte, plakaların aynı tip suşlar arasında bağımsız tekrarlar arasında geçerli bir karşılaştırması için kullanılmalıdır. Bu protokol, biz sadece MYOB plakaları kullanılır.
    2. MYOB kuru karışımın 6 g, agar 17 g eklenerek MYOB ortamı 1 L hazırlayın ve 122 ° C 'de 45 dakika süre ile H2O ve otoklav ile 1 L'ye tamamlanır. Plakaları dökün ve 2 gün boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
    3. Steril teknik kullanılarak, kültürlerdeki 100 ml'sini aşılamakE. LB sıvı ortamında yeniden E. coli OP50 bakteri ve 37 ° C 'de O / N büyür.
    4. E. Tohum MYOB plakaları E. coli OP50 bakterileri. 48 st için oda sıcaklığında büyümesi izin verin.
  2. RNAi kullanılarak gen baskılanması Hazırlık
    1. MYOB RNAi besleme tabak hazırlayın. Adımlar 1.1.1 ve 1.1.2 gibi devam edin. Otoklav sonra, ortam yaklaşık 55 ° C'ye kadar soğutulur ve eklemek için izin 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ve 100 mM ampisilin, 1 ml 1 mi.
    2. Streak E. E. coli HT115 kontrol EV veya agar plakaları ampisilin üzerinde FLCN-1 spesifik RNAi (50 ug / ml) / tetrasiklin (15 ug / ml) ya da ifade eden bir plazmid ile transforme edilmiş bakteriler. 37 ° C'de, kültür O / N büyütün.
    3. Koloniler seçin ve E. aşılamak E. coli HT115 kontrol EV ya da belirli bir RNAi 1 FLCN ve ya 37 ve # LB / ampisilin (50 ug / ml), orta ve O / N kültürünün yetiştirilmesi eksprese eden bir plazmid ile transforme edilen bakteri176 ° C.
    4. E. ile Tohum plakalar E. coli HT115 EV bakteri veya HT115 FLCN-1 RNAi bakteri.
      NOT: Kullanımdan önce oda sıcaklığında plakaları 48 saat tutun. Besleme RNAi demonte etkili ise, DS-RNA 28 teslim diğer yöntemleri kullanabilirsiniz.
  3. Parakuat (PQ) ile oksidatif stres oluşturma:
    1. PO 4 KH 2, 3 g karıştırılarak M9 tampon hazırlanması, Na 2 6 g HPO 4, 5 g NaCI ve MgSO 4 0.25 g · 7 H2O Damıtılmış su ile 1 L'ye getirin. Oda sıcaklığında 122 ° C ve mağaza şişe 45 dakika süreyle otoklavlanmaktadır çözeltisi.
    2. Analiz gününde, M9 / PQ-içeren solüsyon hazırlanır. (M9 4 ml tampon içinde eritildi PQ 0,1028 g oyuk başına M9 / PQ 40 ul ile bütün bir 96 gözlü plakalar doldurur) Bu protokol için, 100 mM PQ kullanın.
      DİKKAT: PQ tehlikeli ve son derece toksik bir bileşiktir. Uygun kurallarına göre işlemek.
      NOT: İlk yeni s çalışanTren veya yeni bir durum, bu 7-10 saat içinde hayvanları öldürmek için kullanılacak en iyi konsantrasyonunu belirlemek için PQ artan konsantrasyonları hayatta kalma tahlil için tavsiye edilir.

Yaş senkronize L4 Nüfus 2. Hazırlık

  1. E. ile seribaşı taze MYOB plaka Transferi 20 gebe yetişkin çift cinsiyetli E. coli OP50 bakterileri. Tahlil sırasında gerekli solucanlar sayısına dayalı birkaç tabak hazırlayın.
  2. Onları 6 saat sonra anneleri kaldırmak platin tel solucan kıracağı kullanarak yumurtalarını bırakmak için izin verin. Bıraktıkları yumurta sayısını değerlendirmek için mikroskop altında plakaları kontrol edin.
  3. Yumurtaların açılması ve 48 saat boyunca 20 ° C'de büyümeye izin verin. Bu zamanda, hayvanlar, bir geç L4 / genç yetişkin aşamasındadır. Aynı sahne hayvanları seçin ve PQ çözüm içeren kuyulara aktarın.
    NOT: 48 saat inkübasyon, sadece yabani tipte hayvanlara benzer şekilde büyümeye mutantlar için geçerli olduğundan, bu gelişim takip etmek önemlidirYeni test mutantların oranı, vahşi tip gelişme hızına aksi halde, başka bir zaman çizgisi kullanılmalıdır uygun sağlamak.
  4. Alternatif olarak, senkronizasyon tekniklerini kullanın. Hipoklorit çözeltisi kullanılarak L1 larvalarının solucanların senkronize popülasyonunu üretmek (25 ml su,% 5.25 sodyum hipoklorit 125 mi, 4 M NaOH, 50 ml, ışıktan izole etmek için alüminyum folyo ile bir şişe sarın). Yoğun bir ağartıcı tahlil sırasında hayvan davranışını etkiler olabilir Bununla birlikte, bu deney için, bu, tavsiye edilmez.
    DİKKAT: kurallarına göre hipoklorit solüsyonu tutun.
    Not: aşağı ilgilenilen geni düzenleyen özel RNAi bakteri ile ekim yapılmış RNAi plakalara annelerin transferi hariç olmak üzere, bölüm 2'de tarif edildiği gibi çift cinsiyetli eşitlemeye RNAi kullanırken. RNAi ile demonte zayıf olduğunda, birden nesiller için beslenme tavsiye edilir.

3. Oksidatif Stres Direnci Deneyi <Sahne/ P>

  1. Pipet 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna (taze elde edilmiş) 100 mM PQ çözeltisi 40 ul. Her durumda (tedavi, mutant, vs.) replike olarak en az 12 kuyu kullanın. Bir platin tel solucan maşası kullanarak, her iyi başlangıç ​​ve bitiş zamanlarını gösteren 5-8 L4 larvaları hayvanları transfer.
  2. Başka bir koşul başlatırken, başlangıç ​​ve bitiş zamanlarını not edin. Başlangıç ​​zamanından itibaren bir saat sonra ölü hayvanları solucanlar aktarılması ve puanlama arasındaki inkübasyon süresi içinde 20 ° C'de plaka koyun.
  3. Diseksiyon mikroskobu kullanarak, hayatta kalma her saat saymak. Yavaşça saymak başlamadan önce plakayı sallayın. Ölü hayvanlar gibi, hatta yüksek yoğunluklu ışık lekelenme sonra, hareket etmeyen solucanlar belirtiniz. Ayrıca canlı hayvanların sayısını göstermektedir.
    NOT: Yüksek büyütmede solucan şekli, kuyrukları ve baş hareketi baktığımızda, diri ölü solucanlar belirlemeye yardımcı olur.
  4. En solucanlar ölene kadar bu adımı her saat tekrarlayın.
<p class = "jove_title"> 4. Every Time Point Survival Yüzde Belirlenmesi

  1. Iyi her transfer hayvanların toplam sayısı ekleyerek durum başına toplam hayvan sayısını hesaplayın. Hasarlı veya transfer etmesi halinde öldürülen hayvan geçiyoruz.
  2. Her zaman noktası için, (12 kuyuda ölü hayvanların toplamı) durumuna başına ölü hayvanların toplam sayısını hesaplamak. Her zaman noktası için, ve hayatta kalma (100 eksi yüzde ölümü) yüzdesi (ölü hayvanlar 100 ile hayvanların toplam sayısına bölünmesiyle ve çarpılır sayısı) ölüm yüzdesini hesaplar.
  3. Bu deney en az 3 bağımsız kez tekrarlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karşılaştırılması vahşi tip C. elegans FLCN-1 (ok975) mutant hayvanlar

Burada yabani tip C direncini belirlemek için 100 mM PQ kullanılan oksidatif stres, ısı ve anoksi 23 karşı gösterilmiştir FLCN-1 (ok975) ile karşılaştırıldığında elegans hayvanlar. Tedavi 4 saat, yabani tip% 48.3 sonra hayatta olarak FLCN-1 (ok975) hayvanlarda% 77.8 hayatta kalma ile karşılaştırıldığında. Beklendiği gibi, FLCN-1 (ok975) mutant hayvanlar yabani tip (Şekil 2 ve Tablo 1) ile karşılaştırıldığında, 100 mM PQ daha dirençliydi.

Kontrol EV ile beslenen ya da FLCN-1 RNAi bakteri vahşi tip hayvanların karşılaştırılması

Kullanarak RNAi 100 mM PQ direnç artışı FLCN-1 düzenlenmesi aşağı önceki bölümde sunulan sonuç, benzer. Bu sonuç RNAi taklit kayıp fonksiyon-m kullanarak gen fonksiyonu aşağı regülasyonu gösteriyor utasyon (Şekil 2 ve Tablo 1).

Şekil 1
C. 96 oyuklu plakalar içinde oksidatif stres direnci belirlenmesi yöntemi Şekil 1 şematik olarak Şekil elegans.

MYOB plakalar üzerinde büyütülmüş ve E. coli OP50 bakteri ile beslenen Senkronize L4 / genç yetişkin hayvan 100 mM PQ ihtiva eden bir 96 yuvalı mikrotiter plakasının oyuklarına transfer edilir ve solucan çok sayıda ölene kadar hayatta kalma saatte ölçülmüştür. RNAi knockdowns durumunda, aynı prosedür senkronize hayvanlar IPTG ile takviye tabakalarına yetiştirilen takip edilir, ancak ve E ile beslenir tanımlanması üzerine hedef genin demonte olacak plazmid E. coli HT115 bakteri.

files / ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg "/>
C. oksidatif strese FLCN-1 artar direnç Şekil 2. Kaybı elegans. - kontrol hayvanları ile muamele edilebilir veya FLCN-1 RNAi ağırlıkça 100 mM PQ (A), ağırlık ve FLCN-1 (ok975) mutant hayvan ve (B) (A ve B), hayatta kalma yüzdesi.

Yüzde hayatta kalma 100 mM PQ için
1 saat Strain RNAi Yüzde Survival (± SD) P Değeri Deneylerin sayısı Solucanlar Sayısı
wt 82,38 ± 1,31 0.0002 3 210
FLCN-1 (ok975) 99,03 ± 1.67 3 224
ağırlıkla; kontrol 91,70 ± 0,55 0,0462 3 202
ağırlıkla; FLCN-1 (RNAi) 95,93 ± 2.48 3 207
2 saat Strain RNAi Yüzde Survival (± SD) P Değeri Deneylerin sayısı Solucanlar Sayısı
wt 72,13 ± 7.13 0.005 3 210
FLCN-1 (ok975) 96,33 ± 2.28 3 224
ağırlıkla; kontrol 80,27 ± 5,34 0,0261 3 202
ağırlıkla; FLCN-1 (RNAi) 91.23 ± 1.42 3 207
3 saat Strain RNAi Yüzde Survival (± SD) P Değeri Deneylerin sayısı Solucanlar Sayısı
wt 55.37 ± 4.72 0.0004 3 210
FLCN-1 (ok975) 87.00 ± 1.36 3 224
ağırlıkla; kontrol 70,77 ± 3.50 0.0027 3 202
ağırlıkla; FLCN-1 (RNAi) 87,63 ± 2.67 3 207
4 saat Strain RNAi Yüzde Survival (± SD) P Değeri Deneylerin sayısı Solucanlar Sayısı
wt 48,30 ± 6.39 0.002 3 210
FLCN-1 (ok975) 77,80 ± 3,12 3 224
ağırlıkla; kontrol 63,77 ± 0,66 0,0122 3 202
ağırlıkla; FLCN-1 (RNAi) 80,57 ± 6.68 3 207
5 saat Strain RNAi Yüzde Survival (± SD) P Değeri Deneylerin sayısı Solucanlar Sayısı
wt 41,60 ± 8.33 0.0062 3
FLCN-1 (ok975) 67,43 ± 1.42 3 224
ağırlıkla; kontrol 60.53 ± 2.58 0,0313 3 202
ağırlıkla; FLCN-1 (RNAi) 71,53 ± 5.24 3 207
6 saat Strain RNAi Yüzde Survival (± SD) P Değeri Deneylerin sayısı Solucanlar Sayısı
wt 34.86 ± 5.88 0.0021 3 210
FLCN-1 (ok975) 60,34 ± 2.05 3 224
ağırlıkla; kontrol 44.43 ± 3.93 0.0042 3 202
ağırlıkla; FLCN-1 (RNAi) 62.13 ± 3.44 3 207

Sonuçlar ve Şekil 2'den oksidatif stres direnci istatistiksel analizi Tablo 1. Özeti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans kolaylıkla kültürlenebilir yana in vivo genetik olarak oksidatif stres direnci çalışma için çekici bir model organizma ve hızlı bir şekilde genetik olarak özdeş yavruların çok sayıda yol açar. Oksidatif stres direncini ölçmek için birden çok yöntem, daha önce tarif edilmiştir ve böyle PQ, rotenone, H2O 2 ve juglon 25,26,29-32 gibi çeşitli ROS kaynakları ile kültür levhaları takviyesi dayanmaktadır. Burada 100 mM PQ kullanılarak 96 yuvalı plakalar içinde sıvı oksidatif stres direnci ölçen bir protokol açıklar. Benzer bir deney, Greer ve ark., 33 ile yapılmaktadır. Bu deney, daha başka bir ROS kaynaklarını kullanarak sıvı oksidatif stresi incelemek için adapte edilebilir. Örneğin, biz de 23 birkaç H 2 O 2 konsantrasyonlara FLCN-1 artar direnç kaybının göstermiştir.

Bu tahlil, teknik olabilirly hareketlilik kusurları ya da görüntülemek bazı suşlar için zorlu böyle dopamin taşıyıcısı dat-1 34 bir mutasyon taşıyan suşlar olarak felç fenotipleri yüzme kaynaklı. Bu durumda, hareket edememe mutlaka oksidatif stres direnci ziyade bir hareketlilik kusur azalma anlamına gelmez çünkü kafa karıştırıcı. Ayrıca, ölü hayvanların sayımı dikkatle tamamlanmış ve araştırmacılar C'ye dikkat etmeniz gerekiyor olmalıdır Böyle kuyruk hareketleri ve baş hareketleriyle, hatta yavaş vücut hareketleri olarak elegans davranışsal ayrıntılar. PQ konsantrasyonu çok yüksek olduğunu ve hayvanların ölüm kinetiği çok hızlı ise, bir yavaş ölüm oranlarını almak için PQ konsantrasyonunu azaltarak düşünebilirsiniz. Diğerleri gibi Daf-2 mutant hayvanlar 37 olarak son derece dayanıklı iken bazı hayvanlar gibi aak-2 mutant hayvanlar 26,33,35,36 olarak oksidatif strese karşı son derece duyarlıdır. Bu durumda, farklı co hayatta kalma tahlilPQ ncentrations dikkate alınmalıdır.

RNAi deneyleri için, olumsuz sonuçlar RNAi tedavinin verimsizlik nedeniyle olabilir. Bu durumda, mRNA seviyelerinin ölçümleri demonte gen başarılı olup olmadığını belirlemek için gereklidir.

Bu protokol daha C yüzme davranışını izler detektörü kullanılarak oksidatif stres direnci, yüksek miktarda madde taraması için uyarlanabilir Sıvı 38,39 yılında elegans. Bu potansiyel C. dayanıklılık izlenmesini sağlayacak elegans ve oksidatif stres altında eğilme vücudun sıklığı gibi yüzme davranışı. Vücut hareketlerinin daha yüksek oranlarda stres altında yüksek solucan uygunluk gösterebilir.

Düşük ökaryotlarda gerilme direnci oksidatif yol hazırlık yüksek evrim boyunca korunduğu ve oksidatif stres ile ilişkili hastalık ve insanlarda yaşlanmanın bağlantılıdır. Mitohormesis ve dengeli generatioROS n ömrünü uzatmak ve sağlık aralığını arttırmak için gereklidir. Ancak, aşırı ROS hücre, doku / organların ve organizmalara karşı son derece zararlıdır. Değişmiş ise, optimal bir denge ROS sağlamak, yollar bulmak ve böylece esastır ve oksidatif strese karşı direnci modüle ilaçların ekranlar ortak paydası ile birden hastalıkların tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir: oksidatif stres. C. bu gösterimleri gerçekleştirme elegans anlayış ve oksidatif strese bağlı insan hastalıklarının tedavisinde büyük bir potansiyele ve değeri vardır avantajlı, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz C. Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden kabul elegans suşları. Finansman desteği Terry Fox Araştırma Enstitüsü tarafından sağlandı. Biz de Rolande ve Marcel Gosselin Lisans Bursu ve McGill Entegre Kanser Araştırma Eğitim Programı kanser araştırma FRN53888 içinde CIHR / FRSQ eğitim hibe EP verilen destek için minnettarım.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar bacteriological grade Multicell 800-010-LG
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Sodium chloride biotechnology grade Bioshop 7647-14-5
Cholesterol Sigma C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride Invitrogen 15506-017
Tris aminomethane Bio Basic Canada Inc 77-86-1
IPTG Santa Cruz Biotechnology sc-202185A
Ampicillin Bioshop 69-52-3
Yeast extract Bio Basic Inc. 8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate Aldrich chemistry 856177-1G
Petri dish 60 x15 mm Fisher FB0875713A
Pipet 10 ml Fisher 1367520
Potassium phosphate monobasic G-Biosciences RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M-5921
Sodium phosphate dibasic Bioshop 7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source Ahringer Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
  2. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
  3. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  4. Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
  6. Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
  7. Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
  8. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
  9. Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
  10. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
  11. Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
  12. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
  13. Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
  14. Hope, I. A. Practical approach series. , Oxford University Press. 282 (1999).
  15. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  16. Ahringer, J. Turn to the worm! Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
  17. Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
  18. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
  19. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  20. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
  21. Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
  22. Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
  23. Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
  24. Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
  25. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
  26. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
  27. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  28. Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
  29. Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
  30. Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
  31. Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
  32. Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
  33. Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
  34. Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
  35. Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
  36. Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
  37. Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
  38. Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
  39. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 99 Oksidatif stres parakuat, Reaktif oksijen türleri organizma ölüm hayvan modeli nematod
Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Possik, E., Pause, A. Measuring… More

Possik, E., Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (99), e52746, doi:10.3791/52746 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter