Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Skalerbar plade med 96 brønde Based iPSC Kultur og Produktion Ved hjælp af en robot Liquid Handling System

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52755
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

Abstract

Fortsat fremgang i pluripotente stamcelle kultur lukker hullet mellem bænk og bedside for at bruge disse celler i regenerativ medicin, lægemiddelforskning og sikkerhed test. For at fremstille stamceller afledt Biopharmaceutics og celler til vævsmanipulering og transplantation, en omkostningseffektiv celle-produktionsteknologi er afgørende. Vedligeholdelse af pluripotens og stabile præstationer af celler i downstream-applikationer (f.eks celledifferentiering) over tid er altafgørende for stor skala celle produktion. Men det kan være vanskeligt at opnå, især hvis celler dyrkes manuelt, hvor operatøren kan introducere betydelig variabilitet samt være uoverkommeligt dyrt at skalere op. At muliggøre high-throughput, storstilet stamcelle produktion og fjern operatør påvirkende roman stamcelle kultur protokoller ved anvendelse af en bench-top multi-kanal væske håndteringsrobot blev udviklet, der kræver minimal tekniker involvering eller erfaring. Meddisse protokoller humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) blev dyrket i fødefri betingelser direkte fra en frossen stamopløsning og opretholdt i 96-brønds plader. Afhængig af cellelinje og ønskede skala-up rate, kan operatøren nemt bestemme, hvornår de skal passage baseret på en serie af billeder, der viser de optimale koloni tætheder for opdelingen. Så de nødvendige reagenser er parat til at udføre en koloni split til nye plader uden centrifugering. Efter 20 passager (~ 3 måneder), vedligeholdes to IPSC linjer stabile karyotyper udtrykt stamceller markører, og differentieret i cardiomyocytter med høj effektivitet. Systemet kan udføre efterfølgende high-throughput screening af nye differentiering protokoller eller genetisk manipulation designet til plader med 96 brønde. Denne teknologi vil reducere arbejdskraft og teknisk byrde at producere store antal af identiske stamceller til et utal af applikationer.

Introduction

Anvendelse af menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er steget betydeligt siden deres afledning i 2007 1 Ved afprøvning regenerativ medicin og sygdom modellering 2 - 6. Denne efterspørgsel kommer fra iPSC evne til at give et stort antal pluripotente celler, der kan opdeles i somatiske celler ved en enestående mængde. Som rettet differentiering teknikker forbedrer 7-10 og udvikling af menneskelig celle eller væv modellering og celleterapi stiger 11-14, så gør kravet om masseproduktion af kvalitets iPSCs høj. Det er almindeligt citeret, at blandt andre sygdomme, vil myokardieinfarkt eller b-celle funktionel udskiftning kræver hundreder af millioner til milliarder af iPSC afledte somatiske celler 15-18. Desuden mere komplekse 3D væv modellering for lægemiddelforskning og therapy vil kræve et stort antal celler 9,13,19. I alle disse eksempler, defineret, ensartet og reproducerbare iPSCs skal være tilgængelig og let at producere.

For at fremstille stamceller afledt Biopharmaceutics og celler til vævsmanipulering og transplantation, en omkostningseffektiv celle-produktionsteknologi er afgørende. Skaleret produktion af iPSCs har fokuseret på suspensionskultur 20-25 eller suspension ved anvendelse af mikrobærersystemer substrater 26 - 28 dels fordi disse teknikker med succes er indsat for stor skala, ikke-iPSC, eukaryot baseret produktion. Flere grupper har vist suspension dyrkningssystemer, der giver pluripotente stamceller 20,21,23,24,29. Men disse tilgange udnytter dyre og komplekse systemer ikke let tilgængelige for forskere udvikler nye differentiering programmer, kørsel tissue engineering og gør laboratory skala forskning. Desuden suspension og microcarrier IPSC kulturer kræver tilpasning og teknikker eller kemikalier, som ikke findes i traditionelle klæbende iPSC kultur såsom kontinuerlig brug af Rho-kinase inhibitor, antiskummidler og filtrering at regulere sammenlægning. Fysisk stress til cellerne er mere udbredt i suspensionskultur, blev indført ved mekanisk omrøring såvel som under mikrobærer kollision. Disse spørgsmål begrænser forudsigelighed og hastigheden, hvormed nyligt genererede stamcellelinjer kan dyrkes i suspension. Andre har udviklet robot plade håndteringssystemer, der efterligner plade dyrkningsteknikker 30,31, men disse platforme kræver betydelige investeringer for udstyr og ekspertise til at fungere som supplement til de grundlæggende udfordringer i forbindelse med stamceller kultur.

Følgende arbejde beskriver udviklingen og praksis en skalerbar iPSC kultur, der udnytter en selvstændig, standard 8-kanals robot væskeHandler og plader med 96 brønde. Denne metode er designet til at bygge bro laboratorieskala iPSC kultur og høj volumen iPSC produktion (fx 10 7-1,5 x 10 9 celler pr uge pr tekniker) muliggør dem at udvikle nye IPSC teknologier til nemt skalere op produktion uden store hardware eller arbejdskraft investeringer. Denne fremgangsmåde er relativt billig at sætte op, kræver lidt at ingen stamceller kultur, programmering eller ingeniørmæssig erfaring, har et lille fodaftryk udstyr uden behov for et dedikeret cellekultur hætte, og udnytter standard cellekultur udstyr, således medium til højt gennemløb automatiseret celleproduktion. Målet var at udvikle et system, der kan skalerbar stamceller kultur, der kan udnyttes af laboratorier nye at dæmme cellekultur, dem, der finder manuel dyrkning en barriere for at udvikle deres ideer eller dem, der ønsker en økonomisk overkommelig metode til at producere store mængder af stamceller. Platformen præsenteres her fjerner tekniker indflydelse påstamcelle kultur og normaliserer fodring og passage procedurer for at muliggøre ensartet produktion stamcelle.

Protocol

Robotic væskehåndteringssystem, som i de følgende protokoller var Gilson s pipetmaX, letter automatiseret, skalerbar stamcelle kultur og produktion, samtidig med at de traditionelle klæbende dyrkningsbetingelser i 96-brønds plade-format. Ligesom traditionelle 6-brønds plade kultur, er iPSCs dyrkes med denne protokol som et monolag af særskilte kolonier men i 96-brønds plade-format. Hver brønd kan være isogene eller særskilt og enten konfiguration kan dyrkes parallelt siden robotten kan holde hver brønd adskilt. Den typiske robot iPSC kultur rutine har to faser: en fodring program, hvor kulturer fodres med en tilpasselig tidsplan og en passage program, hvor brugeren vælger dissociationen fremgangsmåde og opsplitning forholdet styrer derved podningstæthed og skaleringsforholdet. Følgende protokoller beskriver, hvordan en ny kultur er startet, hvordan fodring og passage er gennemført, og de supplerende programmer, der letter iPSC kultur.

1. Forberedelse ekstracellulære matrix Gel Coated plader med 96 brønde

  1. Fjern emballagen fra seks nye, RT 96-brønds plader og placere dem på væsken håndteringsrobot seng i stillingerne 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se Figur 1A for seng stillinger).
  2. Placere en forhånds-kølet, 4 ° C 4-brønd lavpunktet i sengen position 6.
  3. Belastning kolonne 12 af spidsen rack i sengen position 1 med præ-kølede, 4 ° C 200 pi pipettespidser.
  4. Fyld den første (venstre mest) trug godt i sengen position 6 med 25 ml 4 ° C DMEM / F12 ved at hælde en alikvot under anvendelse af steril teknik. Alternativt kan du bruge en pipette til at fuldføre overførslen.
  5. Fjern de 96 brønde låg og skub hver ind i specielt designet plade låg holder rack (PLHR, se Figur 1A). Undgå kontaktmed indersiden af ​​pladen låg.
    Bemærk: Håndtering af indersiden af ​​en plade låg eller stabling pladen låg, hvor indersiden af ​​den ene låg rører ydersiden af ​​en anden er en fremragende vej for kontaminering.
  6. Brug af robot kontrol touch pad, skal du trykke på følgende række knapper til at starte godt pre-befugtning proces:
    1. Tryk på "Kør en protokol".
    2. Vælg "ekstracellulær matrix gel forvandes" og tryk næste.
    3. Bruger beslutning: Tryk "testkørsel" for at bruge trin-for-trin guide til at pre-teste det valgte program.
      Bemærk: Robotten kører ikke, men snarere software tester protokollen for softwareproblemer. Med etablerede protokoller, aflytning, "springe setup" er acceptabel.
    4. Tryk på "Run protokollen".
  7. I før-befugtning proces (trin 1.6) fortsætte til trin 1.8.
  8. Tø på is til 4 mg aliquot af vækstfaktor reduceret ekstracellulær matrix gel (GFRM) indeholdt i en 50 mlkonisk rør opbevaret ved -80 ° C. Hold alikvot på is, indtil klar til brug.
    Bemærk: GFRM vil størkne hvis de får lov til at komme til stuetemperatur, og vil ikke være nyttig.
  9. Resuspender 4 mg GFRM alikvot i 24 ml 4 ° C DMEM / F12 med en 25 ml glas pipette. Ved overførsel af DMEM / F12, pause for 2-3 sek at tillade pipetten afkøle før resuspendere GFRM alikvot.
  10. Når præ-befugtning proces (trin 1.6) er færdig, fortsætte til trin 1.11.
  11. Overfør 24 ml DMEM / F12 GFRM blandingen til den fjerde brønd af truget i sengen position 6.
  12. Brug af robot kontrol touch pad, skal du trykke på følgende række knapper til at starte den ekstracellulære matrix gel coating proces:
    1. Tryk på "Kør en protokol".
    2. Vælg "ekstracellulær matrix gel portion" og tryk næste.
    3. Bruger beslutning: Tryk "testkørsel" for at bruge trin-for-trin guide til at pre-teste det valgte program.
      Bemærk: Robotten kører ikke, men rather softwaren tester protokollen for softwareproblemer. Med etablerede protokoller, aflytning, "springe setup" er acceptabel.
    4. Tryk på "Run protokollen".
  13. Når trin 1.12 er færdig, skal du udskifte pladen låg.
  14. Overfør den ekstracellulære matrix gel overtrukket 96-brønds plader til en 37 ° C, 5% CO2, befugtet inkubator og holde der i 24 timer hvorefter pladerne vil være klar til brug eller oplagres.
    Bemærk: Under uforudsete omstændigheder kan de nyligt overtrukne ekstracellulære matrix gelplader anvendes efter 15-30 minutters inkubation men O / N til 24 timers inkubation anbefales.
  15. Gentag protokol trin 1.1, 1.3, 1,5-1,6, 1,10, og 1,12 til 14, indtil alt DMEM / F12 med GFRM anvendes.

2. Lagring ekstracellulære matrix gelbelagte plader med 96 brønde

  1. Fjerne ekstracellulære matrix gel overtrukket 96-brønds plader fra 37 ° C, 5% CO2, befugtet inkubator.
  2. Valgfrit: Allow den ekstracellulære matrix gel overtrukket 96-brønds plader til at komme til stuetemperatur, før der fortsættes til trin 2.3.
    Bemærk: Dette valgfrie trin vil reducere kondens opbygge når pladerne anbringes ved 4 ° C.
  3. Placere pladerne på væskehåndtering robot seng i stillingerne 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se Figur 1A for seng stillinger).
  4. Belastning kolonne 12 af spidsen rack i sengen position 1 med RT 200 gi pipettespidser.
  5. Placer en fire trug reservoir i sengen position 6.
  6. Fyld brønd 4 (yderste højre) af reservoiret med RT DMEM / F12.
  7. Fjern de 96 brønde låg og skub hver ind i PLHR.
  8. Brug af robot kontrol touch pad, skal du trykke på følgende kombination af knapper:
    1. Tryk på "Kør en protokol".
    2. Vælg "ekstracellulær matrix gel portion" og tryk næste.
    3. Bruger beslutning: Tryk "testkørsel" for at bruge trin-for-trin guide til at pre-teste det valgte program.
      Bemærk: robot kører ikke, men snarere software tester protokollen for softwareproblemer. Med etablerede protokoller, aflytning, "springe setup" er acceptabel.
    4. Tryk på "Run protokollen".
  9. Når du er færdig, skal du udskifte pladen låg og fjern pladerne fra maskinen sengen.
  10. Wrap omkring hele side af hver ekstracellulære matrix gel overtrukket plade med 96 brønde (hvor låget møder plade) med en en tomme med 6 tommer paraffin filmstrimmel. Sørg for at strække paraffin film for at skabe en lufttæt forsegling.
  11. Valgfrit: Mærk pladerne med datoen for afsluttet ekstracellulær matrix gel belægning, den ekstracellulære matrix gel lotnummer, brugernavn og andre oplysninger.
  12. Opbevar pladerne ved 4 ° C, hvor de vil være godt at bruge i op til to uger.
    Bemærk: Plader er blevet anvendt med succes over to ugers grænse, dog er det ikke anbefales.

3. Udførelse af en Stem Cell Colony Seeding DensityGradient i 96-brønds plade Format fra en Live eller Frozen Kultur: Sådan Start eller genoprette normale Passage Intervaller til en stamcellelinje

  1. Hvis man starter med en frossen kultur, gå videre til trin 3.2. Hvis man starter med en levende stamcelle kultur allerede på en plade, begynder ved trin 3.5.
  2. Optø den frosne kultur ved omrystning af røret i et 37 ° C vandbad, indtil kun et lille stykke is tilbage.
  3. Valgfrit: Fortynd de optøede celler i 10 ml RT stamceller cellevækstmedier (SCGM), centrifugeres i 2 minutter ved 300 xg, aspireres supernatanten medier og resuspender stamcelle pellet i 7 ml frisk SCGM indeholdende 10 uM Y27632.
    Bemærk: Dette trin eliminerer fremførsel af indefrysning medier.
  4. Fortsæt til trin 3.6.
  5. Hvis man starter med levende, allerede belagt stamceller: passage cellerne som normalt ved at bruge enzymatiske eller ikke-enzymatisk dissociation. Forsøge at høste alt på 1,5-3 millioner celler; normalt en brønd i en seks-brønds plade. Centrifugeres de høstede celler til2 minutter ved 300 xg, aspireres supernatanten medier og resuspender stamcelle pellet i 7 ml frisk SCGM indeholdende 10 pM Y27632. Fortsæt til trin 3.6.
  6. Sikre cellerne, enten fra en frossen eller levende kultur, der er suspenderet i 7 ml RT SCGM med 10 pM Y27632.
  7. Load kolonne 12 af spidsen rack i sengen position ét med RT 200 gi pipettespidser.
  8. Placer en fire trug reservoir i sengen position 2.
  9. Placer en ny ekstracellulær matrix gel overtrukket plade med 96 brønde præ-opvarmet til 37 ° C i sengen position 5 og fjern låget placere den i PLHR.
  10. Overfør 7 ml resuspenderede celler til brønd 3 af reservoiret med pipette eller sterilt pour.
    1. Brug af robot kontrol touch pad, skal du trykke på følgende kombination af knapper:
    2. Tryk på "Kør en protokol".
    3. Vælg "Seeding Density Gradient", og tryk på Næste.
    4. Bruger beslutning: Tryk "testkørsel" for at bruge trin-for-trin guide til at pre-teste vælgeed program.
      Bemærk: Robotten kører ikke, men snarere software tester protokollen for softwareproblemer. Med etablerede protokoller, aflytning, "springe setup" er acceptabel.
  11. Tryk på "Run protokollen".
  12. Når fortyndingsrække er færdig, re-dække pladen og sted i et 37 ° C, 5% CO2, befugtet inkubator indtil næste fodring.
  13. Valgfrit: Mærk pladen med dato, stamme oplysninger, brugernavn, medietype og andre relevante oplysninger.
  14. Løbet af de næste adskillige dage, foder plade med 96 brønde som påkrævet under anvendelse af protokol 4 nedenfor.
    Bemærk: En typisk stamcelle plade vil kræve en fuld medier forandring en gang hver 24 timer og SCGM indeholder ikke Y27632 til fodring; kun under den indledende seeding efter passage. Før fodring, kontrollere pladen for kontamination og koloni tæthed. Se trin 3.16 for mere om overvågning koloni massefylde.
  15. Over de næste par dage, flere kolonner nær Cind af pladen (normalt kolonner 5-8) vil nærme sig en ideel tæthed for passage; at identificere denne tæthed, sammenligne den 96-brønds plade til tæthedsområdet vist i figur 3B med følgende oplysninger i tankerne:
    1. Passage når rummet mellem flertallet af kolonierne er ca. 25% af tilstødende koloni diameter.
      Bemærk: Rationalet for at identificere tid til passage er, at en anden cyklus af fodring og vækst ville resultere i kolonier gør kontakt, hvilket bør undgås.
  16. For at starte en ensartet fortyndet plade og begynde regelmæssig kultur, vælge en kolonne, der er i den ideelle tæthed og passage. Se protokol 5 til passage.

4. Fodring 96 brønde Stem Cell Kolonier

Bemærk: Følgende protokol beskriver fodring af en 96-brønds stamcelle koloni plade. Teknikken kan skaleres op til at rumme 6 af total plader parallelt.

  1. Fjern 96-brønds sTEM-cellen koloni pladen fra 37 ° C, 5% CO2, befugtet inkubator.
  2. Kontroller plade til forurening og celletæthed. For at brødføde, at kolonien tæthed er under ideelle passage tæthed. Se figur 3B for information om tæthed.
    Bemærk: Forurening kan præsentere så uklare medier og være ledsaget af en ubehagelig lugt. Små, tydeligvis ikke-IPSC aggregater kan også være synlige under mikroskopisk inspektion. For at evaluere celletæthed Se trin 3.16.1 ovenfor.
  3. Placer 96 brønde stamcelle koloni plade i sengen position 3 på en skrå, 37 ° C rampe.
  4. Belastning kolonne 12 af spidsen rack i sengen position 1 med RT 200 gi pipettespidser.
  5. Placer en 4-brønd lavpunktet i sengen position 2.
  6. Fyld godt 3 af truget i sengen position 2 med 8 ml frisk, RT SCGM uden Y27632 enten ved steril pour eller pipette overførsel.
  7. Fjern 96 brønde stamcelle koloni plade låg placere den i PLHR.
  8. Brug afrobot kontrol touch pad, skal du trykke på følgende kombination af knapper:
    1. Tryk på "Kør en protokol".
    2. Vælg "Colony Feed Én Plate" og tryk næste.
    3. Bruger beslutning: tryk på "testkørsel" for at bruge trin-for-trin guide til at pre-teste det valgte program.
      Bemærk, at robotten ikke kører, men snarere software tester protokollen for softwareproblemer. Med etablerede protokoller, aflytning, "springe setup" er acceptabel.
    4. Tryk på "Run protokollen".
  9. Når fodring protokollen er afsluttet, re-dække 96-brønds stamcelle koloni plade og vende tilbage til 37 ° C, 5% CO2, befugtet inkubator indtil næste fodring eller passage er påkrævet. Dette er normalt nødvendig efter 24 timer.
    Bemærk: Det anbefales at optage fodring begivenhed på pladen dækslet med dato, medietype, brugernavn og andre relevante oplysninger.

5. Passage 96 brønde Plspiste Stem Cell Kolonier

  1. Efter flere tilledningscyklusser 96-brønds stamcelle koloni plade vil være klar til passage. Denne protokol beskriver passage af en kolonne til en plade med 96 brønde, der repræsenterer en 1:12 delingsforholdet. Brugeren kan definere delingsforholdet og vælge et antal brønde eller kolonner til at splitte, herunder valg af brønde, der måske ikke er tilstødende.
  2. Sammenlign 96 brønde stamcelle koloni plade tæthed til figur 3B at afgøre, om at passage. Den ideelle passage massefylde er når rummet mellem flertallet af kolonier er ca. 25% af tilstødende koloni diameter eller en efterfølgende fodring ville resultere i kolonierne vokser ind i hinanden.
  3. Undersøg 96 brønde stamcelle koloni pladen under et mikroskop for at sikre, at der ikke er nogen forurening.
  4. Placer 96 brønde stamcelle koloni plade i sengen position 3 på en skrå, 37 ° C rampe.
  5. Belastning kolonner 8-12 i spidsen loading rack i sengen position 1 med RT 200 pi pipettetips.
  6. Placer en 4-brønd lavpunktet i sengen position 2.
  7. Lad trug godt 1 tom, satte 8,5 ml SCGM + 10 uM Y27632 i brønd 2, satte 3,5 ml 30% proteolytisk og collagenolytisk dissociation reagens (eller EDTA baseret dissociation reagens) i brønd 3, satte 4,5 ml PBS i godt 4.
    Bemærk: Alle reagenser kan være ved stuetemperatur eller 37 ° C. RT proteolytiske og collagenolytisk dissociation reagens ved 30% fortyndet med PBS blev anvendt til Adipose og fibroblast afledt iPSC kultur beskrevet her.
  8. Placer en ny, forvarmet 37 ° C ekstracellulær matrix gel overtrukket plade med 96 brønde i sengen position 5.
  9. Fjern 96-brønds stamcelle koloni plade låg, samt den nye 96-brønds plade låg og placere dem både i PLHR.
  10. Brug af robot kontrol touch pad, skal du trykke på følgende kombination af knapper:
    1. Tryk på "Kør en protokol".
    2. Vælg "Colony Split 01:12 Kolonne 1" og tryk næste.
    3. Bruger beslutning: Tryk "testkørsel" for at brugetrin-for-trin guide til at pre-teste det valgte program.
      Bemærk: Robotten kører ikke, men snarere software tester protokollen for softwareproblemer. Med etablerede protokoller, aflytning, "springe setup" er acceptabel.
    4. Tryk på "Run protokollen".
  11. Når passagen protokollen er afsluttet, re-dække begge plader.
  12. Valgfrit: Mærk den nye plade med de nødvendige oplysninger (dvs. dato, cellelinje, passage nummer, medietype, brugernavn osv).
  13. Returnere begge plader til 37 ° C, 5% CO2, befugtet inkubator indtil næste fodring eller passage er påkrævet. Bemærk: Den næste fodring er typisk efter 24 timer.
    Bemærk: Celler og kolonier bør lægge til pladen inden 2-3 timer af opsplitning og ser meget spredt ud. Dette skyldes tilstedeværelsen af Rho-kinase-inhibitor, og cellerne vil kondensere og udviser den karakteristiske stamcelle morfologi (dvs. brosten pakket kolonier with småcellet volumen til stor kerne forhold) efter den første Rho-kinase inhibitor fri fodring.

6. Høst 96-brønds plade stamceller til produktion

Bemærk: Stamceller kolonier kan høstes til anvendelse på ethvert punkt under dyrkning. Normalt dette sker, når cellerne er klar til passage (se protokol 5). Denne protokol beskriver, hvordan man høste elleve kolonner fra en 96-brønds stamcelle koloni plade.

  1. Undersøg 96 brønde stamcelle koloni pladen under et mikroskop for at sikre, at der ikke er nogen forurening.
  2. Placer 96 brønde stamcelle koloni plade i sengen position 3 på en skrå, 37 ° C rampe.
  3. Load kolonner 11 og 12 i spidsen lastning rack i sengen position 1 med RT 200 gi pipettespidser.
  4. Placer en 4-brønd lavpunktet i sengen position 2.
  5. Lad trug godt 1 tom, satte 8,5 ml SCGM i brønd 2, satte 3,5 ml 30% proteolytisk og collagenolytisk dissociation reagens (eller EDTA baseret dissociation reagens) i godt3, sætte 4,5 ml PBS i godt 4.
    Bemærk: Alle reagenser kan være ved stuetemperatur eller 37 ° C.
  6. Fjern 96 brønde stamcelle koloni plade låg og plads i PLHR.
  7. Brug af robot kontrol touch pad, skal du trykke på følgende kombination af knapper:
    1. Tryk på "Kør en protokol".
    2. Vælg "Colony Harvest kolonner 2-12" og tryk næste.
    3. Bruger beslutning: Tryk "testkørsel" for at bruge trin-for-trin guide til at pre-teste det valgte program.
      Bemærk: Robotten kører ikke, men snarere software tester protokollen for softwareproblemer. Med etablerede protokoller, aflytning, "springe setup" er acceptabel.
    4. Tryk på "Run protokollen".
      Bemærk: Når proceduren kollektion er færdig, vil cellerne være i trug godt 2 og klar til afhentning.

Representative Results

Udvikling af en plade baseret robot stamcelle kultur platform.

Efterspørgslen efter iPSCs er stigende på grund af deres anvendelighed i lægemiddeludvikling og regenerativ medicin. Alligevel skalerbar produktion har fokuseret på suspension kultur 32 i relativt komplekst udstyr, der udelukker mange forskere og afviger fra etablerede vedhængende dyrkningsmetoder. Snarere end drastisk ændre gennemprøvet plade baseret stamceller cellekultur metoder, såsom at skifte til en suspension kultur eller ved hjælp af en mikrobærer, vi fokuseret på miniaturisering og automatisere vores eksisterende vedhængende IPSC dyrkningsteknikker. Det første mål var at automatisere fodring og passage at normalisere hele dyrkningsprocessen. En platform i stand til hurtig opskalering med eksisterende teknologi blev også påkrævet. For at nå disse mål en metode blev udviklet til kultur stamceller i en 96-brønds plade under anvendelse af et automatiseret væskehåndteringssystem (figur 1). Den protocols udviklet her med den væskehåndtering robot til fodring og passage kræver ikke en centrifugering trin eller kontinuerlig overvågning af en tekniker. Disse protokoller blev fremkaldt med to feeder gratis IPSC linjer; afledt af fibroblaster og den anden fra fedtceller 33.

Den computerstyrede væskehåndteringssystem (figur 1A) består af en flatbed der bevæger foran og bagpå. Sengen har ni, cirka 5 x 3,3 tommer nummererede fordybninger med tryk fastgørelsesklemmerne til at acceptere standard cellekultur plader, flydende reservoirer og andre brugerdefinerede hardware. Pipetten hoved bevæger venstre til højre (vinkelret på sengen bevægelse) samt op og ned. Sammen med sengen, kan pipetten hoved programmeres til at fjerne eller levere medier overalt på sengen efter optagning pipettespidser fra en genopfyldning rack. Om nødvendigt kan hver af de 96 brønde holdes adskilt for at fjerne forurening. I den foreliggende udformning, 0 til200 pi af mediet kan bevæges ved hver spids pipette hovedet, men andre bindintervallet er mulige baseret på dysestørrelse.

Når at passere stamceller i faste plader, enzymatisk eller kemisk dissociering kræver typisk inkubering ved 37 ° C. Indledende test bekræftede dissociation med et proteolytisk og collagenolytisk dissociation reagens eller en EDTA baseret reagens udføres bedre ved 37 ° C end RT både tid til dissociation og ensartethed i kolonistørrelse produceret til vore to 96-brønds IPSC linjer (data ikke vist). At automatisere split processen og undgå at flytte plader ind og ud af en inkubator, skrå, temperaturstyrede ramper, der accepterer og reproducerbart placere standard dyrkningsplader blev bygget (figur 1A). Når ramperne blev opvarmet til 37 ° C, et proteolytisk og collagenolytisk dissociation reagens eller EDTA baseret dissociation af iPSCs fra 96-brønds plader var sammenlignelig med plader anbragt i en 37 ° C inkubator (data not vist). De skrånende ramper blev også anvendt til at gøre det muligt pipettespidser til at indsamle en hel såvel indhold (mindre end 5 Ul resterende volumen) ved at nå det laveste punkt i brønden henviser aspiration fra en flad plade efterladt et resterende volumen på ca. 10-15 ul, hvilket resulterer i celletab. Den skrå rampe tillades også brøndene til vaskes (findelt) ved udstødning medier i toppen af ​​den skrå godt og at indsamle den i bunden.

Robotic kultur af stamceller i 96-brønds plade-format; fodring og passage.

Kultur af iPSCs hjælp af robot væskehåndteringssystem har to faser; passage og fodring. Når en koloni er klar til passage, er det delt ved et forudbestemt forhold til frø en ny plade, som føres derefter med regelmæssige intervaller, indtil det er klar til passage igen (figur 1B). Frosne eller ikke-96-brønds-kulturer kan startes i 96-brønds format og straks ind gennem passagen / fodercyklus. Celler, der ikke anvendes til at opretholde kolonien, som er størstedelen af ​​en plade, høstes til andre anvendelsesformål og repræsenterer produktion komponent i dette system.

Fodring 96-brønds dyrkede iPSCs opnås, når alle eller nogle af mediet fjernes efter en periode med kultur og deponeres i et spildreservoir. Derefter frisk medium alikvoteres til den samme plade. Robotten kan bruge nye tips og medier trug at adskille alle godt for fuldt tilpasselig fodring, herunder blande konditionerede medier med nye medier.

Typisk passage af stamceller kræver en fremgangsmåde til dissociering og ofte et centrifugeringstrin. De her beskrevne protokoller til formål at normalisere dissociation og eliminere centrifugering. Protokollen passage begynder, når robotten leverer dissociation reagens til 96-brønds plader monteret på 37 ° C skrå ramper. Efter en forudindstillet tid, bliver de dissocierede celler opsamles med en vask handling, hvor brugeren har control over stillingen, gentagelse, volumen og findeling sats. Enzym tid, triturering og antallet af triturering gentagelser var tilstrækkelige til at variere dissocieret koloni størrelse og homogenitet (figur 2), men hver parameter justeres til at passe en given cellelinie krav. Denne styring fjerner variabilitet indført ved teknikere, der pipette med varierende priser, holdninger og gentagelser. Når de dissocierede celler opsamles og samles i et reservoir med frisk medium, er de distribueres til en ny plade. At undgå centrifugering og såning problemer fra substrat nedbrydning eller celledød på grund af enzym handling blev dissociation reagens fortyndet til minimumspunktet af acceptabel dissociation, der resulterede i pålidelig podning. Denne teknik var effektivt til et proteolytisk og collagenolytisk dissociation reagens i mTeSR1 medium 34, som har et relativt højt proteinindhold, men også effektive i lave protein medier som Essential-8 35

Styring af seeding tæthed af stamceller efter passage er altafgørende for rutine og vellykket stamcelle kultur. Seeding for lav eller høj, kan resultere i ektopisk differentiering og tab af pluripotens i over at forårsage uregelmæssige passage intervaller. Typiske stamcelle kultur er afhængig af forholdet splitting hvor en brønd af en 6-brønds plade anvendes til at pode en hel ny plade med 6 brønde (en 1: 6 split). Med den flydende håndtering robot dette forhold kan justeres til at passe til brugerens behov (f.eks, 1: 6, 1: 9, 1:12, etc.), og det har størst indflydelse på passagen interval. Robotten kan høste mindre end én kolonne, en hel kolonne (8 brønde), eller mere end én kolonne, afhængigt af brugerens behov, som bør fastlægges empirisk. De fedt og fibroblast afledte iPSCs opretholdt en regelmæssig tre dage fodring tidsplan med passage på den fjerde dag, hvor delt 01:12. I dette tilfælde en kolonne blev høstet og anvendt til at pode en ny plade med 96 brønde, hvilket skaber en 1:12 split med hver cyklus (figur 3A). De resterende 11 brønde blev derefter tilgængelige for efterfølgende anvendelser. At høste disse 11 produktionsbrønde blev passagen protokollen gentaget bortset cellerne blev deponeret i et trug til opsamling. Alternativt kan cellerne efterlades på pladen og anvendt direkte.

For at opnå ensartet podningsdensitet passage til passage uden at tælle, og opretholde en rutine opdeling tidsplan, kalder vores protokoller for at opdele det samme forudbestemte antal kolonner, når kolonien er en ideel tæthed for passage. For at hjælpe brugerne med at identificere den korrekte densitet til passage, blev en serie af billeder genereret viser en række densiteter med en ideel passage densitet fremhævet (figur 3B). At bestemme, hvornår til passage, en tekniker undersøger deres plade og sammenligner den med densiteten billedskalaen. Idéenl densitet til passage blev bestemt ud fra kultur af fedt- og fibroblast afledt iPSCs og fundet at være, når mellemrummet mellem de fleste kolonier var omkring 25% af tilstødende koloni diameter. Det er vigtigt, at kolonierne homogent fordelt. Denne mængde af koloni separation korrelerer med den maksimale ønskelige tæthed, fordi en ekstra fodring cyklus ville resultere i kolonier rører, som er en trigger for ektopisk differentiering.

En nødvendig protokol udviklet her henvender hvordan man starter en kultur i 96 brønde-format og hvordan du nulstiller en kultur efter en tæthed problem. Når en ny kultur startet, den bedste seeding tæthed og antal fodring cykler før passage er ukendte. For at sikre en brugbar tæthed efter podning robotten distribuerer eksisterende eller optøede celler på tværs af en plade med 96 brønde i en seriefortynding (figur 4A). Eksempel resultaterne af en sådan gradient er vist i figur 4B-E. Efter flere fodringcykler, nogle kolonner nærmer den ideelle massefylde at opdele, på hvilket tidspunkt en tekniker bruger robotten til frø en ensartet fortyndet plade til at starte regelmæssig kultur. Denne densitetsgradient protokol blev også anvendt til at genskabe regelmæssige passage intervaller og koloni homogenitet til en uregelmæssig plade. Hvis passage er forsinket eller savnet, koloni tæthed og størrelse bliver for højt, hvorimod hvis passage er for tidligt, koloni tæthed er for lav og individuelle kolonier kan blive for stor uden at være jævnt fordelt over hele godt. Densitetsgradienten protokol løser disse problemer og tillader brugeren at genstarte ved at udvælge en ideelt podet sæt brønde.

To IPSC linjer forblev pluripotente efter 3 måneders robot kultur.

Vedligeholdelse af stamceller pluripotens kan blive negativt påvirket af dyrkningsbetingelser 36,37. At vurdere, om fedt og fibroblast afledt IPSC linjer (a-IPSC, f-iPSC henholdsvis) fastholdt pluripotency når de dyrkes robot i plader med 96 brønde i en forlænget periode, de to linjer blev dyrket på væsken håndteringsrobot som beskrevet ovenfor i 3 måneder og derefter pluripotens markører blev undersøgt. For denne periode begge linjer blev passeret med et proteolytisk og collagenolytisk dissociation reagens større end 20 gange uden centrifugering. Faste plader med 96 brønde fra en-iPSC og f-IPSC linjer farvet for Oct4 og Nanog udviste kerneakkumulation af disse markører mens SSEA-4 blev observeret på celleoverfladen (figur 5A-L). Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter for pluripotente iPSCs 38-41. Modfarvning med DAPI afslørede ingen yderligere celler, der ikke var også positivt for de tre pluripotens markører. Kromosomafvigelser er almindeligt observeret under stamcelle kultur 42,43, men kan ikke påvirke fordelingen af pluripotens markører som dem vist i figur 5A-L. Karyotype analyse afslørede både robot passerede IPSC linjer havde 46 normale kromosomer, hvilket tyder på robot dyrkningsmetode ikke indføre kromosomal ustabilitet ud over, hvad der kan normalt ske (figur 5M-N).

At sonde etableret stamcelle genekspression markører 1,41,44,45 i robot dyrkede IPSC linjer, blev total RNA opsamlet parallelt farvning og karyotype-analyse. Både 96-brønds plade IPSC linjer havde lignende udtryk for pluripotens markører NANOG, POU5F1 og REX1 mens cardiomyocytter differentieret fra hver linje ikke, heller ikke en separat linje af humane dermale fibroblaster (HDFS) (figur 6). De cardiomyocytter afledt fra begge linjer var MYL7 positive mens HDFS og stamceller ikke udtrykker MYL7. Begge IPSC linjer blev differentieret i cardiomyocytter med lille molekyle, Wnt pathway manipulation teknikken beskrevet for nylig 46 (figur 7). Differentiering til cardiomyocytter i 96-brønds format lykkedes større end 80% af brøndene (data ikke vist). Tilsammen antyder disse data 3 måneder og mere end 20 passager af robot kultur resulterede i kromosomalt normale celler, der udviser en transskription program i overensstemmelse med pluripotens der var også i stand til differentiering til cardiomyocytter.

Figur 1
Figur 1. Oversigt over robot stamcelle kultur udstyr og typiske iPSC kultur rutine. (A) Robotic væskehåndteringssystem vist med typiske seng layout til 96-brønds stamcelle kultur. Nye sterile pipettespidser (Tips), aftagelig spids affaldsbeholder (Waste), multi-brønds autoklaverbar trug til hold kræves flydende reagenser (væsker), 96 brønde er placeret en d understøttet på en temperatur kontrolleret, skrå rampe (96 brønde), 8 kanals robot pipette hoved, der bevæger sig til venstre / højre og op / ned (Pipet hoved). Plade låg holder rack (PLHR). Bed positionsnumre vist nedenfor i tabel. (B) Robotic iPSC kultur har to faser: Fodring og Passage. Denne cyklus af celle produktion starter, når en koloni plade er klar til passage. Brugeren vælger det ønskede forhold til passage ved og robotten frø en ny gruppe af 96-brønds plader derefter fodret med regelmæssige intervaller, indtil klar til passage igen. Når pladerne er klar til passage, er det meste af hver plade ikke anvendes til frø efterfølgende koloni plader og er tilgængelig for andre anvendelser, således udgør produktionsfasen af ​​systemet. Frosne eller eksisterende cellelinjer kan indføres til enhver tid og vedligeholdes i foderet / passage cyklus. Klik her for at se en større version af dette tal.

e_content "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 2
Figur 2. Robothåndtering parametre væske kan anvendes til at styre IPSC koloni dissociation egenskaber. Hvert repræsentativt billede viser fibroblast afledt iPSCs dissocieret efter den angivne behandling, mens stadig suspenderet i 96 brønde. (Øverste række, A - C) Enzyme Time, ingen findeling. Fibroblast afledte iPSCs dyrket i 96-brønds plader blev udsat for stigende tidspunkter af proteolytiske og collagenolytisk dissociation reagens dissociation og ingen robotic triturering blev udført. (Middle Row, D - F) Triturering sats, 3 minutters enzym. Celler blev udsat for tre minutter af proteolytiske og collagenolytisk dissociation reagens behandling og derefter 175 pi vækstmedier blev påført, og hver brønd pipetteret op og ned en gang ved den angivne hastighed. pl / sek = mikroliter pis sekund. (Nederste række, G - I) Triturering Gentagelser, 3 minutters enzym, 160 pl / sek. Celler blev udsat for proteolytisk og collagenolytisk dissociation reagens i 3 minutter, blev 175 pi vækstmedier anvendes, så findelt ved 160 ul / sek for det angivne antal gentagelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Typisk fedt og fibroblast iPSC koloni vedligeholdelse ordningen og en serie af koloni tæthed billeder til at afgøre, hvornår de skal passage at opretholde en regelmæssig fodring / passage cyklus. (A) Begyndende med en fedt eller fibroblast 96 brønde iPSC koloni klar til passage, en kolonne af celler blev passeret på robotten uden centrifugering og fortyndettil 12 nye kolonner, som blev fodret med bestemte intervaller derefter, indtil pladen var klar til passage igen. For celle produktion, blev kolonnerne ikke anvendt til at opretholde kolonien passeret og opsamles til senere anvendelse. Ethvert antal kolonner kan passeres til at styre udvidelseshastighed. (B) For at bestemme, hvornår de skal passage, en serie af densitet billeder fanget hver 24 timers blev leveret til brugerne. I den øverste røde felt (inden 72 timer efter første såning) kolonien ikke er tæt nok til passage og skal fodres. Når densiteten kampe, der er vist i det grønne felt (på ~ 96 timer), kolonien er en ideel tæthed til passage. Med 120 h, kolonien er for kompakt til passage og dette scenarie bør undgås. Sidstnævnte kan løses med en seeding densitetsgradient men rutine kultur på denne tæthed på det kraftigste frarådes. White bar lig 200 pM. Klik her for at se et større versipå denne figur.

Figur 4
Figur 4. 96-brønds robot dyrkningssystem giver brugerne mulighed for at starte kulturerne fra frosne eller aktive cellelinier og udføre en seeding gradient. (A) En celle opløsning fremstilles af brugeren fra en frossen celle bestand eller efter høst en aktiv kultur og anbragt på robotten. Robotsystemet udfører derefter en seriel fortynding protokol til at distribuere den oprindelige celle-opløsning langs 96-brønds plade med densitetsgradient distribueres af kolonnen. (B - E) Eksempler på celledensitet fra fire af de tolv kolonner fra A, 48 timer efter den densitetsgradient seeding protokol. Hvide linjer lig 225 um. Klik her for at se en større version af dettefigur.

Figur 5
Figur 5. pluripotens opretholdes i fedtvæv og fibroblast afledt IPSC linier i 96-brønds robot kultur for 22 (fedt) eller 23 (fibroblast) passager (~ 3 måneder). (A - L) Adipose og fibroblast afledt IPSC cellelinier var robotersvejsede fodres og passeret som beskrevet i teksten uden centrifugering i 96-brønds plader i 22 eller 23 passager derefter fikseret og farvet for pluripotens markører Oct4, Nanog, eller Ssea4 med DAPI kontrastfarve. Hvid bjælke er lig med 100 um. (M - N). Parallelle kulturer til dem, der er beskrevet i A blev sendt til karyotype analyse, som viste en normale antal 46 kromosomer Klik her for at se en større version of denne figur.

Figur 6
Figur 6. Adipøst (96-A) og fibroblast (96-F) afledt iPSCs dyrket i mere end 20 passager i 96-brønds format robotic vedligeholdt pluripotens genekspression og differentieret i cardiomyocytter. Total mRNA blev ekstraheret fra begge robot dyrkede IPSC linjer samt cardiomyocytter differentieret fra begge linjer (CM-A = adipose iPSC afledte kardiomyocytter, CM-F = fibroblast iPSC afledte kardiomyocytter, samlet 14 dage efter differentiering induktion) og anvendt til RT-PCR til sonde pluripotens markører NANOG, POU5F1, REX1, cardiomyocyte markør MYL7 og lastning kontrol GAPDH. Humane dermale fibroblaster (HDF) blev også opsamlet og anvendt som en ikke-iPSC, ikke-cardiomyocythypertrofi kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. fibroblast og adipøst afledte iPSCs opretholdt evnen til at differentiere til cardiomyocytter efter lang sigt 96 brønde robotic kultur (A - H). Adipose og fibroblast iPSCs dyrket i 96-brønds robot format for mere end 20 passager blev differentieret i cardiomyocytter . 14 dage efter differentiering induktion blev 96-brønds plade bundet cardiomyocytes dissocieret og genudpladet ved en lav densitet på objektglas til immunfarvning af troponin T (rød), F-actin (grøn) og kerner (blå). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
Figur 8. Opskalering 96-brønds plade stamcelle kultur Opskalering af stamceller produktion. Afhænger af antallet af plader, der anvendes til at pode den efterfølgende gruppe af plader. Brugeren kan enten opretholde et produktionsniveau ved passage samme antal plader på hver split lejlighed eller udvide produktionen ved podning flere plader. For eksempel i cyklus 0, er en 96-brønds plade passeret til tolv nye plader (cyklus 1), hvilket skaber en 12 fold ekspansion. Denne sats kan opretholdes, hvis en af ​​de tolv plader passeres til et nyt sæt af tolv plader (Cycle 1 til 2), eller udvides ved passage af flere plader (Cycle 2 til 3). Under passage, eventuelle pladerne ikke anvendt til at opretholde kolonien er til rådighed for efterfølgende anvendelser. Derfor passage 12 plader rutinemæssigt kunne give så mange som 144 plader i to passager: 12 til koloni vedligeholdelse og 132 til andre anvendelser."> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9
Figur 9. Effektivitet af 96-brønds plade baseret kultur for celle produktion langt overstiger manuel dyrkning. Som bemærket i figur 8, kan en plade passeres til frø tolv plader, som derefter passeres til 144 plader. Denne sats ekspansion kan opnås på to split muligheder. En tekniker kræver omkring 3,5 minutter for at fodre en 6-brønds plade henviser de tilbringer ca. 30 sek med en 96-brønds plade til at undersøge det på mikroskopet og placere den på robotten. Hvis teknikeren bærer 144 plader, vil de bruge omkring 1,2 timers håndtering plader, når fodring med robotten mens manuel kultur vil kræve en dedikeret 8 timers til foder. Klik her for at view en større version af dette tal.

Discussion

I den foreliggende undersøgelse har vi udviklet en fremgangsmåde til robot kultur for iPSC produktion, der miniaturizes og automatiserer fodring og passage i en 96-brønds plade-format og samtidig muliggør effektiv opskalering. En flydende håndtering robot blev brugt til rutinemæssigt fodre IPSC kolonier og passage dem med jævne mellemrum af enzymatisk dissociation. Robotten blev også programmeret til at frembringe ekstracellulær matrix gel overtrukne plader og udføre en seeding densitetsgradient. Når fibroblast og adipøst afledte iPSCs blev dyrket i dette system i mere end 20 passager, omkring 3 måneder, blev pluripotens vedligeholdt, som var stabile karyotyper. Begge cellelinier var i stand til differentiering til cardiomyocytter. Sammen indsamling af protokoller beskrevet her giver brugere med meget lidt stamceller kultur erfaring eller begrænset adgang til specialiseret kultur udstyr til kultur stamceller og opnå en høj produktion celle eller flere linjer håndtering med minimal arbejdskraft og omkostninger.

44,47 - 49 for at opretholde pluripotens. Mens andre formater af skalerbar stamceller kultur udbytte pluripotente celler 20,23,29 denne plade baseret metode kræver væsentlige ingen ændring i kultur-format, ligesom tilpasning til suspension, brug af skumdæmpende kemikalier eller langvarig brug af Rho-kinase inhibitor 20. Denne plade baseret metode kan derfor hurtigt og forudsigeligt, rumme nye linjer, fordi de dyrkningsbetingelser er ens. Da anvendelsen af iPSCs for sygdomsmodeller øger 4,6,19,50, nye IPSC linjer kontinuerligt genereres. De her beskrevne teknikker er bedst egnet til kultur nye linjer i medium til høj lydstyrke og gennemløb, fordi barriere for overgangen på formatet er low. Dette er også sandt for arbejdskraft og udstyr er nødvendigt for at opretholde kolonierne. Endelig, fordi formatet og håndtering ligner miljøet anvendes til at udlede og validere IPSC linjer, kultur ydeevne, såsom dirigeret differentiering, vil sandsynligvis være mere forudsigelig.

Figur 8 illustrerer en strategi for opskalering af stamceller produktion i plader med 96 brønde. Én plade (cyklus 0) anvendes til robotersvejsede pode 12 nye plader, en 12 gange forøgelse (cyklus fra 0 til 1). Efter flere dages fodring, en af ​​de tolv plader er dyrket i flere passager at pode et andet sæt af tolv plader (cyklus 1 til cyklus 2). De resterende elleve plader er nu tilgængelige til andre anvendelsesformål og repræsenterer produktionen komponent i systemet. På denne sats, vil passage af en plade giver 11 plader hver cyklus eller hver 3-4 dage. Denne metodologi kan skaleres mere når flere plader passeres som vist i overgangen fra cyklus 2 til cyklus 3. I cyklus 3, to plader eraltid anvendes til at opretholde kolonien og frø 24 nye plader. De resterende 22 plader er derefter klar til brug efter hver passage cyklus. På ethvert tidspunkt i vedligeholdelsescyklus brugeren kan frø flere plader til at øge produktionen. Et eksempel kunne være at passage hver kolonne for to vækst- cykler. Den første passage omdanner én plade i tolv plader, og hver af de tolv plader anvendes til at pode 144 plader. I dette tilfælde en bruger starter med en plade, og efter to passager, eller omkring 1,5-2 ugers dyrkning, har 144 plader. For eksempel fibroblast og adipose IPSC linjer udbytte ca. 25 til 75.000.000 celler pr plade med 96 brønde når de er klar til passage. 144 plader kunne derfor repræsentere ca. 4-7 x 10 9 celler.

Hvad er arbejdskraft byrde for udførelse 144 96 brønde robot? Et af målene for dette arbejde var skalerbar stamcelle produktion, der reducerede arbejdskraft sammenlignet med traditionel (dvs. 6-brønds plade) stamcelle kultur. Robotten accomplishes dette ved at lette behovet for fysisk at håndtere hver plade under fodring og passage. Mens 96-brønds plade produktions- skalaer lineært ligesom det ville i traditionelle plader med 6 brønde, den tid en tekniker tilbringer arbejde med pladerne er betydeligt mindre ved anvendelse robot kultur. Produktionseffektiviteten af robot kultur er afledt af denne forskel (figur 9). Det blev fundet teknikere kunne fjerne en 6-brønds plade fra inkubatoren, tjek det på mikroskopet, så suge og foder pladen i ca. 3,5 minutter. Til sammenligning teknikere tilbringer ca. 30 sek at fjerne en 96-brønds plade fra inkubatoren og inspicere det på mikroskopet for tæthed og forurening før placere den på robotten. Med et udvidet fodring protokol svarende til den ovenfor beskrevne, kan seks plader med 96 brønde læsses og fodres, som tager ca. 21 min eller 3,5 min pr plade. Den samlede forløbne tid til at fodre en plade er sammenlignelig mellem robotic og manuelle metoder, men til hånd foder 6 plader en tekniker er påkrævet for alle 21 minutter mens teknikeren bruger kun 3 min håndtering af seks plader til robotten (en 30 sek inspektion per plade). Som figur 9 viser, den tid, en tekniker tilbringer håndterer 144 plader ved hjælp af robotten er ca. 1,2 time i modsætning til 8 timer manuelt, og robotten vil aldrig lave en fejl håndtering af pladerne eller overførsel af væsker.

De 96 brønde IPSC dyrkningsmetoder beskrevet her giver en medgørlige platform for komplekse screening opgaver. Da hver brønd er genetisk identisk og podes ved samme densitet fra samme oprindelige pulje, kan variabler fordeles hen over pladen og vedligeholdes af robotten med kommercielt tilgængelige reservoirer at adskille betingelser. Det ville være nyttigt for eksperimenter, såsom vækst stamceller medieudvikling 34,35,47, substrat eller kultur tilstand test og toksicitetsundersøgelser udnytte stamceller51. Da hver stamcellelinje er unik i forhold til optimale koloni størrelse og passage krav, kan man bruge dette system til at modulere podningstæthed, fodring frekvens og håndtering passage ved at manipulere kolonnerne høstet, den mekaniske agitation under passage og fodring frekvens. Iteration gennem disse variabler vil gøre det muligt for brugeren at hurtigt at finde en række betingelser, der er egnede til dyrkning af en ny linje eller udvikle nye dyrkningsteknikker. Robotsystemet er også i stand til at opretholde 96 parallelle men uafhængige stamcellekolonier. Når iPSC er afledt fra somatiske celler eller klonet efter genetisk manipulation, er mange parallelle kloner screenes for at give potentielle IPSC linjer. Når enkeltceller podes i 96-brønds plader, kan dette system foder og passage af de 96-brønds plader holder hver koloni adskilt. Dette muliggør meget højt gennemløb ved valg potentielle kloner og eliminerer vanskelighederne ved fysisk dyrkning 96 parallelle linier. Denne metode også enllows opskaleret produktion af hver klon, således at materialet er let tilgængelige for parallel analyse. Endelig forestiller vi integrere disse dyrkningsteknikker med et robotsystem trafficking plade, der leverer plader til og fra inkubatoren muliggør fuldautomatisk kultur. Dette kunne udføres med mere komplekse robotter der giver mulighed for større ekspansion da de grundlæggende protokoller beskrevet her kan overføres til andre plade baserede systemer.

De første kritiske skridt til at løse i protokollerne er dem, der forhindrer og check for forurening, såsom trin 1,5 og 4,2. Kontaminering, som diskuteret ovenfor, med held kan undgås, hvis god steril teknik og sund fornuft er udnyttet. Det er bydende nødvendigt, uanset stamceller kultur format, at operatøren check for forurening og gør det i denne protokol på de angivne trin vil reducere risikoen for forurening. Korrekt ekstracellulær matrix gel ansøgning er en anden essrentielle skridt til den samlede succes af denne protokol. Uden korrekt overtrækning af plader med 96 brønde, vil stamcellerne ikke vokse. Et fælles problem er ufuldstændig godt overtræk. Erfaringen viser, at luftbobler, elektrostatisk tiltrækning og kapillarvirkning hindre komplet godt belægning. Trinnet forudgående befugtning (1,6) blev udviklet til en væsentlig forbedring brøndbund belægning og bør ikke springes over. Denne præ-befugtende trin synes at reducere den tilsyneladende hydrofobicitet plast plade med 96 brønde, således at når den ekstracellulære matrix gel coating påføres det er jævnt fordelt over godt bund og sider. Det anbefales også at forsigtigt trykke på 96-brønds plader mod en ren hånd engang belagt for at sikre en jævn ekstracellulær matrix gelopløsning distribution. Dissociationen parametre er også vigtigt at optimere. Forlænget inkubation med enzym eller EDTA baseret dissociation reagens vil resultere i enkelte celler, som måske eller måske ikke er målet under passage. Derfor operatørenbør være særlig opmærksom på, hvordan dissociation tid, findeling kraft, og vask gentagelser påvirker koloni morfologi og sundhed og justere i overensstemmelse hermed.

Forståelse af de begrænsninger de teknikker der er beskrevet her, er altafgørende for en vellykket operation. Som i enhver anden cellekultur indstilling, anvendelse af 96-brønds plader viser en relativt høj risiko forurening. Som beskrevet ovenfor er en tekniker er håndtering hver plade under fodring og passage; for eksempel, når du åbner låget, at sætte pladen på robotten seng, og kontrol af pladen på mikroskopet. Som bemærket efter trin 1.5, er derfor bydende nødvendigt ikke at røre indersiden af ​​enhver plade låg eller udsætte denne del til en potentielt kontamineret overflade såsom de skrå varme blokke eller lodrette ben på sengen. Under protokol udvikling denne begrænsning blev opdaget og var drivkraften til at udvikle et rack til at holde plade låg for at opretholde sterilitet. Ligeledes trough reservoirer, pipettespidser og other forsyninger på væskehåndtering robot seng er potentielle kilder til forurening, fordi de er åbne over for miljø og håndteres af teknikeren. Derfor bør god steril teknik anvendes såsom at reducere bevægelser i løbet af eksponerede kultur materialer eller åbne væsker. En anden begrænsning er, at når protokollen er opskaleres, visuelt kontrollere hver brønd i> 100 plader med 96 brønde er besværlig. Dette kan behandles ved visuelt at inspicere hele pladen for tegn på forurening, såsom uklare medier, for at identificere mistænkelige brønde. Til fremtidig opskalering, vil anvendelse af et automatiseret mikroskop og indikator for cellevækst og potentiel kontaminering inkorporeres.

Sammenfattende high-throughput 96-brønds baseret platform her beskrevne tilbyder en reproducerbar, high fidelity fremgangsmåde til stamcelle kultur og produktion i en plade format. Denne metode reducerer den nødvendige erfaring, nødvendige udstyr og arbejdstid dedikeret til stamceller kultur, mensfastholde fordelene ved traditionelle klæbende kultur.

Disclosures

Forfatterne MKC, MJG, EEB, NJD og RO er eller var på tidspunktet for udviklings- medarbejdere i InvivoSciences, INC som udtænkt af og udviklet de robot protokoller beskrevet her. TW er CSO for InvivoSciences INC. SH er ansat i Gilson INC.

Acknowledgments

Dette arbejde er delvist understøttet af NIH tilskud, R44 GM087784 og R01 HL109505. Forfatterne takker de tekniske og OEM team på Gilson, INC for udvidet teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34 (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111 (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4 (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5 (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11 (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8 (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6 (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18 (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16 (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6 (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77 (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451 (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113 (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3 (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30 (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105 (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. , (2014).

Tags

Developmental Biology iPSC high-throughput robot væske-håndtering skalerbar stamceller automatiseret stamceller kultur 96 brønde
Skalerbar plade med 96 brønde Based iPSC Kultur og Produktion Ved hjælp af en robot Liquid Handling System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, … More

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter