Abstract
بالإضافة إلى أساليب راسخة مثل لطخة غربية، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة بسرعة وسهولة لتحديد الأمراض المرتبطة α-synuclein (αS D) في نماذج تجريبية من synucleopathies. خط الماوس المعدلة وراثيا (M83) الإفراط في التعبير عن αS A53T البشرية وعفوية تطوير النمط الظاهري السريرية مثيرة بين ثمانية و 22 شهرا من العمر، وتتميز الأعراض بما في ذلك فقدان الوزن، والسجود، وإعاقة حركية شديدة، وقد استخدم في هذه الدراسة. للالتحليلات الجزيئية من αS D (αS الأمراض المرتبطة) في هذه الفئران، وقد صمم لELISA لتحديد على وجه التحديد αS D في الفئران المريضة. وأظهر تحليل للنظام العصبي المركزي في هذا نموذج الفأر وجود αS D بشكل رئيسي في مناطق الدماغ الذيلية والحبل الشوكي. لم تكن هناك اختلافات في توزيع αS D بين ظروف تجريبية مختلفة مما يؤدي إلى المرض السريري، أي في uninoculATED والشيخوخة عادة الفئران المعدلة وراثيا والفئران الملقحة مع مقتطفات الدماغ من الفئران المريضة. كشف محدد من αS D مناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد Ser129 مفسفر αS بواسطة ELISA المترابطة في جوهرها مع أن حصلت عليها لطخة غربية والمناعية. بشكل غير متوقع، وقد لوحظت نتائج مماثلة مع العديد من الأجسام المضادة الأخرى ضد الجزء C من محطة αS. نشر αS D، مما يشير إلى تورط آلية "تشبه بريون"، وهكذا يمكن رصدها بسهولة وكميا في هذا النموذج الماوس باستخدام نهج ELISA.
Protocol
وكانت كافة الإجراءات والبروتوكولات التي تنطوي على الحيوانات وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 86/609 / EEC والتي صادقت عليها يأتي، اللجنة الوطنية الفرنسية للنظر في الأخلاق في التجارب على الحيوانات (بروتوكول 11-0043). وتم إيواء الحيوانات والرعاية في افق ANSES في مرافق التجريبية في ليون (موافقة B 69387 0801).
1. إعداد الفئران
- الموت ببطء الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من جرعة قاتلة من بنتوباربيتال الصوديوم.
- استرداد كامل الدماغ من الجمجمة الماوس ووضعه في 35 ملم البلاستيك طبق بيتري على الجليد حتى الاستخراج.
- استخراج النخاع الشوكي العنقي.
ملاحظة: αS استخراج إما من أحد نصفي الدماغ بعد باجتزاء سهمي أو من أدمغة فئران تشريح، متوفرة بعد التجارب المدرجة في الجدول 1.
| التجربهتي | الفئران اللقاح (أي ما يعادل الدماغ) | فترة البقاء على قيد الحياة (نقطة في البوصة) | متوسط / بقاء القصوى (الأيام الخوالي) | αS د الكشف عن طريق ELISA / WB / IHC |
| 1 | الفئران Uninoculated | 441 ± 166 | 419/736 | 08/08 |
| 2 | الفئران الملقحة (0.2 ملغم) | 150 ± 52 | 140/241 | 09/09 |
الجدول 1. قائمة من التجارب التي أجريت على الفئران M83. أجريت التطعيمات في 6 أسابيع لتجربة 2 في منطقة striato القشرية مع 20 ميكرولتر من جناسة دماغ الفأر المرضى (1٪ بالوزن / المجلد في الجلوكوز 5٪)، بعد التخدير من 6 أسابيع من العمر الفئران M83 متماثل بنسبة 3٪ استنشاق الأيزوفلورين. نقطة في البوصة: آخر أيام inoculأوجه.
2. αS استخراج من الدماغ الأنصاف
- قطع Sagittally الدماغ للحصول على نصفين. تزن كل شوط في أنبوب ribolysis تحتوي على كرات طحن.
- إعداد كبيرة من الملح (HS) العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 750 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA، 1 ملم DTT، 1٪ الفوسفاتيز ومثبط البروتياز الكوكتيل. إضافة العازلة عالية من الملح إلى نصفين الدماغ للحصول على 20٪ (وزن / حجم) الخليط.
- إعداد عينات من نصفي الدماغ باستخدام الخالط الميكانيكية في 6.0 م / ث لمدة 23 ثانية مرتين. بعد أول التجانس 23 ثانية، ووضع الأنابيب التي تحتوي على الخليط على الجليد لمدة 2 دقيقة قبل دورة 23 ثانية الثانية.
- الطرد المركزي العينات في 1000 x ج لمدة 5 دقائق للقضاء على شظايا الدماغ unground. استرداد supernatants، تقسم إلى 200 مكل والاحتفاظ بها في -80 ° C لتحليل ELISA لاحق.
3. αS استخراج من تشريح مناطق الدماغ
- تشريحالدماغ كله في 35 ملم البلاستيك طبق بيتري على الجليد مع انخفاض المكبر الطاقة (8X التكبير) باستخدام اثنين من forcipes التي يتم الاحتفاظ بها معا إلا عند تشريح الحصين الغايات. لا تتجاوز 10 دقيقة للحفاظ على سلامة الدماغ. وضع الدماغ الجانب الأيمن حتى واسترداد مناطق الدماغ التالية في هذا النظام:
- مستقل واحد من اثنين بصيلات الشم باستخدام ملقط وضعت للتو وراء لمبة. سلخه من الدماغ عن طريق حركة إلى الأسفل. كرر هذه العملية لمبة الثانية.
- إسفين بلطف ملقط في فترة ما بين اللحاء اثنين وتحريكه إلى الأمام لتسهيل التفكك من اللحاء اثنين. الحفاظ على الدماغ في مكان واحد مع ملقط، واستخدام آخر لفصل القشرة من الحصين.
- وضع ملقط 2 ملم تحت القشرة. الحفاظ على ضغط لطيف على ملقط حتى الجزء العلوي من الحصين مرئيا. تقشر الجزء الأول من القشرة، وكرر مع الجزء الثاني. استخدام ملقط لفصل اللحاء اثنينابتداء من الساعة الحصين وتتحرك نحو الجزء الأمامي من الدماغ.
- وضع ملقط مفتوحة حول واحدة من الحصين. إغلاق ملقط في الجزء السفلي من الحصين ثم إزالة برفق، واستعادة قدر الإمكان. كرر الإجراء الحصين الثاني.
- وضع ملقط مفتوحة أقل من واحد من مخططية وفصل برفق من الدماغ. استخدام ملقط لإزالة أي القشرة المتبقية من المخطط. كرر هذا الإجراء المخطط الثاني.
- استخدام ملقط لخفض بلطف 2 مم كفاف من المخيخ لتسهيل فصل المخيخ من المخ. وضع ملقط خلف المخيخ وإزالته عن طريق تحريك ملقط إلى الأمام.
- استخدام جزء واسع من ملقط لرفع الدماغ المتوسط من أجل أن نرى بوضوح حيث ينضم جذع الدماغ. جعل شق عمودي عند تقاطع ثم إزالة جذع الدماغ.
- وضع ملقط وراء الدماغ المتوسط، وهو ماق تتألف من أربعة مبان مدورة. شق عموديا حتى تم فصل الدماغ المتوسط تماما من الدماغ المتبقية.
- إعداد الخليط من متغير٪ (وزن / حجم) في المخزن HS، اعتمادا على كمية من الأنسجة المتاحة، أي 5٪ جناسة لوزن ما بين 10 و 30 ملغ، 10٪ لوزن ما بين 30 و 80 ملغ، و 20٪ لوزن فوق 80 ملغ.
- إضافة حجم مناسب من العازلة HS إلى مناطق الدماغ تشريح للحصول على٪ المتوقعة من جناسة.
- دوامة وتأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما في المنطقة العازلة HS.
- التجانس عينات أعدت من مناطق الدماغ تشريح أو الحبل الشوكي العنقي مع طاحونة الأنسجة تتكون من أنبوب زجاجي البورسليكات واثنين من المطاحن، A و B.
- صب كل منطقة في الدماغ لابد من سحقهم مباشرة في أنبوب. إدراج مدقة A في أنبوب وسحب عليه. كرر هذه الحركة عن عشر مرات لفصل الأنسجة. ثم استخدام مدقة B إلى Continue طحن الأنسجة مع 20 حركات أخرى. نقل الخليط في أنبوب 1.5 مل مع ماصة نقل 1 مل.
- الطرد المركزي العينات في 1000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للقضاء على أي شظايا الدماغ unground. استرداد supernatants، تفرق بينهم ما يصل إلى 200 مكل والاحتفاظ بها في -80 ° C لتحليل ELISA لاحق.
4. الكشف عن αS بواسطة ELISA
- تمييع الأجسام المضادة طلاء إلى 0.01 نانوغرام / مل. استخدام إما معاداة αS بولكلونل الأرنب أو وحيدة النسيلة استنساخ 42 الأجسام المضادة في 50 ملي نا 2 CO 3 / NaHCO 3 العازلة (درجة الحموضة 9.6).
- معطف ال 96 جيدا microplates مع 100 ميكرولتر لكل بئر من هذا الحل طلاء، وترك في 4 درجات CO / N. استخدام مكافحة αS الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة في حل طلاء للELISAs باستخدام الأجسام المضادة كشف syn514، استنساخ 42، LB509، AS11، 4D6 أو 8A5. استخدام مكافحة αS وحيدة النسيلة الأجسام المضادة استنساخ 42 كحل طلاءجنبا الى جنب مع مكافحة pSer129 αS الكشف عن الأجسام المضادة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن أبقى لوحات في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد قبل ELISA يتم تنفيذ. - استخدام لوحة غسالة لغسل الصحون خمس مرات مع 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة مع 0.05٪ توين 20 (PBST) لكل بئر. من هذه الخطوة فصاعدا، الحضانة في RT.
- إضافة 200 ميكرولتر من T20 PBS عازلة تمنع لكل بئر. يهز لمدة 1 ساعة على 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
- تمييع الخليط الدماغ (التخفيف 1: 100 من 20٪ من الخليط، 01:50 من٪ 10 من الخليط و1:25 من 5٪ من الخليط في PBST BSA 1٪)، وإضافة 100 ميكرولتر إلى كل بئر. ثم احتضان لمدة 2 ساعة في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
- إضافة مختلف الأجسام المضادة كشف αS في PBST مع BSA 1٪ في التخفيفات المذكورة في قائمة المواد. احتضان لمدة 1 ساعة على 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
- إضافة إما المضادة-mouse أو المضادة للأرنب تقارن مفتش HRP المخفف 1: 8000 في PBST تستكمل مع جيش صرب البوسنة 1٪ لمدة 1 ساعة في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. تغسل الصحون خمس مرات مع PBST.
- إضافة 100 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) حل كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام بينما تهتز في 150 دورة في الدقيقة.
- وقف رد فعل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك لكل بئر ثم قياس الامتصاصية في 450 نانومتر مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية.
- لتحليل البيانات، طرح قيمة OD الحصول عليها في بئر مع جميع الكواشف باستثناء أي عينات مخ الفأر (جيد فارغة) من القيم OD قياس لكل من العينات التي تم تحليلها.
5. حاتمة رسم الخرائط
- أداء رسم الخرائط حاتمة وفقا للطريقة التي وصفها عثمان 16. لفترة وجيزة، والببتيدات بقعة من سلسلة α-synuclein الإنسان تحتوي على 12 الأحماض الأمينية على نتروسليلوز مع 10 الأحماض الأمينية متداخلة.
- منع مع 50 ملي تريس / 150 ملي كلوريد الصوديوم درجة الحموضة عازلة 10 تحتوي على 0.05٪ توين 20 و 5٪ مسحوق الحليب. احتضان الأجسام المضادة في عرقلة الحل بتركيز 2 ميكروغرام الأجسام المضادة لكل مل في 2-10 درجة CO / N.
- يغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام 50 ملي تريس / 150 ملي كلوريد الصوديوم العازلة درجة الحموضة التي تحتوي على 10 0.05٪ توين 20. احتضان مع الماعز المضادة للماوس مفتش HRP المترافقة. غسل غشاء خمس مرات أخرى باستخدام نفس المخزن ثم يلون باستخدام وصمة عار TMB عدة تلطيخ الغربية.
6. التحليل الإحصائي
- استخدام البرنامج R وnlme حزمة لأداء آثار مختلطة انحدارات لنموذج OD. لكل المقارنة، نفذ نموذج الأثر الانحدار مختلطة. استخدام الأثر الثابت للتمييز أعراض من مجموعة أعراض.
- استخدام تأثير عشوائي لتعكس التغير في تكرار للماوس معين. تحقق متماثل التفاوت عن طريق فحص المخلفات وإذا لزم الأمر، استخدام وظائف التباين في تصميم نموذج لهيكل الفرق من أخطاء داخل المجموعة وذلك تمشيا مع بينيرو وبيتس 17 اضبط 0.05 كعتبة أهمية P.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، وELISAs استخدام التعرف على وجه التحديد αS الأمراض المرتبطة (αS D) في الخليط الدماغ أعدت في منطقة عازلة عالية من الملح من الفئران المريضة M83. استخدام أجسام مضادة الاعتراف تحديدا pSer129 αS (ع = 0.0074)، وELISA يميز بسهولة القديمة والفئران المريضة (> 8 أشهر من العمر) من الشباب (2-5 أشهر من العمر)، M83 الفئران السليمة (الشكل 1). وأظهرت عدة أجسام أخرى إشارات عالية بالمثل (0.6> OD) فقط في الخليط الدماغ من الفئران المريضة. هذا هو الحال بالنسبة ل4D6 (ع = 0.01)، LB509 (ع = 0.0047) و8A5 (P <0.001) ضد سلاسل مختلفة من الجزء C-محطة من البروتين (124-134، 115-122، 129-140 و على التوالي)، وإلى حد أقل بكثير، syn514 ضد نهاية N-الطرفية (12/2) من البروتين (P = 0.0003). وعلاوة على ذلك، فإن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة AS11 إنتاجها في المختبر لدينا ضد αS الإنسان ييفي المؤتلف 18 بعد تحصين C57BL / 6S (B6 αS-فارغة) 19الفئران مع حذف موضع α-اصطناعي، أظهر إشارات عالية على نحو مماثل (P <0.01) فقط في الخليط الدماغ من الفئران المريضة. وقد تم الآن أظهرت هذه الأجسام المضادة للتعرف على التسلسل (P) VDPDNEAY الأحماض الأمينية (E) من αS، المقابلة لتسلسل 118-125 من البشر α-synuclein.
في المقابل، في ظل هذه الظروف التجريبية، تحليل الخليط الدماغ مع الكشف عن الأجسام المضادة استنساخ 42 موجه ضد المنطقة الوسطى من α-synuclein (91-96 تسلسل)، وأظهرت إشارة منخفضة للغاية لكل من الفئران M83 المرضى والأصحاء. لا يمكن أن نميز السكان اثنين من الفئران (ع = 0.1158). ومع ذلك أظهرت الفئران M83 شابة مناعية أعلى مما كانت الفئران المعدلة وراثيا غير B6C3H (M83 خط خلفية وراثية). كان التباين أكبر مع C57BL / 6S (B6 αS-فارغة) الفئران، التي لديها حذف موضع α-اصطناعي. هذا يشير إلى أن مناعية طفيف في الفئران M83 يتوافق مع انخفاض الكشف عن إشارة من αS وضعها الطبيعي. وعلىتم تقييم حساسية nalytical هذا ELISA في مقارنة لالمذكورة سابقا طريقة لطخة غربية 4 للكشف عن غير قابلة للذوبان Ser129 مفسفر α-synuclein، من خلال دراسة، باستخدام كل ELISA وطرق طخة غربية، التخفيفات المسلسل من الخليط الدماغ أعدت من نفس المرضى M83 مخ الفأر (الشكل 2). وكانت تقريبية 10 ميكروغرام مكافئات الدماغ كافية للحصول على إشارة إيجابية ELISA لجناسة الدماغ من هذا الفأر المرضى، مع كل LB509 والأجسام المضادة PSer129. على العكس من ذلك، كانت هناك حاجة لا يقل عن 200 ميكروغرام في حكمه الدماغ للكشف عن pSer129 αS في جزء-sarkosyl غير قابلة للذوبان تحليلها من قبل لطخة غربية باستخدام نفس PSer129 الأجسام المضادة 15. هذا يدل على أن ELISA لديه حساسية تحليلية حوالي 20 مرات من طريقة لطخة غربية.
في المرضى والقدامى M83 الفئران (الشكل 3A)، الخليط الدماغ من الدماغ المتوسط، جذع الدماغ والحبل الشوكي SHO تميز الأربعاء مناعية مع كل LB509 والأجسام المضادة PSer129 في ELISA. ومع ذلك، لم يلاحظ أي مناعية كشفها في مناطق أخرى من الدماغ، بما في ذلك البصلة الشمية، قشرة المخ، المخطط، الحصين، المهاد وتحت المهاد. أعطى ELISA إشارة باهتة لالمخيخ. كان مناعية في مناطق الدماغ المختلفة من الفئران M83 تطوير المرض السريري متسارع بعد الحقن لاستخراج المخ من المرضى M83 الماوس 4 (الشكل 3B) يمكن تمييزه عن ما تشهده الذين تتراوح أعمارهم بين (> 8 أشهر من العمر) uninoculated الفئران M83. هذه النتائج متسقة تماما مع تلك التي حصلت عليها لطخة غربية (الشكل 3C) والمناعية 15، مما يدل على ترسيب أكبر بكثير من Ser129 α-synuclein في المناطق الذيلية من الدماغ والحبل الشوكي.
/52752/52752fig1highres.jpg "العرض =" 700 "/>
الشكل 1. الكشف عن ELISA من الأمراض المرتبطة α-synuclein (αS D) في الخليط الدماغ كله من الفئران M83. إليسا الجمع بين الأرنب مكافحة αS بولكلونل (الطلاء) مع syn514، LB509، AS11، 4D6، 8A5 (الكشف) أو استنساخ 42 (الطلاء) مع anti-pSer129 αS (PSer129) (كشف) الأجسام المضادة تميز الفئران المرضى من الفئران M83 صحية، في حين ELISA مع anti-αS الأرنب بولكلونل (الطلاء) / clone42 (كشف) لا. أظهرت ستة المريضة والفئران M83 القديمة الذين تتراوح أعمارهم بين 11-16 شهرا علامات مناعية مع الأجسام المضادة SYN α المضادة (باستثناء استنساخ 42 الضد). لم يكن هذا هو الحال بالنسبة إما ستة من الشباب، الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران السليمة 2-5 أشهر من العمر، أو مع عناصر تحكم إضافية بما في ذلك B6C3H (الخلفية الوراثية للفئران M83) أو αS فارغة B6 الفئران. أشرطة الخطأ تمثل SD معدلة من Bétemps 15.
الشكل 2. مقارنة بين حساسية تحليلية للكشف عن αS D بواسطة ELISA وصمة عار الغربية. A. تم الحصول على إشارة إيجابية مع ELISA 12.5 ميكروغرام مكافئات الدماغ مع كل LB509 والأجسام المضادة PSer129 من التخفيفات شقين من الخليط الدماغ من المرضى الماوس. مستوى قطع التقديرية للتمييز من الفئران السليمة والمريضة، الموافق الوسائل التي تم الحصول عليها من عينات من الفئران M83 صحية خلال 3-6 يكرر من ELISA التدابير + 3 الانحرافات المعيارية، وكان 0.030 و0.020 لLB509 والأجسام المضادة كشف PSer129 على التوالي . وهي تظهر على شكل خط في نفس اللون الذي استعمل لكل من الأجسام المضادة. B. بواسطة تحليل لطخة غربية من الكسور غير القابلة للذوبان التي تم الحصول عليها بعد تنبيذ فائق في حاضرام من sarkosyl، وهناك حاجة إلى 200 ميكروغرام مكافئات الدماغ للكشف عن αS D بنفس PSer129 الأجسام المضادة. يشار إلى الواسمات الجزيئية الوزن (كيلو دالتون في) على الجهة اليسرى من لطخة. أعيد طبعها بإذن من Bétemps 15.
الرقم 3. الكشف عن الأمراض المرتبطة α-synuclein (αS D) في مناطق الدماغ المختلفة من الفئران M83 من قبل ELISA وصمة عار الغربية. حددت ELISA αS D مع PSer129 أو LB509 الأجسام المضادة كشف في الفئران M83 خلال الشيخوخة الطبيعية (A) (ن = 1، 4 تكرارات، يعني ± SD) أو بعد تلقيح الفئران M83 القديمة أسابيع 6 مع جناسة الدماغ من M83 المرضى ( B) (ن = 1، 4 تكرارات، يعني ± SD). وقد تم تحديد (C) αS D التي كتبها Wوصمة عار estern مع الأجسام المضادة EP1536Y كشف PSer129 في المناطق العصبية التشريحية نفسها في الفئران الملقحة مع جناسة الدماغ من المرضى M83 الماوس. يشار إلى الواسمات الجزيئية الوزن (كيلو دالتون في) على الجهة اليسرى من لوحة C. استخدمت كميات متساوية من البروتين الكلي في كل سطر لتحميل مماثل على هلام. تم اختبار ثماني مناطق العصبية التشريحية التالية من الفئران المريضة M83: OB: لمبة الشمية، معادل: القشرة الدماغية، مرحبا: الحصين، وسانت: المخطط، لي: الدماغ المتوسط، البنك التجاري: المخيخ، BS: جذع الدماغ، SC: الحبل الشوكي العنقي . تعديل من Bétemps 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تجلى استخدام وسيلة ELISA للكشف على وجه التحديد αS D مباشرة من الخليط الماوس الدماغ أثناء المرض في M83 نموذج الفأر المعدل وراثيا. والحقيقة أن هذا ELISA التمييز بسهولة الفئران M83 المريضة من الفئران M83 صحية باستخدام الخليط الدماغ بالكامل فقط في المخزن عالية من الملح.
أهم الخطوات لتحقيق نتائج ناجحة باستخدام هذه ELISA هي: تشريح مناطق مختلفة من أدمغة فئران بشكل صحيح من خلال تطوير ما يلزم من البراعة اليدوية لمنع الضرر أثناء تشريح. أداء التخفيفات عينة حصرا في المخزن HS؛ واختيار من الأجسام المضادة، لأن ليس كل الأجسام المضادة ستعمل في شكل ELISA.
وكان بعض التباين في مستويات αS D مع ذلك واضحا بين الفئران مختلفة. هذه النتائج هي معادلة لكشف طخة غربية من نمط αS D نموذجي الكشف فقط في الفئران M83 المرضى عن طريق الفحص للسارككسور-osyl غير قابلة للذوبان بعد الكشف مع الأجسام المضادة ضد Ser129 مفسفر αS 15. هذا يدل على أن ELISA مناعية يتوافق مع كشف محدد من αS D.
في اتفاق مع لطخة غربية السابقة يحلل 15، الكشف عن هذه ELISA مناعية بعد تشريح دماغ الفئران M83 المريضة في الأجزاء الذيلية من الدماغ، أي الدماغ المتوسط وجذع الدماغ، وكذلك في الحبل الشوكي العنقي. تم الكشف عن أي مناعية في البصلة الشمية، قشرة المخ، أو المخطط الحصين، بما يتفق مع البيانات السابقة تشير إلى أن الحصين كان يدخر من عملية المرضية 6، ما لم المستويات المنخفضة جدا في حالة الفئران التي تم تلقيح بواسطة ألفا ييفي -synuclein في الحصين 15. توزيع αS D بالتالي يبدو مهما كانت الظروف التجريبية الشاملة موحدة بشكل ملحوظ، مما المؤتمر الوطني العراقيluded إما الشيخوخة الطبيعية من الفئران أو تسارع تطور المرض بعد التلقيح داخل دماغي من الخليط الدماغ من الفئران المريضة M83.
وعلاوة على ذلك، أداء الاختبار هو أفضل من طريقة لطخة غربية سبق وصفها. حساسية تحليلية لELISA ظهرت أعلى، كما هو مبين في حدود الكشف تم الحصول عليها في هذا الاختبار باستخدام التخفيفات المسلسل من جناسة الدماغ من M83 الماوس المرضى (12.5 ميكروغرام للELISA مقابل 200 ميكروغرام لطخة فحص الغربي). حساسية ELISA ومع ذلك بقي أقل من كشف المناعى، الذي يكتشف αS D في الخلايا الفردية وفي مناطق الدماغ الأمامية مثل القشرة المخية 15. حساسية الاختبار يمكن مع ذلك زيادة تحسين باستخدام الأجسام المضادة المختلفة و / أو أنظمة الكشف الأمثل، مثل الكشف عن chemiluminescent كما هو موضح سابقا (13).
من المهملاحظ أن العديد من الأجسام المضادة الأخرى تعترف أشكال أخرى من البروتين، وخصوصا شكل غير فسفرته (الكشف مع 4D6 وحيدة النسيلة الأجسام المضادة 20) أعطى نتائج مماثلة باستخدام هذا ELISA، بالإضافة إلى الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الاعتراف تحديدا pSer129 αS. وكشف هذا النهج ELISA أيضا مناعية مع الأجسام المضادة الاعتراف αS البشرية على وجه التحديد (LB509)، وإلى حد أقل بكثير، αS الماوس (D37A6) في نفس الحيوانات المريضة و / أو مناطق الدماغ لدى الفئران المرضى 15. من ناحية أخرى، لم يلاحظ أي مناعية من خلال تحليل ELISA من الفئران M83 المريضة باستخدام الأجسام المضادة استنساخ 42 ضد المنطقة الوسطى من αS (91-96) 21،22 الموافق حاتمة التي يمكن أن تكون خفي في ظل هذه الظروف ELISA. هذا الشكل ELISA يمكن الكشف في M83 أدمغة فئران على حد سواء Ser129 αS فسفرته، كما لوحظ من قبل فولدز 11 في البلازما البشرية، وغير فسفرته، وربما أشكال بلازميدة قليلة القسيمات، كما هو موضح في همهمةوالبلازما والسائل النخاعي 12،14. على عكس ELISAs المنشورة سابقا، شكل ELISA لدينا لا تستخدم نفس الأجسام المضادة في التقاط وكشف للكشف عن شكل بلازميدة قليلة القسيمات من αS، ولا الأجسام المضادة المعروفة لتكون بتكوين مثل الأجسام المضادة 5G4 المستخدمة في الدراسات UNTERBERGER ل.
خلافا لطريقة لطخة غربية المستخدمة سابقا للكشف عن αS D في الخليط الدماغ من M83 الفئران 4، فإن ELISA لا يتطلب خطوة تركيز مثل قبل تنبيذ فائق مع sarkosyl للكشف عن البروتين المرتبط المرض 23. تم تحديد αS الأمراض المرتبطة سابقا في الفئران M83 عن طريق استخراج متتابعة باستخدام مخازن لزيادة قوة 2،6. من الناحية العملية، هذا الاختبار الكمي يوفر وقتا كبيرا والكواشف بالمقارنة مع إجراء طخة غربية.
في هذه الدراسة، قامت αS تفصيلا التحليلات الجزيئية باستخدام نهج ELISA من الممكن لبسهولة تحديد مناعية مع الأجسام المضادة المختلفة في الفئران M83 المريضة. ويمكن أن تسلط الضوء على الآليات الجزيئية المشاركة في αS التجميع خلال synucleinopathies من وجهة نظر الكمي. وبالتالي يمكن لهذا النهج ELISA توفر الأساس لأداة سريعة وسهلة للكشف عن αS D في العينات البيولوجية المختلفة مع علامة موثوقة لأمراض مثل Ser129 αS فسفرته التي فولدز 11 يعتقد يظهر المزيد من وعد كعلامة التشخيص من غير فسفرته البروتين. في الآونة الأخيرة، مشيرا إلى أن تدابير من الكل αS أو ربما من αS غير فسفرته يمكن أن تستخدم كمؤشر بديل لتطور المرض في PD، حيث أن مستوى مجموع αS يميل إلى زيادة مع مرور الوقت بعد ظهور الأعراض الأولية 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر داميان جيلارد عن التطعيمات والمتابعة من التجارب على الحيوانات. وأيد هذا العمل من قبل ANSES (الوكالة الفرنسية للأغذية، البيئة والصحة والسلامة المهنية) وبمنحة من مؤسسة فرنسا باركنسون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
- Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
- Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
- Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
- Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
- Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
- Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
- Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
- El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
- Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
- Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
- Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29 (2014).
- Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
- Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
- Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
- Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11 (2001).
- Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
- Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225 (2011).
- Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
- Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540 (2013).
