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Medicine

मानव A53T overexpressing ट्रांसजेनिक चूहों के मस्तिष्क में बढ़ी एलिसा द्वारा रोग से जुड़े α-synuclein की जांच α-synuclein उत्परिवर्तित

Published: May 30, 2015 doi: 10.3791/52752
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 5, 5, 2, 1
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

Abstract

पश्चिमी धब्बा की तरह स्थापित तरीकों के अलावा, नए तरीकों को जल्दी और आसानी synucleopathies की प्रयोगात्मक मॉडल में रोग जुड़े α-synuclein (αS डी) यों की जरूरत है। अधिक व्यक्त मानव A53T αS और अनायास वजन घटाने, साष्टांग प्रणाम, और गंभीर मोटर हानि सहित लक्षण द्वारा विशेषता उम्र के आठ और 22 महीनों के बीच एक नाटकीय नैदानिक ​​फेनोटाइप विकासशील एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन (M83), इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। इन चूहों में αS डी (रोग-जुड़े αS) की आणविक विश्लेषण के लिए, एक एलिसा विशेष रूप से बीमार चूहों में αS डी यों के लिए डिजाइन किया गया था। इस माउस मॉडल में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विश्लेषण से मुख्य रूप से दुम मस्तिष्क क्षेत्रों और रीढ़ की हड्डी में αS डी की उपस्थिति देखी गई। यानी नैदानिक ​​रोग, के लिए अग्रणी विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के बीच αS डी वितरण में कोई मतभेद uninocul में थे,पैदा होते हैं और सामान्य रूप से ट्रांसजेनिक चूहों की उम्र बढ़ने और बीमार चूहों से मस्तिष्क के अर्क के साथ inoculated चूहों में। Ser129 के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग αS डी immunoreactivity की विशिष्ट पहचान को अनिवार्य रूप से पश्चिमी धब्बा और immunohistochemistry द्वारा प्राप्त की है कि के साथ सहसंबद्ध एलिसा द्वारा αS phosphorylated। अप्रत्याशित रूप से, इसी तरह के परिणाम αS के सी टर्मिनल भाग के खिलाफ कई अन्य एंटीबॉडी के साथ मनाया गया। एक "prion की तरह" तंत्र की भागीदारी का सुझाव αS डी के प्रसार, इस तरह आसानी से नजर रखी और एक एलिसा दृष्टिकोण का उपयोग कर इस माउस मॉडल में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं और जानवरों को शामिल प्रोटोकॉल चुनाव आयोग निर्देशक 86/609 / EEC और cometh, पशु प्रयोगों (प्रोटोकॉल 11-0043) में नैतिकता के विचार के लिए फ्रांस की राष्ट्रीय समिति द्वारा की पुष्टि के अनुसार थे। जानवरों रखे और ANSES की (0801 69387 अनुमोदन बी) के ल्योन में प्रायोगिक सुविधाओं को मंजूरी दे दी में से देखभाल के लिए किया गया था।

चूहे की 1. तैयारी

  1. सोडियम pentobarbital की घातक खुराक की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा चूहों euthanize।
  2. माउस खोपड़ी से पूरे मस्तिष्क निकालें और निकासी जब तक बर्फ पर एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में जगह है।
  3. ग्रीवा रीढ़ की हड्डी निकालें।
    नोट: निकालें αS या तो 1 टेबल में सूचीबद्ध प्रयोगों के बाद उपलब्ध बाण के समान सेक्शनिंग के बाद या विच्छेदित माउस दिमाग से मस्तिष्क हिस्सों में से एक है, से।
ExperimenT चूहे
Inoculum (मस्तिष्क समकक्ष) 		अस्तित्व की अवधि
(डीपीआई) 		माध्य / अधिक से अधिक जीवित रहने की
(दिन पुराने) 		एलिसा द्वारा डी का पता लगाने αS
/ डब्ल्यू बी / आईएचसी
1 Uninoculated चूहों 441 ± 166 419/736 8/8
2 टीका चूहों (0.2 मिलीग्राम) 150 ± 52 140/241 9/9

M83 चूहों पर किया प्रयोगों की तालिका 1. सूची। Inoculations के बाद, (ग्लूकोज में 1% WT / खंड 5%) एक बीमार माउस की एक मस्तिष्क homogenate के 20 μl के साथ striato-cortical क्षेत्र में प्रयोग 2 के लिए 6 सप्ताह में प्रदर्शन किया गया 3% isoflurane साँस लेना द्वारा 6 सप्ताह पुरानी समयुग्मक M83 चूहों के संज्ञाहरण। डीपीआई: दिन inocul पोस्टसमझना।

ब्रेन आधा से 2. αS एक्सट्रैक्शन

  1. Sagittally दो हिस्सों प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क में कटौती। पीस गेंदों युक्त ribolysis ट्यूब में प्रत्येक आधा वजन।
  2. 50 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 7.5, 750 मिमी NaCl, 5 मिमी EDTA, 1 मिमी डीटीटी, 1% फॉस्फेट और protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त उच्च नमक (एचएस) बफर तैयार करें। 20% (वजन / मात्रा) homogenates प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क हिस्सों को उच्च नमक बफर जोड़ें।
  3. 6.0 मीटर की ऊंचाई पर एक यांत्रिक homogenizer का उपयोग कर मस्तिष्क हिस्सों से नमूने तैयार / एस 23 सेकंड के लिए दो बार। पहले 23 सेकंड homogenization के बाद, दूसरा 23 सेकंड चक्र से पहले 2 मिनट के लिए बर्फ पर homogenates युक्त ट्यूबों जगह है।
  4. 5 मिनट unground, मस्तिष्क टुकड़े को खत्म करने के लिए 1000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। 200 μl aliquots में विभाजित है और बाद में एलिसा विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए, supernatants वसूल लेंगे।

विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों से 3. αS एक्सट्रैक्शन

  1. काटना एकजिसका समाप्त होता है हिप्पोकैम्पस विदारक छोड़कर जब एक साथ रखा जाता है दो forcipes का उपयोग कर एक कम बिजली की ताल (8X बढ़ाई) के साथ बर्फ पर एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में पूरे दिमाग। मस्तिष्क अखंडता की रक्षा करने के लिए 10 मिनट से अधिक न करें। मस्तिष्क जगह ठीक ऊपर की ओर है और इस क्रम में निम्न मस्तिष्क क्षेत्रों को पुनः प्राप्त:
    1. सिर्फ बल्ब के पीछे रखा संदंश का उपयोग दो घ्राण बल्ब की अलग से एक। एक नीचे की ओर आंदोलन के द्वारा मस्तिष्क से अलग करें। दूसरा बल्ब के लिए इस कार्रवाई को दोहराएँ।
    2. धीरे दो cortexes के बीच में संदंश कील और दो cortexes की हदबंदी की सुविधा के लिए आगे कदम। एक संदंश के साथ जगह में मस्तिष्क में रखते हुए, हिप्पोकैम्पस से कॉर्टेक्स अलग करने के लिए एक और उपयोग करें।
    3. संदंश कॉर्टेक्स नीचे 2 मिमी स्थिति। हिप्पोकैम्पस के ऊपर से दिखाई देता है जब तक संदंश पर एक सज्जन दबाव बनाए रखें। कॉर्टेक्स के पहले भाग को छीलकर, और दूसरे भाग के साथ दोहराएँ। दो cortexes अलग करने के लिए संदंश का प्रयोग करेंहिप्पोकैम्पस में शुरू करने और मस्तिष्क के सामने की ओर बढ़ रहा है।
    4. हिप्पोकाम्पी में से एक के आसपास खुले संदंश स्थिति। फिर धीरे से जितना संभव हो उतना ठीक है, इसे हटाने के हिप्पोकैम्पस के तल पर संदंश बंद करें। दूसरा हिप्पोकैम्पस के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
    5. स्ट्रिएटा में से एक नीचे खुला संदंश स्थिति और धीरे मस्तिष्क से अलग। स्ट्रिएटम से किसी भी शेष कॉर्टेक्स दूर करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। दूसरा स्ट्रिएटम के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    6. धीरे मस्तिष्क से सेरिबैलम की जुदाई की सुविधा के लिए 2 मिमी सेरिबैलम के समोच्च द्वारा दबाना संदंश का प्रयोग करें। बस सेरिबैलम के पीछे संदंश प्लेस और आगे संदंश ले जाकर इसे हटा दें।
    7. यह ब्रेन स्टेम मिलती है, जहां स्पष्ट रूप से देखने के क्रम में mesencephalon जुटाने के लिए संदंश के व्यापक हिस्से का प्रयोग करें। जंक्शन पर एक ऊर्ध्वाधर चीरा तो ब्रेन स्टेम को दूर करते हैं।
    8. , Mesencephalon पीछे संदंश स्थिति जो मैंचार गोल संरचनाओं से बना है। Mesencephalon पूरी तरह से शेष मस्तिष्क से अलग कर दिया गया है जब तक खड़ी काटकर अलग कर देना।
  2. चर% एच एस बफर में (वजन / मात्रा), उपलब्ध ऊतकों की मात्रा पर निर्भर करता है, यानी, 10 और 30 मिलीग्राम के बीच एक वजन के लिए 5% homogenate, 30 और 80 मिलीग्राम के बीच एक वजन के लिए 10%, और 20% की homogenates की तैयारी 80 मिलीग्राम के ऊपर एक वजन के लिए।
    1. Homogenate के होने की उम्मीद है% प्राप्त करने के लिए विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए एच एस बफर की पर्याप्त मात्रा में शामिल करें।
    2. भंवर और ऊतकों को पूरी तरह से एच एस बफर में डूब रहे हैं कि जाँच करें।
    3. एक borosilicate ग्लास ट्यूब और दो pestles, ए और बी से बना एक ऊतक बनाने की मशीन के साथ विच्छेदित मस्तिष्क क्षेत्रों या गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी से तैयार नमूने homogenize
    4. ट्यूब में सीधे कुचल दिया करने के लिए प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र डालो। ट्यूब में मूसल एक डालें और इसे वापस लेना। ऊतक अलग कर देना करने के लिए इस आंदोलन के बारे में दस बार दोहराएँ। तो सी को मूसल B उपयोगअगले 20 आंदोलनों के साथ ऊतक पीस जारी रखें। 1 मिलीलीटर हस्तांतरण विंदुक के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में homogenates स्थानांतरण।
  3. किसी भी unground, मस्तिष्क टुकड़े को खत्म करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। , Supernatants निकालते हैं 200 μl aliquots में उन्हें विभाजित और बाद में एलिसा विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए।

एलिसा द्वारा αS 4. डिटेक्शन

  1. 0.01 एनजी / एमएल कोटिंग एंटीबॉडी पतला। 50 मिमी ना 2 सीओ 3/3 NaHCO बफर (पीएच 9.6) में विरोधी αS खरगोश पॉलीक्लोनल या मोनोक्लोनल क्लोन 42 एंटीबॉडी का उपयोग करें।
  2. कोट 96 अच्छी तरह से microplates यह कोटिंग समाधान के प्रति अच्छी तरह से 100 μl, और साथ 4 डिग्री सीओ / एन पर छोड़ दें। , पता लगाने के एंटीबॉडी syn514 का उपयोग कर ELISAs के लिए कोटिंग समाधान में विरोधी αS खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का प्रयोग 42, LB509, AS11, 4D6 या 8A5 क्लोन। एक कोटिंग के समाधान के रूप में विरोधी αS मोनोक्लोनल एंटीबॉडी क्लोन 42 का प्रयोग करेंविरोधी pSer129 αS का पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ संयोजन में।
    नोट:, प्लेट एलिसा से पहले एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है यदि आवश्यक हो जाता है।
  3. प्रति अच्छी तरह से 0.05% के बीच 20 (PBST) के साथ प्लेटें फॉस्फेट बफर खारा के 300 μl के साथ पांच बार धोने के लिए एक थाली वॉशर का उपयोग करें। आगे इस कदम से, ऊष्मायन आरटी पर है।
  4. टी -20 पीबीएस प्रति अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर के 200 μl जोड़ें। 150 rpm पर 1 घंटे के लिए शेक। PBST के साथ प्लेटों पांच बार धोएं।
  5. (: 20% homogenates के 100, 10% homogenates के 1:50 और PBST बीएसए 1% में 5% homogenates के 1:25 कमजोर पड़ने 1), और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl जोड़ने के मस्तिष्क homogenates पतला। 150 rpm पर मिलाते हुए, जबकि उसके बाद 2 घंटे के लिए सेते हैं। PBST के साथ प्लेटों पांच बार धोएं।
  6. माल सूची में उल्लिखित dilutions पर बीएसए के साथ PBST में 1% अलग αS का पता लगाने के एंटीबॉडी जोड़ें। 150 rpm पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। PBST के साथ प्लेटों पांच बार धोएं।
  7. विरोधी या तो जोड़ें150 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 1 घंटे के लिए बीएसए 1% के साथ पूरक PBST में 8000: -mouse या विरोधी खरगोश आईजीजी एचआरपी conjugates 1 पतला। PBST के साथ प्लेटों पांच बार धोएं।
  8. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए, 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) समाधान '3,3 के 100 μl जोड़ें और 150 rpm पर मिलाते हुए, जबकि अंधेरे में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  9. तो ठीक है microplate रीडर के साथ 450 एनएम पर उपाय absorbance के प्रति 1 एन एचसीएल के 100 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
  10. डेटा विश्लेषण के लिए, विश्लेषण के नमूनों में से प्रत्येक के लिए मापा आयुध डिपो मूल्यों से किसी भी माउस मस्तिष्क के नमूने (रिक्त अच्छी तरह से) को छोड़कर सभी अभिकर्मकों के साथ एक अच्छी तरह से प्राप्त में आयुध डिपो मूल्य घटाना।

5. मिलान मैपिंग

  1. उस्मान 16 से वर्णित विधि के अनुसार मिलान मानचित्रण प्रदर्शन करते हैं। संक्षेप में, 10 अतिव्यापी एमिनो एसिड के साथ nitrocellulose पर 12 अमीनो एसिड से युक्त मानव α-synuclein अनुक्रम का स्थान पेप्टाइड्स।
  2. 50 मिमी Tris / 150 मिमी NaCl बफर पीएच 1 के साथ ब्लॉक0 0.05% के बीच 20 और 5% दूध पाउडर युक्त। 2-10 ° सीओ / एन पर मिलीलीटर प्रति 2 माइक्रोग्राम एंटीबॉडी की एकाग्रता में अवरुद्ध समाधान में एंटीबॉडी सेते हैं।
  3. झिल्ली 50 मिमी Tris / 150 बकरी विरोधी माउस आईजीजी एचआरपी साधना के साथ 0.05% के बीच 20 सेते युक्त मिमी NaCl बफर पीएच 10 का उपयोग कर तीन बार धोएं। तो एक ही बफर का उपयोग कर एक और पांच बार एक पश्चिमी धब्बा TMB धुंधला किट का उपयोग दाग झिल्ली धो लें।

6. सांख्यिकी विश्लेषण

  1. आयुध डिपो मॉडल करने के लिए मिश्रित प्रभाव प्रतिगमन प्रदर्शन करने के लिए अनुसंधान सॉफ्टवेयर और nlme पैकेज का प्रयोग करें। प्रत्येक तुलना के लिए, एक मिश्रित प्रभाव प्रतिगमन मॉडल प्रदर्शन करते हैं। स्पर्शोन्मुख समूहों से रोगसूचक भेद करने के लिए एक निश्चित प्रभाव का उपयोग करें।
  2. एक दिया माउस के लिए repetitions की परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित करने के लिए एक यादृच्छिक प्रभाव का उपयोग करें। बच परीक्षण करके homoscedasticity की जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो, Pinheiro और बेट्स 1 के साथ ध्यान में रखते हुए भीतर-समूह त्रुटियों के विचरण संरचना मॉडल के लिए विचरण कार्यों का उपयोग7 पी। के महत्व दहलीज के रूप में 0.05 सेट

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Representative Results

इस अध्ययन में, इस्तेमाल किया ELISAs विशेष रूप से बीमार M83 चूहों से एक उच्च नमक बफर में तैयार मस्तिष्क homogenates में इस रोग से जुड़े αS (αS डी) की पहचान की। विशेष रूप से pSer129 αS (पी = 0.0074) को पहचानने एक एंटीबॉडी का उपयोग करना, एलिसा आसानी से युवा (पुराने 2-5 महीने), स्वस्थ M83 चूहों (चित्रा 1) से बूढ़े, बीमार चूहों (> 8 महीने पुरानी है) अलग है। कई अन्य एंटीबॉडी इसी प्रकार उच्च संकेतों केवल बीमार चूहों से मस्तिष्क homogenates में (> 0.6 ओवर ड्राफ्ट) दिखाया। इस 4D6 के लिए मामला (पी = 0.01) प्रोटीन (124-134, 115-122 के सी टर्मिनल भाग के विभिन्न दृश्यों के खिलाफ, LB509 (पी = 0.0047) और 8A5 (पी <0.001), और 129-140 है क्रमशः) और एक बहुत हद तक कम करने, प्रोटीन (पी = 0.0003) के एन टर्मिनल अंत (2-12) के खिलाफ syn514। इसके अलावा, AS11 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी C57BL / 6S के टीकाकरण के बाद मानव तंतुमय पुनः संयोजक αS 18 (बी -6 αS-शून्य) 19 के खिलाफ हमारी प्रयोगशाला में उत्पादितα-syn ठिकाना के विलोपन के साथ चूहों, केवल बीमार चूहों से मस्तिष्क homogenates में इसी प्रकार उच्च संकेतों (पी <0.01) से पता चला है। इस एंटीबॉडी अब मानव α-synuclein की 118-125 अनुक्रम करने के लिए इसी αS के अमीनो एसिड अनुक्रम (पी) VDPDNEAY (ई) पहचान करने के लिए दिखाया गया है।

इसके विपरीत, इन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, α-synuclein (91-96 अनुक्रम) के मध्य क्षेत्र के खिलाफ निर्देशित क्लोन 42 का पता लगाने के एंटीबॉडी के साथ मस्तिष्क homogenates का विश्लेषण करती है, दोनों बीमार और स्वस्थ M83 चूहों के लिए एक बहुत कम संकेत दिखाया। यह चूहों के दो आबादी (पी = 0.1158) भेद नहीं कर सका। युवा M83 चूहों फिर भी गैर ट्रांसजेनिक B6C3H चूहों की तुलना में एक उच्च immunoreactivity (M83 आनुवंशिक पृष्ठभूमि लाइन) से पता चला है। इसके विपरीत C57BL / 6S के साथ एक नष्ट कर दिया α-syn ठिकाना है जो (बी -6 αS-शून्य) चूहों, यहां तक ​​कि अधिक से अधिक था। इस M83 चूहों में मामूली immunoreactivity के सामान्य αS की कम संकेत का पता लगाने के लिए मेल खाती है कि पता चलता है। एइस एलिसा के nalytical संवेदनशीलता एक की तुलना में मूल्यांकन किया गया था कि पहले एलिसा और वेस्टर्न ब्लाट के तरीकों, एक ही बीमार M83 से तैयार मस्तिष्क homogenates के धारावाहिक dilutions दोनों का उपयोग कर, की जांच करके, अघुलनशील Ser129 phosphorylated α-synuclein का पता लगाने के लिए पश्चिमी धब्बा विधि 4 में वर्णित माउस मस्तिष्क (चित्रा 2)। लगभग 10 माइक्रोग्राम मस्तिष्क समकक्ष LB509 और PSer129 एंटीबॉडी दोनों के साथ, इस बीमार माउस से मस्तिष्क homogenate के लिए एक सकारात्मक एलिसा संकेत प्राप्त करने के लिए पर्याप्त थे। इसके विपरीत, कम से कम 200 माइक्रोग्राम मस्तिष्क समकक्ष एक ही PSer129 एंटीबॉडी 15 का उपयोग करते हुए पश्चिमी धब्बा द्वारा विश्लेषण sarkosyl अघुलनशील अंश में pSer129 αS का पता लगाने की जरूरत थी। यह एलिसा एक विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता पश्चिमी धब्बा विधि की है कि कुछ 20 बार है कि इंगित करता है।

बीमार और बूढ़े M83 चूहों (चित्रा 3), mesencephalon से मस्तिष्क homogenates, ब्रेन स्टेम और रीढ़ की हड्डी थानेदार में बुध एलिसा में LB509 और PSer129 एंटीबॉडी दोनों के साथ immunoreactivity के रूप में चिह्नित। हालांकि, कोई पता लगाने योग्य immunoreactivity के घ्राण बल्ब, सेरेब्रल कॉर्टेक्स, स्ट्रिएटम, हिप्पोकैम्पस, चेतक और हाइपोथैलेमस सहित अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में मनाया गया। एलिसा सेरिबैलम के लिए एक बेहोश संकेत दे दी है। एक बीमार M83 माउस 4 (3B चित्रा) से एक मस्तिष्क निकालने के इंजेक्शन के बाद एक त्वरित नैदानिक ​​रोग विकसित होने M83 चूहों के अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में immunoreactivity M83 चूहों uninoculated आयु वर्ग (पुराने> 8 महीने) में देखा कि से पृथक किया गया था। इन परिणामों के मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की दुम क्षेत्रों में Ser129 α-synuclein का एक बहुत बड़ा बयान दिखा पश्चिमी धब्बा (चित्रा -3 सी) और immunohistochemistry के 15 से प्राप्त उन लोगों के साथ पूरी तरह से संगत कर रहे हैं।

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M83 चूहों से पूरे मस्तिष्क homogenates में इस रोग से जुड़े α-synuclein (αS डी) 1. एलिसा का पता लगाने चित्रा। Syn514 साथ एलिसा के संयोजन खरगोश विरोधी αS पॉलीक्लोनल (कोटिंग), LB509, AS11, 4D6, 8A5 विरोधी pSer129 αS (PSer129) के साथ (पहचान) या क्लोन 42 (कोटिंग) (पहचान) एंटीबॉडी, स्वस्थ M83 चूहों से बीमार चूहों भेद विरोधी αS खरगोश पॉलीक्लोनल साथ एलिसा (कोटिंग) / clone42 (पहचान) है, जबकि ऐसा नहीं करता। 11 से 16 महीने से आयु वर्ग के छह बीमार, बूढ़े M83 चूहों (क्लोन 42 एंटीबॉडी) को छोड़कर विरोधी α-syn एंटीबॉडी के साथ immunoreactivity के लक्षण दिखाई। यह 2 से 5 महीने पुरानी से वृद्ध या तो छह जवान, स्वस्थ चूहों के लिए मामला नहीं था, या B6C3H या बी -6 αS-अशक्त चूहों (M83 चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि) सहित अतिरिक्त नियंत्रण के साथ। त्रुटि सलाखों Bétemps 15 से संशोधित एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं।

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एक सकारात्मक संकेत एक बीमार से मस्तिष्क homogenates की दो गुना dilutions से 12.5 माइक्रोग्राम दोनों LB509 के साथ मस्तिष्क समकक्ष और PSer129 एंटीबॉडी के लिए एलिसा के साथ प्राप्त किया गया था एलिसा और वेस्टर्न ब्लाट। ए द्वारा αS डी का पता लगाने के विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता की चित्रा 2. तुलना करें माउस। एलिसा उपायों 3 मानक विचलन के तीन से छह दोहराता दौरान स्वस्थ M83 चूहों के नमूनों से प्राप्त साधन करने के लिए इसी बीमार और स्वस्थ चूहों के भेदभाव के लिए अनुमानित कट-ऑफ स्तर, क्रमशः LB509 और PSer129 का पता लगाने के एंटीबॉडी के लिए 0.030 और 0.020 थे । वे एंटीबॉडी से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में एक ही रंग में एक पंक्ति के रूप में दिखाया जाता है। बी presen में ultracentrifugation के बाद प्राप्त अघुलनशील भिन्न के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करकेsarkosyl के CE, 200 माइक्रोग्राम मस्तिष्क समकक्ष एक ही PSer129 एंटीबॉडी के साथ αS डी का पता लगाने की जरूरत थी। (केडीए में) आण्विक वजन मार्करों दाग की बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। Bétemps 15 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

चित्र तीन
एलिसा और वेस्टर्न ब्लाट द्वारा M83 चूहों के अलग मस्तिष्क क्षेत्रों में इस बीमारी से जुड़े α-synuclein (αS डी) की चित्रा 3। डिटेक्शन। एलिसा PSer129 या LB509 का पता लगाने सामान्य उम्र बढ़ने (ए) के दौरान M83 चूहों में एंटीबॉडी (एन = 1, 4 दोहराता है, एसडी ± मतलब है) या एक बीमार M83 से एक मस्तिष्क homogenate के साथ 6 सप्ताह पुरानी M83 चूहों के टीकाकरण के बाद साथ αS डी पहचान ( बी) (एन = 1, 4 दोहराता है,) एसडी ± मतलब है। (सी) αS डी डब्ल्यू द्वारा की पहचान की थीestern एक बीमार M83 माउस से एक मस्तिष्क homogenate के साथ inoculated चूहों में एक ही न्यूरो संरचनात्मक क्षेत्रों में PSer129 का पता लगाने के एंटीबॉडी EP1536Y साथ दाग। (केडीए में) आण्विक वजन मार्करों कुल प्रोटीन की समान मात्रा में जेल पर बराबर लोड करने के लिए प्रत्येक पंक्ति में इस्तेमाल किया गया पैनल सी की बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं। बीमार M83 चूहों से निम्नलिखित आठ न्यूरो संरचनात्मक क्षेत्रों का परीक्षण किया गया: ओ: olfactive बल्ब, Cx: सेरेब्रल कॉर्टेक्स, हाय: हिप्पोकैम्पस, सेंट: स्ट्रिएटम, मुझे: mesencephalon, सीबी: सेरिबैलम, बी एस: ब्रेन स्टेम, अनुसूचित जाति: ग्रीवा रीढ़ की हड्डी । Bétemps 15 से संशोधित।

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Discussion

एक एलिसा के उपयोग के लिए विशेष रूप से M83 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में बीमारी के दौरान माउस मस्तिष्क homogenates से सीधे αS डी पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया गया। दरअसल, इस एलिसा आसानी से उच्च नमक बफर में ही पूरे दिमाग homogenates का उपयोग कर स्वस्थ M83 चूहों से बीमार M83 चूहों को भेद सकता है।

इस एलिसा का प्रयोग सफल परिणाम के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: सही ढंग से विच्छेदन के दौरान नुकसान को रोकने के लिए आवश्यक मैनुअल निपुणता के विकास के द्वारा माउस दिमाग के विभिन्न क्षेत्रों विदारक; विशेष रूप से एच एस बफर में नमूना dilutions प्रदर्शन कर; और एंटीबॉडी के चुनाव, नहीं सभी एंटीबॉडी एक एलिसा प्रारूप में काम करेंगे।

ΑS डी के स्तर में कुछ परिवर्तनशीलता अलग चूहों के बीच फिर भी स्पष्ट किया गया था। इन परिणामों के सार्क की परीक्षा से ही बीमार M83 चूहों में पाया ठेठ αS डी पैटर्न के पश्चिमी धब्बा पता लगाने के बराबर हैंSer129 के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ पता लगाने के बाद osyl अघुलनशील को भिन्न αS 15 phosphorylated। यह एलिसा immunoreactivity के αS विकास की विशिष्ट पहचान करने के लिए संगत को दर्शाता है।

पिछले पश्चिमी धब्बा के साथ समझौता 15 विश्लेषण में, इस एलिसा के रूप में अच्छी तरह से ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के रूप में, मस्तिष्क, यानी, mesencephalon और ब्रेन स्टेम की दुम भागों में बीमार M83 चूहों के मस्तिष्क के विच्छेदन के बाद immunoreactivity का पता चला। कोई immunoreactivity के घ्राण बल्ब, सेरेब्रल कॉर्टेक्स, स्ट्रिएटम या हिप्पोकैम्पस तंतुमय अल्फा द्वारा टीका दिया गया था कि चूहों के मामले में कम से बहुत कम स्तर है, जब तक रोग प्रक्रिया 6 से बख्शा गया यह दर्शाता है कि पिछले डेटा के साथ संगत हिप्पोकैम्पस में पाया गया था हिप्पोकैम्पस 15 में -synuclein। αS डी का वितरण इस प्रकार कांग्रेस है, जो उल्लेखनीय वर्दी कुल मिलाकर, जो कुछ प्रयोगात्मक शर्तों दिखाई दियाluded या तो चूहों की सामान्य उम्र बढ़ने या बीमार M83 चूहों से मस्तिष्क homogenates का इंट्रा-मस्तिष्क टीका के बाद रोग के विकास को त्वरित।

इसके अलावा, परख प्रदर्शन पहले से वर्णित पश्चिमी धब्बा विधि की तुलना में बेहतर है। एक बीमार M83 माउस (पश्चिमी धब्बा परख के लिए 200 माइक्रोग्राम बनाम एलिसा के लिए 12.5 माइक्रोग्राम) से एक मस्तिष्क homogenate के धारावाहिक dilutions का उपयोग करते हुए इस परीक्षा में प्राप्त पता लगाने की सीमा के रूप में दिखाया द्वारा एलिसा के विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता, उच्च दिखाई दिया। एलिसा की संवेदनशीलता हालांकि इस तरह के सेरेब्रल कॉर्टेक्स के रूप में 15 व्यक्ति की कोशिकाओं में और ललाट मस्तिष्क क्षेत्रों में αS डी का पता लगाता है जो immunohistochemical का पता लगाने, की तुलना में कम ही रहा। परीक्षण की संवेदनशीलता फिर भी आगे पहले से 13 में वर्णित के रूप में ऐसी chemiluminescent का पता लगाने के रूप में अलग एंटीबॉडी और / या अनुकूलित का पता लगाने प्रणालियों का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है।

क्या यह महत्वपूर्ण हैकई अन्य एंटीबॉडी प्रोटीन के अन्य रूपों को पहचानने, और विशेष रूप से (4D6 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 20 के साथ पाया) एक गैर-phosphorylated फार्म विशेष रूप से pSer129 αS पहचानने मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के अलावा, इस एलिसा का उपयोग करते हुए इसी तरह के परिणाम दे दी है कि ध्यान दें। यह एलिसा दृष्टिकोण भी बीमार चूहों 15 का एक ही बीमार जानवरों और / या मस्तिष्क क्षेत्रों में एक बहुत कम हद तक विशेष रूप से मानव αS (LB509) और पहचानने एंटीबॉडी, माउस αS (D37A6) के साथ immunoreactivity का पता चला। दूसरी ओर, कोई immunoreactivity इन एलिसा शर्तों के तहत गुप्त हो सकता है जो एक मिलान करने के लिए इसी αS (91-96) 21,22 के मध्य क्षेत्र के खिलाफ क्लोन 42 एंटीबॉडी का उपयोग बीमार M83 चूहों की एलिसा विश्लेषण से मनाया गया। Oligomeric रूपों मानव प्लाज्मा में Foulds 11 से मनाया, और संभवतः, गैर phosphorylated के रूप में गुंजन में वर्णित के रूप में यह एलिसा प्रारूप, M83 माउस दिमाग दोनों Ser129 phosphorylated αS में पता लगा सकता हैएक प्लाज्मा और मस्तिष्कमेरु द्रव 12,14। पहले प्रकाशित ELISAs के विपरीत, हमारे एलिसा प्रारूप αS की oligomeric फार्म का पता लगाने के लिए कब्जा है और पता लगाने में एक ही एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया, न तो है और न ही जाना जाता एंटीबॉडी Unterberger के अध्ययन में इस्तेमाल किया 5G4 एंटीबॉडी की तरह, गठनात्मक हो।

पहले से M83 चूहों 4 से मस्तिष्क homogenates में αS डी का पता लगाने के लिए किया जाता पश्चिमी धब्बा विधि के विपरीत, एलिसा रोग जुड़े प्रोटीन 23 का पता लगाने के लिए इस तरह के sarkosyl साथ ultracentrifugation द्वारा के रूप में एक एकाग्रता के कदम की जरूरत नहीं थी। रोग से जुड़े αS पहले से ताकत 2,6 बढ़ाने की buffers का उपयोग अनुक्रमिक निष्कर्षण द्वारा M83 चूहों में पहचान की थी। देखने का एक व्यावहारिक बिंदु से, इस मात्रात्मक परख पश्चिमी धब्बा प्रक्रिया की तुलना में महत्वपूर्ण समय और अभिकर्मकों बचाता है।

इस अध्ययन में, एक एलिसा दृष्टिकोण का उपयोग कर विस्तृत αS आणविक विश्लेषण करने के लिए यह संभव बना दियाआसानी से बीमार M83 चूहों में अलग एंटीबॉडी के साथ immunoreactivity यों। यह एक मात्रात्मक दृष्टि से synucleinopathies दौरान αS एकत्रीकरण में शामिल आणविक तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है। यह एलिसा दृष्टिकोण इसलिए Foulds 11 शो गैर phosphorylated की तुलना में एक नैदानिक ​​मार्कर के रूप में अधिक वादा मानना ​​है कि इस तरह के Ser129 phosphorylated αS के रूप में विकृति का एक विश्वसनीय मार्कर के साथ विभिन्न जैविक नमूने में αS डी का पता लगाने के लिए एक तेज और आसान उपकरण के लिए आधार प्रदान कर सकता है प्रोटीन। हाल ही में, वह कुल αS के स्तर पर प्रारंभिक लक्षण 24 की उपस्थिति के बाद समय के साथ बढ़ जाता है के रूप में संभवतः गैर phosphorylated αS की कुल αS या के उपायों, पीडी में रोग प्रगति के लिए एक किराए मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस तथ्य की ओर इशारा ।

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Acknowledgments

लेखकों inoculations के लिए डेमियन गैलार्ड धन्यवाद और अनुवर्ती पशु प्रयोगों के लिए करना चाहते हैं। इस काम ANSES (खाद्य, पर्यावरण और व्यावसायिक स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए फ्रेंच एजेंसी) और फाउंडेशन फ्रांस पार्किंसंस से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB509 Abcam ab27766 Detection antibody 1/2,000
AS11 Produced at Anses Detection antibody 1/1,000
4D6 Abcam ab1903 Detection antibody 1/2,000
PSer129 Abcam ab59264 Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536Y Abcam ab51253 Detection antibody 1/1,000
syn514 Abcam ab24717 Detection antibody 1/500
clone 42 BD Biosciences 610787 Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5 Provided by Dr. Anderson Detection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibody Millipore AB5038P Coating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugate Southern Biotech 1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugate Southern Biotech 4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugate Dianova 115-035-164
HS buffer Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex 26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex 1112-A
  • EDTA 5 mM
Euromedex EU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma 43815
PBS Adjust at pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex 1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex 2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex 1112-A
  • KCl 2.7 mM
Euromedex P017
Tween 20 Euromedex 2001-C
BSA Sigma A7906
DTT 1 mM Sigma 43815 Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktail Pierce 78428
1% protease inhibitor cocktail Roche 04 693 132 001 50x concentrated
Microplate MaxiSorpTM Thermo Scientific 442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma 71360 2.86 g/L
  • NaHCO3
Merk 6329 3.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking buffer Pierce E6423H 10x concentrated
TMB Sigma T0440 Used for ELISA
TMB Analytik Jena AG 847-0104200302 Used for epitope mapping
HCl 1 N Chimie plus 40030
Ribolyser Thermo Fast prep FP120 keep on ice at this step
Grinding tubes Biorad 355-1197
Plate washer Tecan Columbus Pro
Plate reader Biorad Model 680
Low power magnifier  VWR 630-1062 8X magnification
Forceps Dumont#7 WPI 14097 For dissection steps
Transfer pipette 1ml Samso Samso 043231
1.5 ml tubes Dutscher 033290

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References

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चिकित्सा अंक 99 पार्किंसंस पागलपन अल्फा-synuclein prion माउस ट्रांसजेनिक एलिसा
मानव A53T overexpressing ट्रांसजेनिक चूहों के मस्तिष्क में बढ़ी एलिसा द्वारा रोग से जुड़े α-synuclein की जांच α-synuclein उत्परिवर्तित
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Bétemps, D., Verchère, J., … More

Bétemps, D., Verchère, J., Mougenot, A. L., Lachmann, I., Morignat, E., Antier, E., Lakhdar, L., Legastelois, S., Baron, T. Detection of Disease-associated α-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated α-synuclein. J. Vis. Exp. (99), e52752, doi:10.3791/52752 (2015).

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