Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Robotic Produksjon av Cancer Cell Spheroids med en vandig To-fase system for Drug Testing

Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52754
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

Introduction

Cellebaserte analyser gir et viktig verktøy for utvikling og oppdagelse av nye anti-kreft narkotika. 1,2 Historisk monolagkulturer kreftceller har blitt ansatt for å undersøke effekten av kandidat forbindelser mot bestemte typer kreftceller. Enkelt vedlikehold av monolagkulturer i standard kulturplater, kompatibiliteten av standard plater med kommersielle robot verktøy for tillegg av reagenser, og med screening utstyr for genetisk analyse av cellulære responser på kjemiske forbindelser er de store fordelene som gjør 2D kulturer et attraktivt verktøy for narkotikatesting. 3 Dessverre, monolayer celleanalyser ofte ikke klarer å forutsi effekten av forbindelser i vivo, noe som gjør narkotika utvikling og oppdagelse en ekstremt kostbar prosess. 4,5 tross for betydelige investeringer og innsats av farmasøytiske selskaper og akademiske enheter, bare ~ 1% av anti-kreft narkotika i kliniske studier ble godkjentav FDA i løpet av de siste to tiårene. 6 Misforhold mellom 2D- kulturer og komplekse 3D-miljø av kreftceller in vivo er en stor brist av enlagskultur systemer. 7 Derfor screening av kandidat forbindelser mot kreftceller i en innstilling som mer ligner 3D svulst miljøet kan fremskynde utviklingen av romanen kjemoterapi narkotika. 8

Cancercelleklumper presentere en relevant 3D-tumormodellen in vitro. 9,10 Spheroids er kompakte klaser som dannes ved spontane eller induserte sammenstillingen av kreftceller på ikke-adherente flater eller i suspensjon ved hjelp av teknikker som spinnerkolbe, flytende overlegg, microfabricated mikro- . vel arrays, MicroFluidics, og hengende dråper 11-16 Spheroids ligne sentrale trekk ved solide tumorer inkludert geometri og begrenset transport av oksygen, næringsstoffer og narkotika forbindelser inn i den sentrale sonen; dermed de nærmere regenerere narkotika ansvarsse av faste tumorer i forhold til monolagskulturer. 17 til 19 tross for dette betydelig fordel, er sfæroider ikke rutinemessig anvendt for screening av kjemiske forbindelser mot kreftceller. Vanskeligheten med å produsere ensartet store kuler i en standard høy gjennomstrømning innstilling som er kompatibel med kommersielt tilgjengelige robotikk og screening / avbildningsverktøy vanskeliggjør inkorporering av sfæroide kultur i legemiddelutvikling rørledningen. Selv tilpassede materialer og plater har nylig blitt kommersielt tilgjengelig for å løse dette behovet, kostnadsvurderinger avskrekke sin utbredt bruk.

To hovedteknikker med evnen til å produsere konsekvente dimensjonerte kuler i høy gjennomstrømning bruke en ny hengende dråpe plattform og microfabricated mikrobrønner. 13,16,20 imidlertid begge metoder krever spesielle plater og enheter som er kostbare å fremstille og upraktisk for endepunkt brukere i kjerneforskningssentre og farmasøytisk industri hvor de fleste større effortene for oppdagelsen av nye legemidler mot kreft er gjort. Til tross for noen forbedringer i stabilitet av celleholdige dråper med en nyere design hengende slippe plater, er bare annenhver hull av platen fortsatt brukes under kultur for å unngå spredning / sammenslåing av dråper. 16 Dette reduserer eksperimentell gjennomstrømming betydelig. Drug tillegg og fornyelse er vanskelig med manuell eller robotisert pipettering og kuler må overføres til en standard plate for biokjemisk analyse fordi denne platen konfigurasjonen er ikke lett kompatibel med konvensjonelt screening utstyr som plate lesere. 21 Micro-brønner fabrikkert ved hjelp av myke litografi også tillate kontrollert størrelse spheroid produksjon. 13,20 Men uforlikelighet av denne plattformen med standard pipettering verktøy hindrer behandling av individuelle kuler med ulike medikament forbindelser / konsentrasjoner, utsette alle kulene til en enkelt behandling tilstand. Således er denne fremgangsmåte ikke egnet for høygjennomstrømming sammensatte screening som krever samtidig testing av flere forbindelser / konsentrasjoner.

For å overvinne disse hindringer har en ny teknikk for høy gjennomstrømning produksjon av gående størrelse cancercelleklumper i standard 96-brønners plater blitt utviklet. 22,23 Metoden er basert på et polymert vandig tofasesystem (ATPS) med polyetylenglykol ( PEG) og dekstran (DEX) som fasedannende polymerer. 24 ATPSs har nylig blitt anvendt i en rekke nye celle biologiske applikasjoner for å aktivere celle micropatterning og lokalisert levering av biologiske reagenser til celler i svært vandige medier. 25-32 for å danne en sfæroide, har kreftceller blandes med den vandige DEX fase og en sub-mikroliters dråpe av den resulterende suspensjonen blir pipettert inn i en brønn inneholdende nedsenking vandige PEG-fase løsning. Fallet er fortsatt ikke blandbart fra nedsenking fasen og rammen celler for å lette dannelsen av en spheroid. Importantly, gir den meget vandige fase nedsenking næringsstoffer til cellene i den sfæroide og minimaliserer den velkjente problemet med media fordampning felles for noen andre assays som forårsaker endringer i medie osmolalitet og svingninger av medikamentkonsentrasjoner. Denne teknikken gjør det mulig sfæroide produksjon og behandling bare ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser og pipettering verktøy i standard 96-brønners plater. Det blir foretatt analyse av cellulære responser av kuler utføres på samme plate ved hjelp av standard biokjemiske analyser og platelesere. Det er utrolig lett å jobbe med ATPS og tilpasningsevne av tilnærmingen til robotvæskehåndtering gjør høy gjennomstrømning generasjon av både mono-kultur og co-kultur kuler en grei laboratorieteknikk. Denne nye tilnærmingen vil være et stort skritt fremover mot integrasjon av kreft celleklumper til narkotika utvikling og utforskprosesser med forbedret testing gjennomstrømming og kostnadseffektivitet (økende antall testede forbindelser og reduced reagensforbruk) og effektivitet (redusere hands-on tid).

En detaljert protokoll for robot produksjon av cancercelleklumper i 96-brønners plater ved bruk av ATPS tilnærming er beskrevet nedenfor. I tillegg, blir detaljene for behandling av resulterende sfæroider og nedstrøms analyse av cellulære responser ved å bruke en kommersiell biokjemisk analyse presentert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Polymer Vandig Two Phase System (ATPS)

  1. Vei opp 0,5 g polyetylenglykol (PEG) (MV: 35.000) og legge det til 9,5 ml komplett vekstmedium i et sterilt 15 ml konisk for å fremstille 10 ml 5% (w / v) vandig PEG fase.
    Merk: Legge halvparten av mediet til den koniske først, etterfulgt av tilsetning av polymeren og deretter den resterende mengde medium minimaliserer adhesjon av polymeren til de koniske vegger og hjelper polymeren oppløses raskere.
  2. Veie 0,128 g dekstran (DEX) (MV: 500.000) og legge den til 0,872 ml komplett vekstmedium i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør for å fremstille 1 ml 12,8% (w / v) vandig DEX fase.
  3. Vortex begge løsninger i ca. 1 min for å oppløse polymerer i mediet.
  4. Holde begge løsninger i et vannbad ved 37 ° C i 1 time for å sikre oppløsning og homogene blandinger. Hold caps over vannflaten for å unngå muligheten for forurensning av løsninger fra badetvann.
  5. Installering av PEG fase løsningen i en steril, plastsprøyte, og fører den gjennom et sprøytefilter med 0,2 pm porestørrelse for å fjerne urenheter.
    Merk: Fyll sprøyten med PEG løsning, plasser den i innsatsen av filteret på toppen av en konisk rør og bruke makt, sakte presse løsningen gjennom filteret. Det er normalt å oppleve motstand mot bevegelse av sprøytestempelet. Mindre tap av polymeroppløsningen forekommer som noen av oppløsningen vil forbli i filteret, men polymerkonsentrasjonen vil ikke endres.
  6. Pipetter 10 ul av den DEX fase løsning og fortynne den i 10 ul av medium i et separat rør til å føre til 6,4% (w / v) DEX faseoppløsning. Sug av 100 ul av PEG-fasen løsning og avgi den i en petriskål.
    1. Dispensere 0,5 mL av 6,4% (w / v) DEX faseoppløsning inn i PEG-fase løsning. Bekreftet visuelt vellykket ATPS formasjonen ved å observere en DEX fall under et mikroskop. Drop grensenskal være synlig, hvilket indikerer tilstedeværelsen av to stabile, separate vandige faser.
  7. Oppbevar lager vandig PEG og DEX fase løsninger i 4 ° C inntil bruk.
    Merk: Det anbefales at polymer løsninger er forberedt frisk før hvert forsøk og brukes innen 24 timer lagringsplass.

2. Forberedelser til utskrift av Cancer Cell Spheroids

  1. Dyrke kreftceller av interesse (f.eks MDA-MB-157 brystkreftceller) til en 90% -100% sammenflytende enkeltlag. For MDA-MB-157-celler ved å bruke et medium bestående av DMEM inneholdende 10% FBS, 1% glutamin og 1% antibiotikum.
    1. Høste celler ved hjelp av en celle dissosiasjon buffer (i henhold til produsentens protokoll) og laste den suspensjonen i en 15 ml konisk. Sentrifuger det i 5 min ved 173,3 xg, fjerne supernatant, og resuspender celler i en ml komplett vekstmedium.
  2. Veieceller mot en hemocytometer og telle dem til å beregne nødvendig antallav celler for en ønsket sfæroide celletetthet. En konfluent monolag av MDA-MB-157-celler dyrket i en T75-kolbe gir vanligvis ~ 7 6 x 10 celler.
    Merk:. Nødvendig celletetthet for en dråpe volum for å generere en enkelt celleklump vil avhenge av celletype 22 For eksempel kan en tetthet på 1,5 x 10 4 eller større for MDA-MB-157-celler er anbefalt per 0,3 mL DEX fase dråpe til sørge for dannelsen av en enkelt celleklump.
  3. Sentrifuger cellene for en andre gang i 5 minutter ved 173,3 xg og resuspender dem i et passende volum av vekstmedium for å konsentrere suspensjonen til en ønsket celletetthet.
    Merk: For eksempel hvis 7 x 10 6 kreftceller ble høstet, det totale volumet av cellesuspensjon som kreves for å danne en sfæroide på 1,5 x 10 4 celletetthet i et 0,3 mL DEX fase fallet vil være 140 ul. Men på grunn av fortynning med DEX faseoppløsning i det neste trinn, bare bruke 70 ul av cellekulturmedium for å resuspendere cellene.
    4. 4 celletetthet sfæroide, blir 70 ul av den DEX faseoppløsning tilsatt til 70 ul av cellesuspensjonen.
  4. Bland cellesuspensjonen for å sikre jevn fordeling av celler og blanding av DEX-løsning. Pipettering opp og ned skal det gjøres forsiktig for å unngå bobledannelse.

3. Forberedelse til utskrift av Co-dyrkede Spheroids

  1. Vokser kreftceller (f.eks, MDA-MB-157 humane brystkreftceller) og støttelegemer (f.eks, humane fibroblaster) til en 90% -100% sammenflytende monolag. Høste hver celletype ved hjelp av en celle dissosiasjon buffer (i henhold til produsentens protokoll).
    1. Laste hver suspensjon i en 15 ml konisk, sentrifuger dem i 5 min ved 173,3 xg, og aspirer supernatant fra hver konisk. Suspender cellene i hver konisk i en ml komplett growth medium.
      Merk: Fluorescerende fargestoffer som for eksempel Calcein AM (levende celle flekk) og atomfargestoffer (Hoechst) kan brukes til å skille mellom de to celletyper.
  2. Laste hver celletype separat på en hemocytometer, og telle dem til å beregne det nødvendige antall av hver celletype for et ønsket forhold av kreftceller til å støtte celler ko-dyrket sfæroider. Sammenflytende monolag av MDA-MB-157-celler og fibroblaster dyrket i T75-kolber vanligvis gi ~ 7 6 x 10 og 6 x 10 ~ 6 celler, respektivt.
  3. Tilsett riktig volum fra suspensjonen av bære celler til kreftceller suspensjonen for å gi et ønsket forhold mellom antall av to celletyper. For eksempel bruke en ratio på 50 kreftceller til en fibroblast celle.
  4. Sentrifuger den koniske inneholdende det blandede cellesuspensjonen i 5 minutter ved 173,3 xg og resuspender cellene i et egnet volum for å gi endelige tetthet som består av like volumer av vekstmedium og på 12,8% (w / v) vandig DEXfaseoppløsning (fremstilt i 1.2).
  5. Forsiktig pipettere den resulterende cellesuspensjonen opp og ned for å sikre homogeniteten av suspensjonen.

4. Utskrift av svulst Spheroids inn i en 96-brønns plate

  1. En dag før forsøkene belegge ikke-behandlede, rundbunnede 96-brønners plater med 1% (w / v) Pluronic ved 37 ° C i 24 timer. Dette belegget hindrer celle vedlegg over kulturen periode.
  2. Dispenser 50 ul av den filtrerte 5% (w / v) vandig PEG fase i hver brønn av en 96-brønns plate (destinasjon plate).
  3. Ved hjelp av en pipette, bland cellesuspensjonen (fremstilt i trinn 2 eller trinn 3 for mono- og ko-kultur, henholdsvis) og tilsett 20 pl av suspensjonen til hver andre brønn fra en kolonne i en 384-brønners plate (kilde plate) .
  4. Slå på væskebehandling og "hjem" til pipettering hodet for å registrere koordinatene. Deretter kompilere en tidligere definert protokoll (nedenfor i 4.6) for å sikre laboratorie-utstyr og parametere er definert riktigly. Denne "homing" skritt kan være forskjellig for ulike likvide handlers.
    Merk: Strømmen av protokollen vist trinn for trinn nedenfor i 4.6, vil være like, uavhengig av robotvæskebehandler benyttet; Imidlertid kan programmeringsgrensesnitt se forskjellig på grunn av bruk av forskjellige programvare.
  5. Plassere kilden plate, bestemmelsesplaten, og pipettes boksene på definerte posisjoner på arbeidsstasjonen av væskebehandleren som vist i figur 1.
  6. Utføre protokollen som inkluderer følgende trinn:
    1. Belastningen en kolonne av fat fra pipettering leder av væskebehandler med å blande pipetter (8 tips) fra arbeidsstasjonen (figur 1).
    2. Bland cellesuspensjonen i brønner av kildeplaten (figur 1). Velg et blandevolum som er mindre enn cellesuspensjonen volum i brønner for å unngå bobledannelse.
    3. Eject tips til en tom avfalls tips boksen (figur 1). Belastningen en kolonne av fat fra pipettering hodet med 10 mikroliter dispensepipettespisser (figur 1).
    4. Sug av 0,3 mL av cellesuspensjonen fra kilden platen (figur 1) i hver pipettespiss.
    5. Tilsett cellesuspensjon i brønner på en kolonne av bestemmelsesplaten (figur 1). Bruk en dispenseringshøyde på 0,5 mm og en dispenseringsstrømningshastighet på mindre enn en mikroliter / sek.
    6. Gjenta trinn 4.6.1 gjennom 4.6.6 inntil kolonne-by-kolonne utskrift i hele destinasjonen plate er ferdig.
  7. Ta forsiktig målet plate fra arbeidsstasjonen flate og legger den i en fuktig inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2. Vedlikeholde platen horisontalt når du bærer den i kuvøse for å unngå å forstyrre av DEX fase dråper som inneholder celler.
  8. Platen inkuberes i 24 timer for å tillate aggregering av cellene inn i en sfæroide innenfor DEX fasefallet.
<p class = "jove_title"> 5. Drug Treatment of Cancer Cell Spheroids

Vær oppmerksom på at følgende protokoll er for en 4-dagers behandling og inkluderer en fornyelse med frisk stoffet etter dag 2. Det kan modifiseres for andre behandlingsperioder.

  1. Bekreftet visuelt sfæroide dannelse i 96-brønners plater etter 24 timer. Hvis nødvendig, bilde brønner for måling av størrelsen av kulene ved å midle de minste og største diameter av hver sfæroide.
  2. Klargjør stamløsning av et ønsket stoff ved oppløsning i et løsningsmiddel som er anbefalt av produsenten ved et forutbestemt oppløselighet konsentrasjon. For eksempel oppløses cisplatin i vann ved 2 mg / ml.
    Merk: Beskytt stamløsning av stoffet fra lys hvis stoffet er lys-sensitive.
  3. Ved hjelp av seriefortynning teknikk, fremstille fortynnede legemiddelkonsentrasjoner med cellekulturmedium fra forrådsoppløsning fremstilt i det foregående trinnet. Hver fortynning bør gjøres to ganger den ønskede konsentrasjon. Diloppløsnings-forhold vil variere avhengig av utgangs lager konsentrasjon og ønsket arbeidskonsentrasjoner.
  4. Tilsett 50 pl av medikamentløsning fremstilt i det foregående trinn til hver brønn. Dette kan gjøres robot eller ved manuell pipettering.
    Merk: Hver medikamentkonsentrasjon blir fortynnet i en halv til den ønskede konsentrasjon med 50 ul vandig PEG-fase som allerede er i hver brønn.
    1. Bruke kuler fra to kolonner i en 96-brønns plate (n = 16) for hver konsentrasjon.
    2. I kontrollbrønner, tilsett bare 50 ul av frisk kulturmedium til de eksisterende 50 ul av den vandige PEG fase.
  5. Inkuber sfæroider med legemidlet i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2, beskyttet mot lys.
  6. Etter 48 timers inkubasjon fremstille friske fortynninger av medikamentet ved ønskede konsentrasjoner og fornye stoffet ved tilsetning av 50 ul av frisk medikamentløsning til hver brønn.
    Merk: Brønnene allerede inneholder den ønskede legemiddelkonsentrasjonen fra det første stoffet treatment. Derfor er i denne fornyelsen fasen blir hver konsentrasjon fremstilles ved den ønskede konsentrasjon, siden ingen fortynning vil oppstå.
  7. Inkuber kuler med medikamentet for en annen 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2, beskyttet mot lys.

6. Analyse av Cellular levedyktighet i Spheroids

  1. Etter 48 timers inkubasjon med fornyet medikament (dvs. total tid for behandling av sfæroider med en legemiddel 4 dager), å måle det totale volum av medium i en brønn ved hjelp av manuell pipettering.
    Merk: Typisk volum i en brønn er ~ 140 mL (en liten nedgang oppstår på grunn av fordampning).
  2. Beregn volum av cellelevedyktighet reagens (f.eks PrestoBlue) som 10% konsentrasjon av den totale brønnvolumet. Legge dette volum av cellelevedyktighet reagens til hver brønn.
    Bemerk: Med en eksisterende medievolum på 140 ul i en brønn, blir et volum på 15,6 ul som kreves for å gi en 10% konsentrasjon av den totale brønnen. Dette er beregnet ved ådele den eksisterende medievolumet av 9 (140 mikroliter / 9 = 15,6 mL).
  3. Inkuber platen med cellenes levedyktighet reagens tilsatt til hver brønn i 6 timer ved 37 ° C, beskyttet mot lys.
  4. Plassere platen i en mikroplateavleser og lese fluorescens-signal ved 560 nm og 590 nm eksitasjon og emisjonsbølgelengder på henholdsvis.
  5. Beregne prosent levedyktigheten til cellene i kuler ved å normalisere det fluorescerende signalet fra behandlede brønner til det i kontrollbrønnene etter gjennomsnitt av verdiene fra de samme behandlingsforhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den arbeidsstasjon av robotvæskebehandleren, er vist i figur 1. Den pipettering hodet og alle stasjoner som brukes i robot trykking av sfæroider i avsnitt 4.6 blir merket. Bildet viser bruken av to forskjellige stasjoner for tippe bokser (ett sett av tips for blanding og det andre settet for å aspirere / dispensering av cellesuspensjonen-DEX vandige faseblanding). Hele oppsettet er plassert innenfor en standard biologisk trygghetskabinett for å opprettholde sterilitet. Figur 2 viser en skjematisk fremstilling av den "fotball" prosessen med den vandige to-fasesystem. En pipettespiss lastet med cellesuspensjonen i den vandige fase DEX (blå, mønstring fase) blir senket ned i en rundbunnet brønn på en 96-brønners plate inneholdende den vandige PEG fase (rosa, nedsenking fase) for å dispensere dens innhold i nærheten brønnbunnen. Den resulterende DEX fase dråpe begrenser kreftceller fra å spre seg og oppmuntrer celle-celle-interaksjoner som føreraggregering av celler og sfæroide dannelse. Sfæroide formasjon er spontan og skjer i løpet av 24 timers inkubasjon, som vist i den eksperimentelle bilde på figur 2. I praksis blir dette sfæroide trykking utført kolonne-for-kolonne i 96-brønners plater. Etter at kulene danner, blir kulturmediet fornyes ved direkte tilsetning av friskt medium, omdanne den to-fase-system til et enkelt vandig fase. Denne overgangen er på grunn av reduksjon i konsentrasjonen av PEG og DEX under en terskelkonsentrasjon som er nødvendig for separering av vandige PEG og DEX faser.

Dispensering fra en konvensjonell luftforskyvningsmekanisme pipettering av væskebehandleren ble optimalisert parametrisk, og det ble funnet at et utleverings høyde på 0,5 mm, en dispenseringsstrømningshastighet på mindre enn en mikroliter / sek, etterfulgt av dispensering av 0,2 mL av pre-suget luftvolum produserer den mest konsekvente størrelsen av vandig DEX synker, og dermed sfæroider. 23 Figur 3a disspiller fordeling av diameteren av 96 kuler fra en plate med en gjennomsnittlig diameter på 332 ± 31 um. Tidligere erfaring viser at denne metoden vanligvis genererer sfæroider med 8% -10% standardfeil rundt den midlere diameter. Figur 3b viser frekvensfordelingen av diameteren av kuler av samme plate som på figur 3a, og viser at diametrene er normalfordelt.

Deretter ble potensialet av denne tilnærmingen for forbindelse screening i standard 96-brønners plater og analyse av cellulære responser i de samme plater, uten behov for å overføre kuler til nye plater vist. Figur 4 viser en doseavhengig studie av levedyktigheten av MDA -MB-157 bryst kreft celleklumper behandlet med en klinisk kjemoterapeutisk stoff, cisplatin. Medikament-behandlede og kontroll sfæroider ble inkubert med en kommersiell PrestoBlue reagens (celleviabilitet reagens). Enzymatisk aktive celler redusert reagent og resulterte i en endring i media farge og en forskyvning i det fluorescerende signal. Skiftet i signalet var størst med levende celler (for eksempel i kontroll kuler). Levedyktigheten av kreftceller i sfæroider avtok med økende medikamentkonsentrasjon over 1 pM. Denne testen resulterte i en 50% dødelig dose medikamentkonsentrasjon på LD50 = 4,67 uM.

Denne vandige tofasesystemet teknologi for 3D kultur tillater enkel produksjon av mer realistiske tumormodeller ved å inkludere andre komponenter av cellulære mikromiljøer som støtter stromale celler. Det har vist seg tidligere at blant annet stromalceller i 3D kulturer modulerer vekst, spredning, og invasjonen av kreftceller. 33-35 som en proof-of-concept eksperiment, co-kultur kuler ble generert ved å kombinere MDA-MB-157 menneskelig bryst kreftceller og humane fibroblaster på et forhold på 50:. 1. 36 Før forsøkene ble MDA-MB-157 og fibroblast celler fargetmed et atom fargestoff (blå) og levende celle fargestoff (grønt), respektivt, for å tillate påvisning av celler i fluorescerende bilder. Figur 5a viser fluorescerende og fasebilder av ko-kultur sfæroider med en tetthet på 1,5 x 10 4 celler, og en 50 .: 1 forhold av kreftceller og fibroblaster Figur 5b viser kontroll sfæroider av MDA-MB-157-celler for sammenligning. Denne fremgangsmåten gjør det mulig å evaluere effekten av stromale celler på ulike fenotyper av kreftceller.

Figur 1
Figur 1. Væskehåndtering Platform. Den flytende handler består av stasjoner hvor miksing tips, som ekspederer tips, avfall tips boksen, kilde plate, og reisemålet plate steder er plassert. Plasseringen av hver stasjon er definert i protokollen. Blanding tips er lastet inn på en kolonne av pipettering hodet og brukes til å blande løsningen av vandig DEX fase inneholdende celler i kildeplaten. Disse tipsene er deretter kastes i avfalls tips boksen og utleverings tips er satt på den samme kolonnen i pipettering hodet. Disse tips aspirere 0,3 ul av den vandige DEX fase inneholdende celler fra kilden platen og dispensere den i destinasjon-plate for å danne celle-inneholdende dråper av DEX fase innenfor nedsenking PEG-fasen allerede er i destinasjon platebrønnene. Endelig disse tipsene er også kastes i avfalls tips boksen for å fullføre en syklus av utskrift.

Figur 2
Figur 2. Spheroid formasjonen. Væskebehandleren dispenserer 0,3 ul av den vandige fasen DEX (blå) inneholdende celler (grønn) inn i en brønn inneholdende den vandige PEG-løsning (rosa). Dette resulterer i dannelsen av en sfæroide etter 24 timers inkubasjon, som vist i bildet til høyre. Skala bar 200 mikrometer.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Spheroid Konsistens av data. (A) Fordeling av diameteren av sfæroider, målt i en 96-brønns plate, representerer hvert punkt en sfæroide. (B) Frekvens fordeling av diametrene viser normalfordeling av dataene.

Figur 4
Figur 4. Drug Response of Spheroids. Levedyktigheten av cellene i MDA-MB-157 brystkreft celleklumper reduseres med økning i konsentrasjon av cisplatin i løpet av 1 nM-200 pM område. Den stiplede linjen er en sigmoidal form til levedyktighet data.

Figur 5
Figur 5. Co-Kultur Spheroids (a) Fluorescent (til venstre) og fase-kontrast (høyre) bilder av kuler av MDA-MB-157 brystkreft celler (blå) co-kultivert med fibroblaster (grønn) på en 50:. 1 forhold. (B) Spheroids av MDA-MB-157-celler er vist for sammenligning. Skala bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kuler presentere en realistisk modell for å bedre forstå svulst fysiologi og narkotika effekt og gi et nyttig verktøy for anti-kreft medisiner. Slike søknader vil ha stor nytte av enkle spheroid generasjon og vedlikeholdsteknikker som kun krever standard laboratorie-utstyr, væskehåndtering verktøy og screening utstyr. Anvendelsen av et vandig tofasesystem for å spontant aggregerte kreftceller i fallet fase tillater effektiv produksjon og vedlikehold av sfæroider med robotvæskebehandlere, og in situ-behandling og endepunkt analyse av cellulære responser med kommersielle reagenser og verktøy. Dermed er denne teknologien en stor fordel i forhold til eksisterende tilnærminger av 3D kreftcellekulturer og presenterer en screening plattform for å fremskynde medisiner.

Generere ensartede store kuler i en mikro-brønns plate er avgjørende for høy gjennomstrømning screeningprogrammer for å sikre en lik baseline cellular acaktivitetsnivå i alle kulene. Ved hjelp av flytende behandlingsprogrammer med en luftfortrengnings pipettering mekanisme, er det viktig å optimere utleveringsprosessen gjennom kvantifisering av virkningen av nøkkelvæskehåndteringsparametere (dispensere høyde, dispensere strømningshastighet, og pre-aspirert luft i volum) ved utlevering av den vandige fasen DEX . Denne optimalisering lar pipettering hodet for å feie ut den viskøse DEX fase løsning og kreftceller i brønner og produsere homogene kuler. Selv om spesifikke mengder for disse tre parametrene er fastsatt i protokollen for SRT Bravo flytende handler, bør en lignende tilnærming være ansatt med andre flytende handlers å bestemme optimale dispenser tilstander som medfører konsekvent DEX fase dråpestørrelse utlevert til nedsenking PEG fasen. I tillegg er det mulig å bruke 96 spisser, og for samtidig å skrive ut kuler inn i alle 96 brønner. Dette er imidlertid i vesentlig grad øker antall celler som kreves for å fylle kildeplaten medvandige DEX fase inneholder celler. Uavhengig av valg av kolonnevis eller hel-plate trykke nærmer seg, er det viktig å blande innholdet av kildeplaten forut for aspirasjon trinn. Dette sikrer at den tette cellesuspensjon i den DEX-fasen er homogen og minsker variasjoner i størrelsen av kulene.

Flere studier viser at kreftcelleklumper ligne flere viktige egenskaper av avaskulære tumorer så som morfologi og diffusjonsbegrensninger av reagenser; dermed de presenterer et fysiologisk relevant modell for evaluering av effektiviteten av nye og konvensjonelle forbindelser mot kreftceller i forhold til tradisjonelle monolag cellekulturer. 8,17,18,21,23,37 Det er vist at den vandige tofasesystemet tilnærming for å produsere sfæroider tillater praktisk medikamentscreening i samme plate, ganske enkelt ved tilsetning og fornyelse av en medikamentforbindelse ved ønskede tidspunkter og automatisert screening av cellelevedyktigheten ved anvendelse av en standard mikroplateleser. Detteer en stor fordel i forhold til teknikker som hengende dråper som ville kreve overføring av sfæroider til en standard plate for analyse av cellulære responser til legemidler. 21 I tillegg er det kjent at bæreceller i svulsten mikromiljøet og deres interaksjoner med kreftceller er innblandet i forskjellige ondartede fenotype av cancerceller. 33-35,38,39 Derfor er evnen til å generere ko-kultur sfæroider av kreft og stromale celler ved hjelp av vandige to-faseteknologi vil bidra til å evaluere innflytelsen av bære celler av tumormikromiljø på responser kreft celler til ulike behandlinger. Co-kultur eksperiment utført i denne studien fungerer som en proof-of-concept at denne teknologien kan lykkes generere kuler som inneholder kreftceller og stromale celler. Framtidige studier vil utnytte denne muligheten og undersøke differensial karakteristikker av mono- og co-dyrkede kuler som sprednings- og narkotika svar. I tillegg har denneteknologi tilbyr en plattform for å nærmere etterligne in vivo svulstens mikromiljø ved å inkludere andre stromal komponenter i svulsten modell. 40

I sammendrag, muliggjør denne protokollen spontan dannelse av sfæroider i 96-brønners plater uten bruk av ytre krefter. Tilpasse teknikken til en robot flytende handler forbedrer hastigheten og effektiviteten av spheroid produksjon i en standard høy gjennomstrømning format. Kompatibiliteten til teknologi med kommersiell bildebehandling og analyse analyserer plattformer gjør bruk av ulike virkemidler i akademiske og industrielle laboratorier. For fremtidige søknader, vil denne protokollen effektivisere narkotika screening med 3D kreftcellekulturer en rutine teknikk. I tillegg kan denne tilnærmingen enkelt endres til å danne kuler i forskjellige størrelser, forskjellige celletyper, ulike kombinasjoner av kreft og stromale celler i co-kultur kuler, og skaleres opp til høyere throughput mikro-brønners plater to ytterligere fremskynde anti-kreft narkotika screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000 Sigma-Aldrich 94646
Dextran, MW: 500,000 Pharmacosmos 5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6429
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12306C
Glutamine Life Technologies 35050-061
Antibiotic Life Technologies 15240-062
Clacein AM Life Technologies C3100MP
Hoechst Life Technologies 33342
Cisplatin Spectrum Chemicals 15663-27-1
PrestoBlue Life Technologies A-13261
Pluronic F-108 Sigma Aldrich 542342
Disposable Tips (10 µl) Fluotics C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl) Fluotics C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates Nunc 268200
Equipment
Liquid Handler Agilent Technologies SRT Bravo
Microplate Reader Biotek Instruments Synergy H1M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
  2. Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
  3. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  4. Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
  5. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
  6. Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
  7. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
  9. Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
  10. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  11. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
  12. Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
  13. Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
  14. Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
  15. Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
  16. Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
  17. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
  18. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
  19. Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  20. Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
  21. Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
  22. Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
  23. Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
  24. Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
  25. Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
  26. Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
  27. Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
  28. Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
  29. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
  30. Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
  31. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
  32. Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
  33. Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
  34. Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
  35. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
  36. Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
  37. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
  38. Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
  39. Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
  40. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).

Tags

Bioteknologi Cancer Cell Spheroid 3D Kultur Robotic høy gjennomstrømning Co-Culture narkotikaundersøkelser
Robotic Produksjon av Cancer Cell Spheroids med en vandig To-fase system for Drug Testing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D.,… More

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D., Tavana, H. Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing. J. Vis. Exp. (98), e52754, doi:10.3791/52754 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter