Introduction
細胞ベースのアッセイを開発し、新たな抗癌薬の発見のための重要なツールを提供する。1,2は、歴史的に、癌細胞の単層培養物は、癌細胞の特定の型に対する候補化合物の有効性を調査するために使用されてきた。標準培養プレートで単層培養のメンテナンスの容易さ、試薬の添加のための商業のロボットのツールを標準プレートの互換性、および化学物質に対する細胞応答の下流分析のためのスクリーニング装置では、2Dの文化に魅力的なツールをレンダリングする主要な利点があります薬物試験のために3残念ながら、単層細胞アッセイは、多くの場合、薬剤の開発及び発見非常にコストのかかる処理を行う、生体内での化合物の有効性を予測することができない。4,5製薬企業および学術単位で多大な投資と努力にもかかわらず、唯一〜1％臨床試験中の抗がん剤は、承認されたのしたがって、7。 インビボでの 2D培養癌細胞の複雑な3D環境との間の6視差が単層培養システムの主要な欠点である。過去20年間のFDAによって、より密接に似ている設定において腫瘍細胞に対する候補化合物のスクリーニング3次元腫瘍環境は、新規な化学療法薬の開発を促進することができる。8
癌細胞スフェロイドは、 インビトロで 、関連する3D腫瘍モデルを提示する。9,10スフェロイドは、スピナーフラスコのような技術を使用して非接着性表面上または懸濁液中の癌細胞の自発的または誘導されたアセンブリを介して形成するコンパクトなクラスタ、液体オーバーレイ、微細加工されたマイクロある良くアレイ、マイクロフルイディクス、および懸滴11-16スフェロイドは、中心ゾーンにキージオメトリおよび酸素の制限された輸送を含む、固形腫瘍の特徴、栄養素、薬物化合物を模倣する。それ故に、彼らはより密接に薬物responを再生成それ固形腫瘍の単層培養物と比較して17〜19本の著しい利点にもかかわらず、スフェロイドは、日常的に、癌細胞に対する化合物のスクリーニングのために使用されていない。市販のロボット工学およびスクリーニング/イメージングツールと互換性があり、標準的なハイスループット設定で均一なサイズのスフェロイドを製造する難しさは、医薬品開発パイプラインに回転楕円体の文化の取り込みを妨げる。カスタム材料とプレートが最近、このニーズに対応するために市販されるようになってきたが、コストの考慮事項は、その普及を阻止する。
新しいハンギングドロッププラットフォームと微細加工されたマイクロウェルを使用し、高スループットで一貫性のあるサイズのスフェロイドを生産する能力を持つ二つの主要な技術。13,16,20しかし、両方のアプローチは、特別なプレートと製作するのに費用およびエンドユーザーのための不便なデバイスを必要とする中核研究センターおよび製薬産業、ほとんどの主要EFで新しい抗癌薬の発見のための砦がなされる。ドロッププレートをぶら下げの最近のデザインの細胞含有液滴の安定性のいくつかの改善にもかかわらず、プレートの唯一の他のすべての穴はまだ滴の拡散/マージを回避するために、培養中に使用されます。16。これはかなり実験的なスループットが低下します。薬物添加と更新は手動またはロボットピペッティングでは困難であり、このプレート構成は、プレートリーダーのような従来のスクリーニング装置と容易に互換性がないため、スフェロイドは生化学分析のための標準的なプレートに転送する必要がある。21マイクロウェルはまた、ソフトリソグラフィーを使用して製作制御されたサイズのスフェロイド生産を可能にする。13,20しかし、標準ペッティングツールと、このプラットフォームの非互換性は、単一の処理条件にすべてのスフェロイドを暴露、異なる薬剤化合物/濃度の個々のスフェロイドの治療を防ぎます。したがって、この方法は、高に適していない複数の化合物/濃度の同時試験を必要とスループット化合物スクリーニング。
これらの障害を克服するために、標準的な96ウェルプレート中で一貫してサイズの癌細胞スフェロイドの高スループット生産のための新しい技術が開発されている。22,23アプローチは（ポリエチレングリコールポリマー水性二相系（ATPS）に基づいている相形成ポリマーとしてPEG）およびデキストラン（DEX）。24 ATPSs最近、新規な細胞の様々な高度に水性媒体中の細胞に細胞微細及び生物学的試薬の局所的な送達を可能にするために生物学的用途に利用されている。25-32を形成する回転楕円体、癌細胞は、水性DEX相と混合し、得られた懸濁液のサブマイクロリットルの滴を十分に浸漬水PEG相溶液を含む中にピペットされる。低下はスフェロイドの形成を容易にするために、浸漬相境界細胞からの非混和性のままである。インプortantly、高度に水性の浸漬段階は、回転楕円体の細胞に栄養を提供し、メディアオスモル濃度及び薬物濃度の変動の変化を引き起こすいくつかの他のアッセイに共通のメディア蒸発の周知の問題を最小限に抑える。この技術は、回転楕円体の生産と、標準96ウェルプレート中で、市販の試薬ピペッティング·ツールを使用して薬物治療を可能にする。重要なことには、スフェロイドの細胞応答の分析は、標準的な生化学アッセイおよびプレートリーダーを使用して、同じプレートで行われる。ロボット液体ハンドリングへのアプローチのATPSと適応での作業のしやすさは、モノカルチャーと共培養の両方のハイスループットの生成が簡単な実験技術をスフェロイドなります。この新しいアプローチは、改良された試験のスループットと試験化合物とのReduの費用対効果（数が増加して薬剤の開発と発見のプロセスに癌細胞スフェロイドの統合に向けた大きな前進となりますCED試薬消費量）と効率（）ハンズオン時間を短縮する。
ATPSアプローチを用いて、96ウェルプレート中の癌細胞スフェロイドのロボットの生産のための詳細なプロトコルを以下に記載する。また、得られたスフェロイドおよび商業生化学的アッセイを用いて細胞応答の下流の分析の薬物治療の詳細が提示される。
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Protocol
高分子水性二相系の調製（ATPS）
- ポリエチレングリコール（PEG）（MW：35000）を0.5g秤量し、水性PEG相（w / v）の5％を10ml調製するための無菌の15mlの円錐形に完全増殖培地9.5 mlに追加します。
注：最初のポリマーを添加した後、培地の残量が円錐形の壁へのポリマーの付着を最小限にし、ポリマーがより速く溶解するのに役立ち、続いて円錐形に培地の半分を加える。 - デキストラン（DEX）の0.128グラム（MW：500,000）計量し、12.8％（w / v）の水DEX相から1ミリリットルを準備し、滅菌1.5ミリリットルのマイクロチューブに完全増殖培地の0.872ミリリットルに追加します。
- 約1分間ボルテックス両方のソリューションは、媒体中にポリマーを溶解した。
- 溶解および均質の混合物を確保するために、1時間37℃の水浴中で両溶液を保つ。浴からの溶液の汚染の可能性を回避するために、水位上記キャップを保つ水。
- 無菌のプラスチック製シリンジにPEG相溶液を充填し、不純物を除去するために0.2μmの孔径のシリンジフィルターを介して通過する。
注：、PEG溶液を注射器を埋める円錐管の上にフィルタの挿入に入れて力を利用して、ゆっくりとフィルターを通してソリューションを押してください。これは、シリンジプランジャの移動に対する抵抗を経験することは正常です。解決策のいくつかは、フィルタに残るようにポリマー溶液のマイナー損失が発生しますが、ポリマー濃度は変化しません。 - ピペット10 DEX相溶液μlの別のチューブに培地10μl中に希釈は、6.4％（w / v）のDEX相溶液を生じた。 PEG相溶液を吸引し、100μlのペトリ皿にそれを分配する。
- PEG相溶液中にDEX相溶液（w / v）の6.4％の0.5μLを分注する。顕微鏡下で視覚的にDEXの低下を観察することによって成功したATPSの形成を確認。ドロップ境界二つの安定、独立した水相の存在を示す、表示されたままにする必要があります。
- 使用するまで4℃で株式水性PEGとDEX相溶液を保管してください。
注：これは、ポリマー溶液が各実験の前に新たに調製し、貯蔵の24時間以内に使用されていることをお勧めします。
印刷癌の細胞スフェロイド2.準備
- 90％-100％のコンフルエントな単層への関心（ 例えば、MDA-MB-157乳癌細胞）の癌細胞を成長させる。 MDA-MB-157細胞では、10％FBS、1％グルタミン、および1％抗生物質を含むDMEMから構成される培地を使用する。
- （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を用いて細胞を回収し、15mlのコニカルに懸濁液を読み込む。 、173.3×gで5分間、それを遠心上清を除去し、細胞を再懸濁する完全増殖培地の1ミリリットル中。
- ロードセル血球計数器上に、それらをカウントは、必要な数を計算する所望のスフェロイドの細胞密度の細胞。 T75フラスコで成長させたMDA-MB-157細胞のコンフルエントな単層は、通常は〜7×10 6個の細胞を提供します。
注：単一のスフェロイドを生成する液滴体積に必要な細胞密度は、細胞型に依存する。例えば22、MDA-MB-157細胞について×10 4以上1.5の密度は、0.3μlのDEX相滴あたりの推奨されるシングル回転楕円体の形成を確実に。 - 173.3×gで5分間再度遠心し、細胞および所望の細胞密度に懸濁液を濃縮するために、増殖培地の適切な容量で再懸濁します。
注：7×10 6個の癌細胞を回収した場合は、0.3μlのDEX相ドロップ1.5×10 4個の細胞密度のスフェロイドを形成するのに必要な細胞懸濁液の全体積は140μlであろう。しかし起因する次のステップでDEX相溶液で希釈し、細胞のみを再懸濁し、細胞培養培地70μlのを使用しています。 - 完全に細胞およびDEX溶液の混合の均一な分布を確実にするために、細胞懸濁液を混合する。ピペット上下に気泡形成を防ぐために静かに行うべきである。
共培養スフェロイドの印刷用3.準備
- 90％-100％コンフルエント単層に癌細胞（ 例えば、MDA-MB-157ヒト乳癌細胞）および支持細胞（ 例えば、ヒト線維芽細胞）を成長させる。 （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を使用して、各細胞型を回収する。
- 各円錐から173.3×gで、かつ吸引上清で5分間、それらを遠心分離、円錐形の15ミリリットルに各サスペンションをロードします。完全なGの1ミリリットル中の各円錐形の細胞を再懸濁rowth媒体。
注：そのようなカルセインAM（生細胞染色）および核染料（ヘキスト社）のような蛍光染料は、2つの細胞型を区別するために使用することができる。
- 各円錐から173.3×gで、かつ吸引上清で5分間、それらを遠心分離、円錐形の15ミリリットルに各サスペンションをロードします。完全なGの1ミリリットル中の各円錐形の細胞を再懸濁rowth媒体。
- 血球計数器上に別々に各細胞型をロードし、共培養スフェロイドにおける支持細胞に対する癌細胞の所望の比率は、各細胞型の必要数を計算するためにそれらを数える。 T75フラスコ中で増殖させたMDA-MB-157細胞および線維芽細胞のコンフルエントな単層は、通常はそれぞれ、〜7×10 6と〜6×10 6個の細胞を与える。
- 2つの細胞型の数の所望の比を与えるために、癌細胞懸濁液に支持細胞の懸濁液から正確なボリュームを追加する。例えば、1線維芽細胞に50癌細胞の比率を使用。
- 遠心増殖培地の等量を含む最終濃度をもたらすのに適切な容量及び12.8％（w / v）の水性DEXで173.3×gで再懸濁した細胞で5分間混合し、細胞懸濁液を含有するコニカル（1.2で調製）相溶液。
- 穏やかに懸濁液の均一性を確実にするために上下に得られた細胞懸濁液をピペット。
96ウェルプレート中に腫瘍スフェロイドの4.印刷
- 前の24時間、37℃で1％の実験コート非処理、丸底96ウェルプレート（w / v）のプルロニックに一日。このコーティングは、培養期間中、細胞付着を防止する。
- 96ウェルプレート（宛先プレート）の各ウェル中に濾過し、5％を50μl（w / v）の水性PEG相を分注する。
- ピペットを用いて、細胞懸濁液（それぞれ、モノ - 及び共培養のためにステップ2またはステップ3で調製）を混合し、384ウェルプレートの1列（ソースプレート）からの他のすべてのサスペンションの20μlを添加する。
- 液体ハンドラと "ホーム"の座標を登録するペッティングヘッドをオンにします。その後、実験器具を確実にするために（4.6未満）以前に定義されたプロトコルをコンパイルし、パラメータが正しい定義されていますLY。この「ホーミング」のステップは、異なる液体ハンドラの異なる場合があります。
注：4.6のステップ·バイ·ステップを以下に示したプロトコルの流れは、関係なく、使用されるロボット液体ハンドラの同様であろう。しかし、プログラミングインターフェースは、異なるソフトウェアの使用に異なって見える場合があります。 - 図1に示すように液体ハンドラーのワークステーション上で定義された位置に、ソースプレート、目的プレート、ピペットチップボックスを配置する。
- 以下のステップを含むプロトコルを実行します。
- ロードワークステーション（ 図1）からピペットチップ（8チップ）を混合液体ハンドラのピペット操作ヘッドから樽の1列。
- ソースプレートのウェル中の細胞懸濁液（ 図1）を混ぜる。気泡形成を回避するために、ウェル中の細胞懸濁液の体積よりも小さい混合容積を選択する。
- 空の廃棄物のヒントボックス（ 図1）にヒントを取り出します。 負荷10μL分注ピペットチップとピペット操作ヘッドから樽の1列（ 図1）。
- 吸引し、各ピペットチップにソースプレートからの細胞懸濁液0.3μlの（ 図1）。
- 目的プレート（ 図1）の1列のウェルに細胞懸濁液を分注する。 0.5mmのディスペンス高さより小さい1μlの/秒の分注流量を使用する。
- 全体目的プレートに列ごとの印刷が完了するまで繰り返します4.6.6を通じて4.6.1を繰り返します。
- 注意深くステーション表面から目的プレートを除去し、CO 2を 37℃の湿潤インキュベーターに入れ、5％。細胞を含むDEX相滴の破砕を避けるために、培養器にそれを運ぶ際にプレートを水平に維持する。
- DEX相ドロップ内の回転楕円体への細胞の凝集を可能にするために24時間静置します。
以下のプロトコルは、4日間の薬物治療のためであり、これは、他の治療期間のために修飾することができる2日後に新鮮な薬物との更新を含むことに留意されたい。
- 視覚的に24時間後に、96ウェルプレート中のスフェロイド形成を確認する。各スフェロイドの最小および最大径を平均することによりスフェロイドの大きさを測定するための、画像井戸を必要に応じて。
- 所定の溶解度の濃度で製造業者によって推奨される溶媒に溶解して、所望の薬物のストック溶液を調製する。例えば、2mg / mlの水中でのシスプラチンを溶解する。
注意：薬剤が光に敏感である場合には光からの薬剤の原液を保護します。 - 連続希釈法を使用して、前の工程で調製したストック溶液から細胞培養培地で希釈した薬物濃度を準備。各希釈は二回、所望の濃度なされるべきである。 DILution比は、出発ストック濃度および所望の使用濃度に依存して変化する。
- 各ウェルに前工程で調製薬剤溶液50μlを追加します。これはロボットまたは手動ピペット操作によって行うことができます。
注：各薬物濃度を、各ウェルに既に50μlの水性PEG相によって所望の濃度に半分に希釈される。- 各濃度について、96ウェルプレート（N = 16）の2つの列からのスフェロイドを使用してください。
- 対照ウェルでは、水性のPEG相の既存の50μlに新鮮な培養培地のわずか50μlを添加する。
- 光から保護し、37℃で48時間、5％CO 2、薬物とスフェロイド培養する。
- インキュベーションの48時間後に、所望の濃度の薬剤の新鮮な希釈物を調製し、各ウェルに、新鮮な薬物溶液50μlを添加することにより薬物を更新する。
注意：ウェルは既に第一の薬剤tから所望の薬物濃度を含むreatment。希釈化は生じないので、したがって、この更新段階では、各濃度が所望の濃度で調製する。 - 光から保護し、37℃でさらに48時間、薬物および5％CO 2でスフェロイド培養する。
6.スフェロイドにおける細胞生存率の分析
- 新たな薬剤とのインキュベーションの48時間後（ すなわち 、薬物とスフェロイドの治療の合計時間は4日間）、手動ピペッティングによりつのウェル中の培地の総体積を測定する。
注：1ウェルの典型的なボリュームが（小さな減少は蒸発により発生した）〜140μLである。 - 合計ウェル体積の10％の濃度で細胞生存性試薬（ 例えば、PrestoBlue）の体積を計算する。各ウェルに細胞生存性試薬のこのボリュームを追加する。
注：ウェルの140μLの既存のメディアのボリュームでは、15.6μlのはよく全体の10％の濃度になるようにする必要があります。これは次式で計算される9（140μL/ 9 = 15.6μl）をすることで、既存のメディアボリュームを分割する。 - 光から保護し、37℃で6時間、各ウェルに添加し、細胞生存性試薬でプレートをインキュベートする。
- それぞれ、マイクロプレートリーダーでプレートを置き、560 nmおよび590 nmの励起および発光波長で蛍光シグナルを読み取る。
- 同一の処理条件からの値を平均化した後、対照ウェルと処理したウェルからの蛍光シグナルを正規化することによりスフェロイド中の細胞の生存率パーセントを計算する。
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Representative Results
ロボット液体ハンドラのワークステーションは。 図1に示すペッティングヘッドとセクション4.6でスフェロイドのロボットの印刷に使用されるすべてのステーションは、ラベル付けされている。画像は、先端の箱のための2つの異なるステーション（1混合するためのヒントのセットと、細胞懸濁液水性DEX相混合の/調剤を吸引するための第二のセット）の使用を示している。全体のセットアップは、無菌性を維持するために、標準的な生物学的安全キャビネット内に収容されている。 図2は、水性二相系で「印刷」プロセスの概略図を示す。水性DEX相（ブルー、パターニング相）中の細胞懸濁液を装填したピペットチップは、近いコンテンツを分配するために水性PEG相（ピンク、浸漬相）を含む96ウェルプレートの丸底ウエルに下げられる井戸の底。得られたDEX位相低下は分散から癌細胞を制限しもたらす細胞 - 細胞相互作用を奨励細胞やスフェロイド形成の集約。スフェロイド形成は自発的であり、 図2の実験の図に示すように、インキュベーションの24時間以内に起こる。実際には、この球状体の印刷は、96ウェルプレート中で列ごとに実行される。スフェロイドを形成した後、培養培地を単一の水相に二相系に変換し、新鮮な培地に直接添加することによって更新される。この遷移は、水性PEGとDEX相の分離に必要な閾値濃度以下PEGとDEXの濃度の低下によるものである。
液体ハンドラーの従来の空気変位ピペッティング機構の分注パラメータ的に最適化し、それを0.5mmのディスペンス高さより小さい1μlの/秒の分注流量が予め吸引風量が生産の0.2μLを分注したことが分かった最も一貫性の水性DEXの大きさに低下するため、スフェロイド。23 図3aの DIS332±31ミクロンの平均直径を有する一つのプレートから96スフェロイドの直径の分布を果たしている。以前の経験は、このアプローチは、典型的には、平均直径約8％〜10％の標準誤差でスフェロイドを生成することを示している。 図3bは、直径が正規分布していることを実証する、 図3aと同じプレートのスフェロイドの直径の度数分布を示す。
次に、新しいプレートにスフェロイドを転送する必要なく、標準的な96ウェルプレートと同じプレートでの細胞応答の分析における化合物のスクリーニングのためのこのアプローチの可能性は、実証された。 図4は、MDAの生存率の用量依存的試験を示す-MB-157乳癌細胞スフェロイドは、臨床化学療法薬シスプラチンで処理した。薬物処置およびコントロールスフェロイド商業PrestoBlue試薬（細胞生存性試薬）とともにインキュベートした。 REA縮小酵素的に活性な細胞ゲントとメディアの色と蛍光シグナルのシフトの変化をもたらした。シグナルのシフトは生細胞（ 例えば、制御スフェロイドにおける）と最大であった。スフェロイドにおける癌細胞の生存率は、1μMの上に薬物濃度の増加に伴って減少した。この試験は、LD50 = 4.67μMの50％致死量の薬物濃度をもたらした。
3D培養のために、この水性二相系の技術は、間質支持細胞などの細胞微小環境の他のコンポーネントを含めることによって、より現実的な腫瘍モデルの簡単な製造を可能にする。それは、3D培養における間質細胞を含むが、成長、増殖、および癌細胞の浸潤を調節することが以前に示されている。33-35概念実証実験、共培養スフェロイドがMDA-MB-157ヒト乳癌を組み合わせることによって生成されたように50の割合で癌細胞およびヒト線維芽細胞：1 36実験の前に、MDA-MB-157細胞および線維芽細胞を染色した。核色素（青）及び生細胞の色素（緑色）で、それぞれ、蛍光画像中の細胞の検出を可能にする。 図5aは、1.5×10 4細胞の密度と50との共培養スフェロイドの蛍光および位相画像を示す：癌細胞および線維芽細胞の比が1 図5bは、比較のためにMDA-MB-157細胞の対照スフェロイドを示す。このアプローチは、癌細胞の種々の表現型上の間質細胞の効果を評価できるようになります。
図1.リキッドハンドリングプラットフォームが。液体ハンドラは、ヒントを混合ステーション、分注チップ、廃棄物のヒントボックス、ソースプレートで構成されており、目的プレートの位置が配置されます。各ステーションの位置は、プロトコルで定義されている。ミキシングチップピペッティングヘッドの一カラムに負荷し、水DEX相の溶液を混合するために使用されているソースプレート内の細胞を含む。これらのヒントは、その後廃棄物のヒントボックスで処分されており、分注チップは、ピペット操作ヘッドの同じカラムに挿入されている。これらのヒントは、ソースプレートからの細胞を含有する水性DEX相の0.3μLを吸引し、目的プレートのウェル中にすでに浸漬PEG相内DEX相の細胞含有液滴を形成する目的プレートにそれを分配する。最後に、これらのヒントは、印刷の一周期を完了するために、廃棄物のヒントボックス内に配置されている。
図2.スフェロイド形成。液体ハンドラがよく、水性PEG溶液（ピンク）を含むへの細胞（緑）を含有する水性DEX相（青）の0.3μLを分注する。右の画像に示すように、インキュベーションの24時間後のスフェロイドの形成をもたらす。スケールバーは200μm。TPS：//www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3スフェロイド整合データ96ウェルプレートから測定されたスフェロイドの直径の（a）の分布、各点は、一回転楕円体を表す。 （b）の直径の頻度分布は、データの正規分布を示している。
スフェロイドの図4.薬物反応。MDA-MB-157乳癌細胞スフェロイド中の細胞の生存率は、1 nMで、200μMの範囲でのシスプラチンの濃度の増加に伴い減少する。破線は、生存率データにシグモイドフィットです。
図5.共培養スフェロイドは、（a）蛍光（左）と50における線維芽細胞（緑色）との位相差MDA-MB-157乳癌細胞のスフェロイドの（右）画像（青）共培養：1比率。 MDA-MB-157細胞の（b）のスフェロイドは、比較のために示す。スケールバーは100μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
スフェロイドは、より良い腫瘍生理学および薬効を理解し、抗癌薬の発見のための有用なツールを提供するための現実的なモデルを提示する。そのようなアプリケーションは、非常に、標準実験器具、液体ハンドリングツールおよびスクリーニング装置を必要とする単純な回転楕円体の生成および保守技術の恩恵を受ける。水性二相系ドロップ相内に自然に凝集体の癌細胞の使用は、効率的な生産及びロボット液体ハンドラーを用いた球状の維持、およびin situ薬物治療および市販の試薬 およびツールを有する細胞応答のエンドポイント解析にすることができます。したがって、この技術は、3D癌細胞培養物の既存のアプローチを超える大きな利点であり、創薬を迅速にスクリーニングプラットフォームを提示する。
マイクロウェルプレート内で均一なサイズのスフェロイドを生成する同様のベースラインの細胞交流を確保するために、ハイスループットスクリーニング用途のために重要であるすべてのスフェロイドにおける電率レベル。空気置換ピペット機構液体ハンドラーを使用して、鍵液体処理パラメータの効果の定量化を介して出金処理を最適化することが重要である（高さを分配流量を分配し、プレ吸引風量）、水DEX相の分注に。この最適化は、ピペットヘッドがウェルに粘性DEX相溶液と癌細胞を一掃し、均一なスフェロイドを生成することを可能にする。これら3つのパラメータのための特定の量は、SRTブラボー液体ハンドラーのためのプロトコルで決定されているが、同様のアプローチが、液浸PEG相に分配さ一貫したDEX相の液滴サイズをもたらす最適な分注条件を決定するために他の液体ハンドラと共に使用されるべきである。また、96のヒントを使用して、同時にすべての96ウェルにスフェロイドを印刷することが可能である。しかし、これは有意でソースプレートを埋めるために必要な細胞の数を増加させる細胞を含有する水性のDEX相。関係なく、列方向または全部プレート印刷手法を選択すると、吸引工程の前に、ソースプレートの内容を混合することが重要である。これはDEX相における密集細胞懸濁液は均質であり、スフェロイドの大きさのばらつきを低減することを保証する。
いくつかの研究は、癌細胞のスフェロイドは、そのような試薬の形態や拡散制限などの無血管性腫瘍のいくつかの重要な特性を模倣することを示している。したがって、それらは、従来の単層細胞培養物と比較して癌細胞に対する新規及び公知の化合物の有効性を評価するための生理学的に関連するモデルを提示する。8,17,18,21,23,37それが示されているように製造する水性二相系のアプローチスフェロイドは、好都合に単に添加し、所望の時点での薬物化合物の再生および標準のマイクロプレートリーダーを使用して、細胞生存率の自動スクリーニングすることによって、同じプレートに薬剤スクリーニングを可能にする。このそのような、それが癌細胞と腫瘍微小環境中の細胞を支持し、それらの相互作用は、に関与していることが知られている薬剤に対する細胞応答の分析のための標準的なプレートにスフェロイドを転送が必要となる。さらに、21懸滴などの技術上の主要な利点である癌細胞の種々の悪性の表現型。33-35,38,39ので水性二相技術を用いて癌および間質細胞の同時培養スフェロイドを生成する能力は、癌の応答に対する腫瘍の微小環境の支持細胞の影響を評価するのに役立ちます種々の処理に対する細胞。この研究で行わ共培養実験は、この技術が正常癌細胞および間質細胞を含むスフェロイドを生成することができる概念実証として役立つ。今後の研究では、この機能を利用し、そのような増殖や薬剤応答などのモノ - 及び共培養スフェロイドの微分特性を調査します。加えて、この技術がより密接に腫瘍モデルにおける他の間質の構成要素を含めることにより、生体内腫瘍微小環境を模倣するためのプラットフォームを提供しています。40
要約すると、このプロトコルは、任意の外力を用いずに、96ウェルプレート中のスフェロイドの自発的形成を可能にする。ロボット液体ハンドラに技術を適応することは、標準的なハイスループット形式で回転楕円体の生産速度と効率を向上させる。商業イメージングおよびアッセイと技術の互換性は、学術および産業の研究室で利用可能な別の機器を用いて可能にするプラットフォームを分析します。将来のアプリケーションのために、このプロトコルは、3Dがん細胞培養ルーチン技術を用いた薬物スクリーニングを効率化します。さらに、このアプローチは、容易に、異なるサイズ、異なる細胞型、共培養スフェロイドにおける癌および間質細胞の異なる組み合わせのスフェロイドを形成するように修飾することができ、より高いスループットマイクロウェルプレートtにスケールアップすることOさらなる抗癌薬剤スクリーニングを促進。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
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