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Developmental Biology

Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52755
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

Abstract

Progression continue dans la culture de cellules souches pluripotentes est de combler l'écart entre banc et chevet pour l'utilisation de ces cellules en médecine régénérative, la découverte de médicaments et de tests de sécurité. Afin de produire des souches biopharmaceutique et des cellules dérivées de cellules pour l'ingénierie tissulaire et la transplantation, une technologie cellulaire de fabrication rentable est essentiel. Le maintien de la pluripotence et une performance stable de cellules dans les applications en aval (par exemple, la différenciation cellulaire) dans le temps est primordial pour une production à grande échelle de la cellule. Pourtant, qui peut être difficile à atteindre, surtout si les cellules sont cultivées manuellement où l'opérateur peut introduire une variabilité importante ainsi que être prohibitif à l'échelle supérieure. Pour permettre à haut débit, la production de cellules souches à grande échelle et supprimer des protocoles de culture de cellules souches roman d'influence de l'opérateur à l'aide d'une paillasse multi-canal robot de manipulation de liquide ont été développés qui nécessitent une participation minimale de technicien ou d'expérience. Avecces induites cellules souches pluripotentes humaines protocoles (CISP) ont été cultivées dans des conditions sans alimentation directement à partir d'un stock congelé et maintenus dans des plaques à 96 puits. En fonction de la lignée cellulaire et le taux de mise à l'échelle désirée, l'opérateur peut facilement déterminer le moment de passage basée sur une série d'images montrant les densités de colonies optimales pour le fractionnement. Ensuite, les réactifs nécessaires sont prêts à effectuer une répartition de la colonie de nouvelles plaques sans étape de centrifugation. Après 20 passages (~ 3 mois), deux lignes iPSC maintenus caryotypes stables, ont exprimé des marqueurs de cellules souches, et différenciées en cardiomyocytes avec une grande efficacité. Le système peut effectuer ultérieur criblage à haut débit de nouveaux protocoles de différenciation ou manipulation génétique conçus pour plaques à 96 puits. Cette technologie permettra de réduire la charge de travail et technique pour produire un grand nombre de cellules souches identiques pour une myriade d'applications.

Introduction

L'utilisation de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) a considérablement augmenté depuis leur dérivation en 2007 1 pour les essais en enclos, la médecine régénérative et de la modélisation de la maladie 2-6. Cette demande vient de la capacité de iPSC pour obtenir un grand nombre de cellules pluripotentes qui peuvent être différenciées en cellules somatiques à une quantité inégalée. Comme les techniques de différenciation dirigés améliorer 7-10 et le développement de cellules humaines ou la modélisation de thérapie tissulaire et cellulaire augmente: 11 - 14, le fait de l'exigence de production de masse de CSPi de haute qualité. Il est largement cité qui, entre autres maladies, infarctus du myocarde ou remplacement fonctionnel des cellules B, il faudra des centaines de millions à des milliards de iPSC dérivée de cellules somatiques 15-18. La modélisation 3D des tissus En outre, de plus en plus complexe pour la découverte de médicaments et de therapy exigeront un grand nombre de cellules 9,13,19. Dans tous ces exemples, définis, uniforme et CSPi reproductibles doivent être disponibles et simples à produire.

Afin de produire des souches biopharmaceutique et des cellules dérivées de cellules pour l'ingénierie tissulaire et la transplantation, une technologie cellulaire de fabrication rentable est essentiel. La production à l'échelle des CSPi a mis l'accent sur ​​la culture de la suspension de 20 à 25 ou de la suspension de l'utilisation de substrats microporteuses 26 - 28 en partie parce que ces techniques sont déployés avec succès à grande échelle, non-iPSC, la production à base de eucaryote. Plusieurs groupes ont mis en évidence des systèmes de culture en suspension qui produisent des cellules souches pluripotentes 20,21,23,24,29. Cependant, ces approches utilisent des systèmes complexes et coûteux ne sont pas facilement disponibles pour les chercheurs en développement de nouveaux programmes de différenciation, de conduire l'ingénierie tissulaire et de faire laboratla recherche à l'échelle ory. En outre, la suspension et microporteuses cultures iPSC nécessitent une adaptation et des techniques ou des produits chimiques ne figurent pas dans la culture traditionnelle adhérente iPSC telles que l'utilisation continue de l'inhibiteur de la Rho-kinase, les agents anti-mousse et de filtration pour réguler l'agrégation. Le stress physique aux cellules est plus répandu en culture en suspension, introduit par agitation mécanique ainsi que lors de la collision microporteur. Ces problèmes limitent la prévisibilité et la vitesse à laquelle nouvellement généré lignées de cellules souches peuvent être cultivées en suspension. D'autres ont développé des systèmes de manutention de plaques robotiques qui imitent plaque techniques de culture 30,31 mais ces plates-formes exiger d'importants investissements pour l'équipement et l'expertise pour exploiter en plus des défis fondamentaux associés à la culture de cellules souches.

Le travail suivant décrit le développement et la pratique d'un système évolutif de la culture iPSC qui utilise un liquide robotique 8-canal standard autonomegestionnaire et des plaques à 96 puits. Cette méthode a été conçu pour combler l'échelle du laboratoire iPSC culture et à haut volume de production iPSC (par exemple, 10 de 7 à 1,5 x 10 9 cellules par semaine et par technicien) permettant ceux qui développent de nouvelles technologies iPSC faire évoluer facilement jusqu'à la production sans investissements importants de matériel ou de main-d'œuvre. Cette méthode est relativement peu coûteux à mettre en place, nécessite peu ou pas d'expérience de la culture de cellules souches, de la programmation ou de l'ingénierie, a une petite empreinte équipement sans la nécessité d'une hotte de culture cellulaire dédié, et utilise l'équipement de culture cellulaire standard pour permettre à moyen et à haut débit automatisé la production de cellules. L'objectif était de développer un système capable de la culture de cellules souches évolutive qui peut être utilisé par les laboratoires de nouvelles pour enrayer la culture de cellules, ceux qui trouvent culture manuelle un obstacle au développement de leurs idées ou de ceux qui veulent un moyen économique de produire de grandes quantités de cellules souches. La plate-forme présentée ici supprime influence technicienla culture de cellules souches et normalise les procédures d'alimentation et de passage pour permettre la production de cellules souches cohérente.

Protocol

Le système de manipulation de liquides robotique, qui, pour les protocoles suivants était pipetmaX de Gilson, facilite automatisé, la culture de cellules souches évolutive et la production tout en maintenant des conditions de culture adhérent traditionnels dans le format de plaque de 96 puits. Comme la culture traditionnelle de la plaque de 6 puits, CSPi sont cultivés avec ce protocole comme une monocouche de colonies distinctes, mais dans le format de plaque de 96 puits. Chaque puits peut être isogénique ou distincte et soit la configuration peut être cultivée en parallèle depuis le robot peut garder chaque puits séparés. La robotique iPSC routine de la culture typique comporte deux phases: un programme d'alimentation où les cultures sont alimentées sur un calendrier personnalisable et un programme de passage où l'utilisateur choisit la méthode de dissociation et de rapport de division contrôlant ainsi la densité de semis et le taux de l'échelle. Les protocoles suivants décrivent comment une nouvelle culture est commencé, comment l'alimentation et le passage sont accomplies et les programmes complémentaires qui facilitent la culture iPSC.

1. Préparation Gel matrice extracellulaire couché plaques à 96 puits

  1. Retirez l'emballage de six nouveaux, RT plaques à 96 puits et les placer sur la manipulation lit robot dans les positions 2, 3, 5, 7, 8, 9 (voir Figure 1A pour les postes de lit) liquide.
  2. Placez une pré-réfrigérés, 4 ° C 4-bien creux dans la position de lit 6.
  3. colonne de Charge 12 de la crémaillère de pointe en position 1 lit avec pré-réfrigérés, 4 ° C 200 conseils ul de pipette.
  4. Remplir le creux premier (plus à gauche) et dans la position de lit 6 avec 25 ml 4 ° C DMEM / F12 en versant une aliquote utilisant une technique stérile. Vous pouvez également utiliser une pipette pour effectuer le transfert.
  5. Enlever les couvercles des plaques à 96 puits et faites glisser chaque dans le rack spécialement conçu tenant du couvercle de plaque (PLHR, voir la figure 1A). Eviter le contactavec l'intérieur du couvercle de plaque.
    Remarque: Manipulation de l'intérieur d'un couvercle de plaque ou empiler les couvercles de la plaque où l'intérieur d'un couvercle touche l'extérieur d'un autre est une excellente voie de contamination.
  6. Utilisation du pavé de contrôle tactile robotique, appuyez sur la série suivante de boutons pour démarrer le processus et de pré-mouillage:
    1. Appuyez sur "Exécuter un protocole".
    2. Sélectionnez "extracellulaire gel de matrice Prewet» et appuyez sur Suivant.
    3. la décision de l'utilisateur: Appuyez sur "test" pour utiliser l'assistant étape-par-étape de pré-tester le programme sélectionné.
      Remarque: Le robot ne fonctionne pas, mais plutôt le logiciel teste le protocole pour les problèmes logiciels. Avec les protocoles établis, taraudage, "sauter setup" est acceptable.
    4. Appuyez sur "Protocole Exécuter".
  7. Pendant le processus de pré-mouillage (étape 1.6) passez à l'étape 1.8.
  8. Thaw sur la glace une aliquote de 4 mg facteur de croissance réduit gel de la matrice extracellulaire (GFRM) contenue dans un 50 mltube conique stocké à -80 ° C. Gardez l'aliquote sur la glace jusqu'au moment de servir.
    Remarque: Le GFRM va se solidifier si on les laisse venir à température ambiante et ne sera pas utile.
  9. Reprendre le 4 mg GFRM aliquote de 24 ml 4 ° C DMEM / F12 avec une pipette de 25 ml en verre. Lors du transfert du DMEM / F12, une pause pendant 2-3 sec pour permettre la pipette refroidir avant de remettre en suspension l'aliquote de GFRM.
  10. Lorsque le processus de pré-mouillage (étape 1.6) est terminée, passez à l'étape 1.11.
  11. Transférez les 24 ml de mélange GFRM DMEM / F12 pour le quatrième puits de la cuve en position de lit 6.
  12. Utilisation du pavé de contrôle tactile robotique, appuyez sur la série suivante de boutons pour démarrer le processus de revêtement de gel de la matrice extracellulaire:
    1. Appuyez sur "Exécuter un protocole".
    2. Sélectionnez "aliquote de gel de la matrice extracellulaire" et appuyez sur Suivant.
    3. la décision de l'utilisateur: Appuyez sur "test" pour utiliser l'assistant étape-par-étape de pré-tester le programme sélectionné.
      Remarque: Le robot ne fonctionne pas, mais rather le logiciel teste le protocole pour les problèmes logiciels. Avec les protocoles établis, taraudage, "sauter setup" est acceptable.
    4. Appuyez sur "Protocole Exécuter".
  13. Lorsque l'étape 1.12 est complète, remplacer les couvercles de la plaque.
  14. Transférer le gel revêtu des plaques à 96 puits matrice extracellulaire à un 37 ° C, 5% de CO 2, incubateur humidifié et il tenir pendant 24 heures à quel point les plaques seront prêts à utiliser ou stockées.
    Remarque: Dans des circonstances atténuantes, les plaques de gel de matrice extracellulaire nouvellement revêtues peuvent être utilisés après 15-30 minutes d'incubation, mais O / N à 24 heures d'incubation est recommandée.
  15. Protocole Répéter les étapes 1.1, 1.3, 1.5 à 1.6, 1.10, et de 1,12 à 14 jusqu'à l'ensemble de la DMEM / F12 avec GFRM est utilisé.

2. Enregistrement extracellulaire Gel matrice recouverte plaques à 96 puits

  1. Retirer le gel de la matrice revêtu des plaques à 96 puits extracellulaires à partir de la 37 ° C, 5% CO 2, incubateur humidifié.
  2. Facultatif: Allow la matrice extracellulaire gel revêtu des plaques à 96 puits à venir à la température ambiante avant de procéder à l'étape 2.3.
    Remarque: Cette étape facultative réduira accumulation de condensation lorsque les plaques sont placées à 4 ° C.
  3. Placez les plaques sur le liquide lit robot de manutention en positions 2, 3, 5, 7, 8, 9 (voir Figure 1A pour les postes de lit).
  4. colonne de Charge 12 de la crémaillère de pointe en position 1 lit avec RT 200 conseils ul de pipette.
  5. Placez un réservoir de quatre creux dans la position de lit 6.
  6. Ainsi 4 (droite) du réservoir avec RT DMEM / F12 remplir.
  7. Enlever les couvercles des plaques à 96 puits et faites glisser chaque dans le PLHR.
  8. Utilisation du pavé de contrôle tactile robotique, appuyez sur la combinaison de boutons suivants:
    1. Appuyez sur "Exécuter un protocole".
    2. Sélectionnez "aliquote de gel de la matrice extracellulaire" et appuyez sur Suivant.
    3. la décision de l'utilisateur: Appuyez sur "test" pour utiliser l'assistant étape-par-étape de pré-tester le programme sélectionné.
      Remarque: Le robot ne court pas, mais plutôt le logiciel teste le protocole pour les problèmes logiciels. Avec les protocoles établis, taraudage, "sauter setup" est acceptable.
    4. Appuyez sur "Protocole Exécuter".
  9. Une fois terminé, remplacer les couvercles de la plaque et enlever les plaques du lit de la machine.
  10. Enrouler autour de tout le côté de chaque gel enrobé de la matrice extracellulaire de la plaque à 96 puits (où le couvercle rencontre la plaque) avec un pouce par une bande de film de paraffine de 6 pouces. Assurez-vous d'étirer le film de paraffine pour créer un joint étanche à l'air.
  11. Facultatif: Marquez les plaques avec la date de revêtement de gel de la matrice extracellulaire terminée, le gel de la matrice extracellulaire numéro de lot, nom d'utilisateur et toute autre information.
  12. Stocker les plaques à 4 ° C où ils seront bonnes à utiliser pour un maximum de deux semaines.
    Remarque: Les plaques ont été utilisées avec succès au-delà de la limite de deux semaines, cependant, il est déconseillé.

3. Réalisation d'une colonie de cellules souches semis DensitéDégradé dans la plaque de 96 puits Format d'une culture vivante ou congelée: Comment faire pour démarrer ou Restaurer intervalles de passage normal à un Stem Cell Line

  1. Si à partir d'une culture congelée, passez à l'étape 3.2. Si à partir d'une culture de cellules souches en direct déjà sur une plaque, commencer à l'étape 3.5.
  2. Décongeler la culture congelée en faisant tourbillonner le tube dans un bain d'eau à 37 C ° jusqu'à ce que de seulement un petit morceau de glace reste.
  3. Facultatif: Diluer les cellules décongelées dans 10 ml RT endiguer milieux de croissance cellulaire (SCGM), centrifuger 2 min à 300 g, aspirer les médias surnageant et remettre le culot de cellules souches dans 7 ml SCGM frais contenant 10 uM Y27632.
    Remarque: Cette étape élimine report des médias congélation.
  4. Passez à l'étape 3.6.
  5. Si à partir de direct, déjà plaquée cellules souches: les cellules passage comme d'habitude en utilisant la dissociation enzymatique ou non enzymatique. Essayez de récolter un total de 1,5 à 3.000.000 cellules; habituellement un puits d'une plaque à six puits. Centrifuger les cellules récoltées pour2 min à 300 g, aspirer les médias surnageant et remettre le culot de cellules souches dans 7 ml SCGM frais contenant 10 uM Y27632. Passez à l'étape 3.6.
  6. Assurer les cellules, soit à partir d'une culture congelée ou en direct, sont en suspension dans 7 ml RT SCGM avec 10 uM Y27632.
  7. colonne de Charge 12 de la crémaillère de pointe dans le lit la position un avec RT 200 conseils ul de pipette.
  8. Placez un réservoir de quatre creux dans le lit en position 2.
  9. Placez un nouveau gel de la matrice extracellulaire revêtu plaque de 96 puits pré-chauffé à 37 ° C en position de lit 5 et retirez le couvercle de le placer dans le PLHR.
  10. Transférer les 7 ml de cellules remises en suspension bien 3 du réservoir à la pipette ou stérile à verser.
    1. Utilisation du pavé de contrôle tactile robotique, appuyez sur la combinaison de boutons suivants:
    2. Appuyez sur "Exécuter un protocole".
    3. Sélectionnez "gradient de densité de semis" et appuyez sur Suivant.
    4. la décision de l'utilisateur: Appuyez sur "test" pour utiliser l'assistant étape-par-étape de pré-tester la sélectionprogramme éd.
      Remarque: Le robot ne fonctionne pas, mais plutôt le logiciel teste le protocole pour les problèmes logiciels. Avec les protocoles établis, taraudage, "sauter setup" est acceptable.
  11. Appuyez sur "Protocole Exécuter".
  12. Lorsque la série de dilution est terminée, re-couvrir la plaque et placer dans un 37 ° C, 5% de CO 2, incubateur humidifié jusqu'à la prochaine tétée.
  13. Facultatif: Label de la plaque avec la date, l'information de la souche, nom d'utilisateur, le type de support et d'autres renseignements pertinents.
  14. Au cours des prochains jours, nourrir la plaque de 96 puits au besoin en utilisant le protocole 4 ci-dessous.
    Remarque: Un plat typique de cellules souches, il faudra un changement de support complet une fois toutes les 24 heures et le SCGM ne contient pas Y27632 pour l'alimentation; que pendant l'ensemencement initiale après passage. Avant de se nourrir, de vérifier la plaque de la contamination et de la densité de la colonie. Voir l'étape 3.16 pour plus sur le contrôle de la densité de la colonie.
  15. Au cours des prochains jours, plusieurs colonnes près de la centrer de la plaque (généralement colonnes 5-8) aborderont une densité idéal pour le passage; d'identifier cette densité, comparer la plaque de 96 puits à la plage de densité montre la figure 3B avec les informations suivantes à l'esprit:
    1. Passage lorsque l'espace entre la majorité des colonies est d'environ 25% du diamètre de la colonie adjacente.
      Remarque: La logique d'identifier le temps de passage est que un autre cycle d'alimentation et la croissance se traduirait par des colonies qui entrent en contact, ce qui devrait être évité.
  16. Pour démarrer une plaque uniformément dilué et de commencer la culture régulière, sélectionnez une colonne qui est à la densité idéale et le passage. Voir Protocole 5 au passage.

4. Alimentation 96 puits Colonies Plate Stem Cell

Remarque: Le protocole suivant décrit l'alimentation d'un 96 puits de cellules souches plaque de colonie. La technique peut être étendu pour accueillir 6 plaques totales en parallèle.

  1. Retirez le 96 puits stem plaque des colonies de cellules de la 37 ° C, 5% CO 2, incubateur humidifié.
  2. Vérifier la plaque de contamination et la densité cellulaire. Afin d'alimenter, en sorte que la densité de la colonie est inférieure à la densité de passage idéal. Voir la figure 3B pour des informations sur la densité.
    Remarque: La contamination peut présenter médias comme turbides et être accompagnée d'une odeur désagréable. Petits agrégats, de toute évidence non-iPSC peuvent également être visibles sous inspection microscopique. Pour évaluer la densité cellulaire, voir l'étape 3.16.1 ci-dessus.
  3. Placer la plaque de colonies de cellules à 96 puits tige en position lit 3 sur une pente à 37 ° C rampe.
  4. colonne de Charge 12 de la crémaillère de pointe en position 1 lit avec RT 200 conseils ul de pipette.
  5. Placez un bac 4 puits dans le lit en position 2.
  6. Remplissez bien 3 de la cuve en position de lit 2 avec 8 ml frais, RT SCGM sans Y27632 soit par stérile verser ou pipette de transfert.
  7. Retirer la plaque couvercle 96 puits souches de colonies de cellules plaçant dans le PLHR.
  8. En utilisant lerobotique pad contrôle tactile, appuyez sur la combinaison de boutons suivants:
    1. Appuyez sur "Exécuter un protocole".
    2. Sélectionnez "Colony nourrir une plaque" et appuyez sur Suivant.
    3. la décision de l'utilisateur: tapez "test" pour utiliser l'assistant étape-par-étape de pré-tester le programme sélectionné.
      Remarque, le robot ne fonctionne pas, mais plutôt le logiciel teste le protocole pour les problèmes logiciels. Avec les protocoles établis, taraudage, "sauter setup" est acceptable.
    4. Appuyez sur "Protocole Exécuter".
  9. Lorsque le protocole d'alimentation est terminée, re-couvrir la plaque de la colonie de 96 puits de cellules souches et de revenir à la 37 ° C, 5% de CO 2, incubateur humidifié jusqu'à la prochaine alimentation ou le passage est nécessaire. Cela est généralement nécessaire après 24 h.
    Remarque: Il est recommandé d'enregistrer l'événement d'alimentation sur le couvercle de la plaque avec la date, le type de support, nom d'utilisateur et d'autres informations pertinentes.

5. Le repiquage 96 puits Plmangeaient des colonies de cellules souches

  1. Après plusieurs cycles d'alimentation de la plaque de 96 puits colonie de cellules souches sera prêt au passage. Ce protocole décrit passage d'une colonne à une plaque à 96 puits, ce qui représente un rapport 01:12 de fractionnement. L'utilisateur peut définir le rapport de division et sélectionnez un certain nombre de puits ou des colonnes de diviser, y compris le choix des puits qui peuvent ne pas être adjacentes.
  2. Comparer la densité de la plaque de 96 puits colonie de cellules souches à la figure 3B pour déterminer si au passage. La densité de passage est idéal lorsque l'espace entre la majorité des colonies est d'environ 25% du diamètre de la colonie ou une alimentation adjacent ultérieur entraînerait dans les colonies en croissance dans une autre.
  3. Examinez la cellule souche plaque de colonie de 96 puits sous un microscope pour assurer qu'il n'y a pas de contamination.
  4. Placer la plaque de colonies de cellules à 96 puits tige en position lit 3 sur une pente à 37 ° C rampe.
  5. Charge colonnes 8-12 dans le rack pointe de chargement en position 1 lit avec RT 200 pi pipetteconseils.
  6. Placez un bac 4 puits dans le lit en position 2.
  7. Laisser bien creux 1 vide, mettez 8,5 ml SCGM + 10 uM Y27632 dans le puits 2, injecter 3,5 ml 30% protéolytique et réactif de dissociation collagénolytique (ou d'un réactif à base de dissociation EDTA) dans le puits 3, mettre 4,5 ml de PBS dans le puits 4.
    Remarque: Tous les réactifs peuvent être à température ambiante ou à 37 ° C. RT protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation à 30% diluée avec du PBS a été utilisé pour la adipeux et des fibroblastes dérivés des iPSC culture décrite ici.
  8. Placez une nouvelle, 37 ° C gel de matrice extracellulaire revêtu plaque de 96 puits pré-chauffé en position de lit 5.
  9. Retirer la plaque de la colonie couvercle 96 puits de cellules souches, ainsi que le nouveau couvercle de plaque de 96 puits et de les placer à la fois dans le PLHR.
  10. Utilisation du pavé de contrôle tactile robotique, appuyez sur la combinaison de boutons suivants:
    1. Appuyez sur "Exécuter un protocole".
    2. Sélectionnez "Colonie de Split 01h12 Colonne 1" et appuyez sur Suivant.
    3. la décision de l'utilisateur: Appuyez sur "test" à utiliserl'assistant étape-par-étape de pré-tester le programme sélectionné.
      Remarque: Le robot ne fonctionne pas, mais plutôt le logiciel teste le protocole pour les problèmes logiciels. Avec les protocoles établis, taraudage, "sauter setup" est acceptable.
    4. Appuyez sur "Protocole Exécuter".
  11. Une fois le protocole de passage est terminé, re-couvrir les deux plaques.
  12. Facultatif: Label de la nouvelle plaque avec les informations requises (ie, la date, la lignée cellulaire, numéro de passage, type de média, le nom utilisateur, etc.).
  13. Les deux plaques de retour de 37 ° C, 5% de CO 2, jusqu'à ce que l'incubateur humidifié à côté alimentation ou le passage est nécessaire. Remarque: La prochaine tétée est généralement après 24 heures.
    Remarque: Les cellules et les colonies doivent joindre à la plaque dans les 2-3 h de fractionnement et de regarder très étalées. Cela est dû à la présence d'un inhibiteur de Rho-kinase et les cellules se condense et présentent la morphologie des cellules souches caractéristique (c.-à-colonies pavées emballé with petit volume de cellule à grand taux de noyau) après le premier inhibiteur alimentation libre Rho-kinase.

6. récolte 96 puits cellules souches Plate pour la production

Remarque: les colonies de cellules souches peuvent être récoltées pour un usage à tout moment pendant la culture. Habituellement, cela se produit lorsque les cellules sont prêtes au passage (voir le protocole 5). Ce protocole décrit comment récolter onze colonnes à partir d'une plaque de 96 puits colonie de cellules souches.

  1. Examinez la cellule souche plaque de colonie de 96 puits sous un microscope pour assurer qu'il n'y a pas de contamination.
  2. Placer la plaque de colonies de cellules à 96 puits tige en position lit 3 sur une pente à 37 ° C rampe.
  3. colonnes de charge 11 et 12 dans le rack pointe de chargement en position 1 lit avec RT 200 conseils ul de pipette.
  4. Placez un bac 4 puits dans le lit en position 2.
  5. Laissez bien creux 1 vide, mis 8,5 ml SCGM dans le puits 2, mis 3,5 ml 30% protéolytique et réactif collagénolytique de dissociation (ou EDTA réactif de dissociation base) dans le puits3, mis 4,5 ml de PBS dans le puits 4.
    Remarque: Tous les réactifs peuvent être à température ambiante ou à 37 ° C.
  6. Retirer le couvercle de la plaque de 96 puits endiguer colonie de cellules et de place dans le PLHR.
  7. Utilisation du pavé de contrôle tactile robotique, appuyez sur la combinaison de boutons suivants:
    1. Appuyez sur "Exécuter un protocole".
    2. Sélectionnez «Colonnes Colony récolte 2-12" et appuyez sur Suivant.
    3. la décision de l'utilisateur: Appuyez sur "test" pour utiliser l'assistant étape-par-étape de pré-tester le programme sélectionné.
      Remarque: Le robot ne fonctionne pas, mais plutôt le logiciel teste le protocole pour les problèmes logiciels. Avec les protocoles établis, taraudage, "sauter setup" est acceptable.
    4. Appuyez sur "Protocole Exécuter".
      Note: Une fois la procédure de collecte est terminée, les cellules seront en auge bien 2 et prêt pour la collecte.

Representative Results

Le développement d'une plaque à base de plate-forme robotique tige de culture cellulaire.

La demande pour les CSPi se développe en raison de leur utilité dans le développement de médicaments et la médecine régénérative. Pourtant, la production évolutive a mis l'accent sur ​​la culture de suspension 32 dans un équipement relativement complexe qui exclut de nombreux chercheurs et diverge à partir de méthodes de culture adhérentes établies. Plutôt que de modifier radicalement plaques éprouvée souches basée méthodes de culture de cellules, telles que le passage à une culture en suspension ou en utilisant un microsupport, nous nous sommes concentrés sur la miniaturisation et l'automatisation de nos techniques existantes de culture iPSC adhérentes. Le premier objectif était d'automatiser l'alimentation et de repiquage de normaliser le processus de culture entière. Une plate-forme capable d'élargissement rapide avec la technologie existante était également nécessaire. Pour atteindre ces objectifs une méthode a été conçue pour des cellules souches de la culture dans une plaque de 96 puits en utilisant un système de manipulation de liquides automatisé (Figure 1). Le protPROTOCOLES développés ici avec le robot de manipulation de liquides pour l'alimentation et le passage ne nécessitent pas une étape de centrifugation ou une surveillance continue par un technicien. Ces protocoles ont été élaborés avec deux lignes iPSC gratuits desserte; une dérivée de fibroblastes et l'autre de 33 cellules adipeuses.

Le système de manipulation de liquide commandé par ordinateur (figure 1A) est constitué d'un plateau qui se déplace avant et arrière. Le lit a neuf, environ cavités numérotées 5 x 3,3 pouces avec une pression clips de fixation pour accepter des plaques de culture cellulaire standard, réservoirs de liquide et autres matériel personnalisé. Les pipettes tête se déplace de gauche à droite (perpendiculaire au mouvement de lit) ainsi que de haut en bas. Ensemble, avec le lit, la tête de pipette peut être programmé pour supprimer ou fournir des médias partout sur le lit après avoir ramassé des embouts de pipette à partir d'un support rechargeable. Le cas échéant, chacun des 96 puits peuvent être séparés afin d'éliminer une contamination croisée. Dans la configuration actuelle, 0 à200 pi de médias peuvent être déplacés par chaque extrémité de la tête de la pipette, mais d'autres gammes de volumes sont possibles selon la taille de la pointe.

Lorsque passage de cellules souches dans des plaques standard, enzymatique ou chimique dissociation nécessite généralement incubation à 37 ° C. Test initial confirmé dissociation avec un protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation ou d'un réactif à base de EDTA mieux performé à 37 ° C à RT à la fois pour le temps de dissociation et l'homogénéité de la taille des colonies produite pour nos deux 96 puits lignes iPSC (données non présentées). Pour automatiser le processus de scission et d'éviter le déplacement des plaques dans et hors d'un incubateur, des rampes inclinées, à température contrôlée qui acceptent et positionner de manière reproductible plaques standard de culture ont été construits (figure 1A). Lorsque les rampes ont été chauffés à 37 ° C, une protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation ou de l'EDTA dissociation des iPSCs de plaques à 96 puits sur la base était comparable aux plaques placées dans un incubateur à 37 ° C (données not représenté). Les rampes en pente ont également été utilisés pour permettre aux embouts de pipette pour recueillir le contenu d'un ensemble de puits (moins de 5 pi de volume résiduel) en atteignant le point dans le puits alors que l'aspiration la plus basse d'une plaque plane laissé un volume résiduel d'environ 10-15 pi, résultant une perte de cellule. La rampe en pente a également permis aux puits pour être lavés (triturés) en éjectant les médias au sommet du puits incliné et recueillir au fond.

Robot culture de cellules souches dans le format de plaque à 96 puits; et des passages d'alimentation.

Culture de iPSCs l'aide du système de manipulation de liquide robotisé comporte deux phases; passage et l'alimentation. Quand une colonie est prêt à passage, elle est divisée en un rapport prédéterminé pour ensemencer une nouvelle plaque qui est ensuite amené à intervalles réguliers jusqu'à ce qu'il soit à nouveau prêt à passage (figure 1B). Les cultures congelées ou non de 96 puits peuvent être démarrés dans le format de 96 puits et entrez immédiatement le passage / alimentationcycle. Les cellules qui ne sont pas utilisés pour maintenir la colonie, qui est la majorité d'une plaque, sont récoltées pour d'autres usages et représentent le composant de production de ce système.

Nourrir 96 puits CSPi culture est accomplie lorsque tout ou partie des médias est enlevé après une période de culture et déposé dans un réservoir de déchets. Puis milieu frais est aliquoté à la même plaque. Le robot peut utiliser de nouvelles astuces et les creux des médias pour séparer chaque puits pour l'alimentation entièrement personnalisable, y compris le mélange des milieux conditionnés avec les nouveaux médias.

Passage typique des cellules souches nécessite un procédé de dissociation et souvent une étape de centrifugation. Les protocoles décrits ici vise à normaliser la dissociation et d'éliminer centrifugation. Le protocole de passage commence lorsque le robot fournit réactif de dissociation de plaques à 96 puits monté sur 37 ° C rampes inclinées. Après un temps prédéterminé, les cellules dissociées sont collectées avec une action de lavage où l'utilisateur a control sur la position, la répétition, le volume et le taux de trituration. Enzyme temps, le taux de trituration et le nombre de répétitions de trituration étaient suffisantes pour faire varier la taille de la colonie dissociée et l'homogénéité (Figure 2), mais chaque paramètre est réglable pour répondre aux exigences d'une cellule donnée ligne. Cette commande supprime la variabilité introduite par des techniciens qui pipette avec des taux variables, les positions et les répétitions. Une fois que les cellules dissociées sont collectées et rassemblées dans un réservoir avec du milieu frais, ils sont distribués dans une nouvelle plaque. Pour éviter de centrifugation et de semis problèmes de dégradation du substrat ou la mort cellulaire due à l'action de l'enzyme, réactif de dissociation a été dilué au point minimale de dissociation acceptable qui a abouti à l'ensemencement fiable. Cette technique est efficace pour une protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation dans un milieu mTeSR1 34, qui a une teneur relativement élevée en protéines, mais également efficace dans des milieux protéiques faibles comme Essential-8 35

Le contrôle de la densité d'ensemencement des cellules souches après le passage est primordiale pour la culture de cellules souches routine et réussie. Ensemencement trop faible ou élevé peut entraîner dans la différenciation extra-utérine et la perte de la pluripotence en plus de causer des intervalles de passage irréguliers. La culture de cellules souches typique repose sur le ratio fractionnement où un puits d'une plaque à 6 puits est utilisée pour ensemencer une toute nouvelle plaque de 6 puits (un 1: split 6). Avec le robot de manipulation de liquide, ce rapport peut être ajusté en fonction des besoins de l'utilisateur (par exemple, 1: 6, 1: 9, 1:12, etc.) et il a le plus d'influence sur l'intervalle de passage. Le robot peut récolter moins une colonne, une colonne entière (8 puits), ou plus d'une colonne en fonction des besoins de l'utilisateur, qui doivent être déterminées de manière empirique. Les CSPi adipeux et fibroblastes dérivés a maintenu un programme d'alimentation de trois jours régulier avec passage sur le quatrième jour quand diviser 01h12. Dans ce cas, une colonne a été récolté et utilisé pour ensemencer une nouvelle plaque de 96 puits, créant une scission 01:12 à chaque cycle (figure 3A). Les 11 puits restants étaient alors disponibles pour les applications en aval. Pour récolter les 11 puits de production, le protocole de passage a été répété, sauf les cellules ont été déposées dans une auge de collecte. En variante, les cellules peuvent être laissées sur la plaque et utilisées directement.

Pour atteindre cohérente densité d'ensemencement un passage à l'sans compter, et de maintenir un calendrier de fractionnement de routine, nos protocoles appellent pour diviser le même nombre prédéterminé de colonnes quand la colonie est à une densité idéal pour le passage. Pour aider les utilisateurs à identifier la bonne densité pour le passage, une série d'images a été généré montrant une gamme de densités, avec une densité de passage idéal mis en évidence (figure 3B). Pour déterminer quand au passage, un technicien examine leur assiette et la compare à l'échelle de l'image de densité. L'idéel densité de passage est déterminée à partir de la culture des iPSCs adipeux et fibroblastes dérivée et jugée lorsque l'espace entre la plupart des colonies était d'environ 25% du diamètre de la colonie adjacente. Il est important que les colonies soient distribués de façon homogène. Cette quantité de séparation de la colonie est en corrélation avec la densité maximale souhaitable en raison d'un cycle d'alimentation supplémentaire se traduirait par des colonies de toucher, qui est un déclencheur de différenciation ectopique.

Un protocole nécessaire développé ici traite de la façon de démarrer une culture dans le format de 96 puits et la façon de réinitialiser une culture après un problème de densité. Quand une nouvelle culture est démarré, la meilleure densité de semis et le nombre de cycles d'alimentation avant repiquage sont inconnus. Pour assurer une densité utilisables après le semis, le robot distribue des cellules existantes ou décongelés à travers une plaque de 96 puits dans une dilution en série (figure 4A). Exemple résultats d'un tel gradient sont représentés sur la figure 4B-E. Après plusieurs alimentationcycles, certaines colonnes approchent la densité idéale pour diviser, à quel point un technicien utilise le robot pour ensemencer une plaque uniformément dilué pour commencer la culture régulière. Ce protocole de gradient de densité a également été utilisé pour restaurer des intervalles de passage réguliers et colonie homogénéité à une plaque irrégulière. Si le passage est retardé ou manqué, la densité et la taille de la colonie devient trop élevé, alors que si le passage est trop tôt, la densité de la colonie est trop faible et des colonies individuelles peut devenir trop volumineux sans être distribuée uniformément à travers le puits. Le protocole de gradient de densité résout ces problèmes et permet à l'utilisateur de redémarrer en sélectionnant un ensemble idéalement ensemencée de puits.

Deux lignes iPSC restés pluripotentes après 3 mois de culture robotique.

Maintien de la pluripotence des cellules souches peut être affectée par des conditions de culture 36,37. Pour évaluer si adipeux et fibroblastes dérivés lignes iPSC (un iPSC, f-iPSC, respectivement) maintenu pluripotency lorsqu'elles sont cultivées de manière robotisée dans des plaques à 96 puits pendant une période prolongée de temps, les deux lignes ont été cultivées sur le robot de manipulation tels que décrits ci-dessus pendant 3 mois, puis les marqueurs de pluripotence liquide ont été examinés. Pour cette période, les deux lignes ont été passées avec un réactif de dissociation protéolytique et collagénolytique de plus de 20 fois sans centrifugation. Plaques à 96 puits fixe à partir d'une des lignes et iPSC-f-iPSC colorées pour Oct4 et Nanog exposées accumulation nucléaire de ces marqueurs tandis que SSEA-4 a été observée sur la surface des cellules (Figure 5A-G). Ceci est cohérent avec les rapports précédents pour CSPi pluripotentes 38-41. Contre-coloration avec du DAPI n'a pas révélé d'autres cellules qui ne sont pas aussi positifs pour les trois marqueurs de la pluripotence. Les anomalies chromosomiques sont couramment observées au cours de la culture de cellules souches 42,43 mais peuvent ne pas affecter la distribution des marqueurs de la pluripotence comme ceux montrés sur la figure 5A-L. Kanalyse de aryotype révélé deux lignes iPSC robotisée passages avaient 46 chromosomes normaux, suggérant la méthode de culture robotique n'a pas introduit une instabilité chromosomique delà de ce qui pourrait se produire normalement (Figure 5M-N).

Pour sonder tige expression des gènes marqueurs des cellules 1,41,44,45 établi dans les lignes iPSC robot en culture, l'ARN total a été recueilli en parallèle à la coloration et analyse du caryotype. Les deux plaques à 96 puits lignes iPSC avaient expression similaire de marqueurs de pluripotence NANOG, POU5F1 et REX1 alors cardiomyocytes différenciés de chaque ligne ne l'ont pas, ni ne une ligne distincte des fibroblastes dermiques humains (HDFS) (figure 6). Les cardiomyocytes dérivés des deux lignes étaient MYL7 positif alors que les HDFS et les cellules souches ne exprimaient MYL7. Les deux lignes iPSC ont été différenciées en cardiomyocytes avec la petite molécule, Wnt technique de manipulation de la voie récemment décrit 46 (Figure 7). La différenciation en cardiomyocytes dans le format à 96 puits a réussi à plus de 80% des puits (données non présentées). Ensemble, ces données suggèrent 3 mois et plus de 20 passages de culture robotique ont donné lieu à des cellules normales dans le chromosome présentant un programme de transcription conforme à la pluripotence qui étaient également capables de différenciation en cardiomyocytes.

Figure 1
Figure 1. Présentation de l'appareil de culture de cellules souches robotique et typique de routine de la culture iPSC. (A) Robotic système de manutention de liquides montré avec la disposition de lit typique pour 96 puits endiguer la culture cellulaire. Réactifs liquides nouveaux embouts stériles de pipette (TIPS), conteneur à déchets amovible pointe (de déchets), multi-puits creux autoclavable à tenir nécessaires (liquides), des plaques à 96 puits sont positionnés un d supporté sur une température contrôlée, rampe inclinée (des plaques à 96 puits), 8 canaux tête de pipette robotisée qui se déplace à gauche / droite et haut / bas (tête Pipet). maintien de couvercle rack Plate (PLHR). numéros de position de Bed-dessous dans le tableau. La culture (B) Robotic iPSC comporte deux phases: Alimentation et Passage. Le cycle de production de la cellule commence au moment où une plaque de colonie est prêt à passage. L'utilisateur choisit le rapport souhaité au passage au et les graines de robots un nouveau groupe de plaques à 96 puits, puis nourris à des intervalles réguliers jusqu'à ce que prêt pour le passage à nouveau. Lorsque les plaques sont prêtes à passage, la plupart de chaque plaque est pas utilisé pour ensemencer des plaques de colonies ultérieures et est disponible pour d'autres utilisations, ce qui représente la phase du système de production. Lignées de cellules congelées ou existants peuvent être introduites à tout moment et maintenus dans le cycle charge / passage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

e_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figure 2
Figure 2. Des paramètres de manipulation des liquides robotique peut être utilisé pour contrôler les caractéristiques iPSC colonie de dissociation. Chaque image représentant montre fibroblastes provenant CSPi dissociées après le traitement indiqué tout en suspension dans le 96 puits. (Rangée du haut, A - C) Enzyme Temps, aucune trituration. IPSCs fibroblastes dérivés cultivées dans des plaques à 96 puits ont été soumis à une période de protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation de dissociation et aucune augmentation de trituration robotique a été effectuée. (Rangée du milieu, D - F) Taux de trituration, 3 minutes enzyme. Les cellules ont été exposées à trois minutes de traitement protéolytique et collagénolytique de réactif de dissociation et des milieux de croissance de 175 ul a été appliqué à la pipette dans chaque puits et vers le haut et vers le bas une fois, au taux indiqué. pl / sec = p microlitreser seconde. (Rangée du bas, G - I) trituration répétitions, 3 minutes enzyme, 160 pi / sec. Les cellules ont été exposées à protéolytique et collagénolytique réactif de dissociation pendant 3 minutes, 175 milieux de croissance ul a été appliqué, puis trituré à 160 pi / sec pour le nombre de répétitions indiqué. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. adipeux typique et fibroblastes iPSC programme d'entretien de la colonie et une série d'images de densité de la colonie afin de déterminer le moment de passage de maintenir un cycle régulier d'alimentation / passage. (A) Commençant par un tissu adipeux ou fibroblastes 96 puits colonie iPSC prêt à passage, une colonne de cellules a été passé sur le robot sans centrifugation et on le dilue12 nouvelles colonnes qui ont été nourris à des intervalles spécifiques par la suite jusqu'à la plaque était prêt à nouveau passage. Pour la production de la cellule, les colonnes non utilisées pour maintenir la colonie ont été recueillies et soumises à des passages pour une utilisation ultérieure. Tout nombre de colonnes peut être repiqué pour contrôler le taux d'expansion. (B) pour déterminer quand passage, une série d'images de densité capturé toutes les 24 heures a été fournie aux utilisateurs. Dans la zone rouge en haut (dans les 72 heures après l'ensemencement initial) la colonie est pas assez dense pour passage et doit être nourri. Lorsque la densité correspond à celle affichée dans la zone verte (à ~ 96 h), la colonie est à une densité idéal pour le passage. En 120 heures, la colonie est trop dense pour ce scénario passage et doit être évitée. Ce dernier peut être résolu avec un gradient de densité de semis, mais la culture de routine à cette densité est fortement déconseillée. Barre blanche est égale à 200 uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand versisur ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. 96 puits système de culture robotique permet aux utilisateurs de démarrer les cultures de lignées de cellules congelées ou actives et effectuent un gradient d'ensemencement. (A) Une solution de cellules est préparé par l'utilisateur à partir d'un stock de cellules congelées ou après la récolte d'une culture active et placé sur le robot. Le système robotisé effectue ensuite un protocole de dilution en série à distribuer la solution initiale de cellules le long de la plaque de 96 puits avec le gradient de densité distribué par colonne. (B - E) Exemples de la densité des cellules à partir de quatre des douze colonnes de A, 48 h après le protocole d'ensemencement à gradient de densité. Des lignes blanches égalent 225 um. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cettefigure.

Figure 5
Figure 5. pluripotence est maintenue pendant adipeux et fibroblastes dérivée lignes iPSC pendant 96 puits pour culture de robot 22 (adipeux) ou 23 (fibroblastes) passages (~ 3 mois). (A - L) adipeuse et iPSC fibroblastes provenant des lignées cellulaires ont été robotique nourris et des passages comme décrit dans le texte sans centrifugation dans des plaques à 96 puits pendant 22 ou 23 passages puis fixées et colorées pour les marqueurs de pluripotence Oct4, Nanog, ou SSEA4 avec colorant DAPI. Barre blanche est égale à 100 um. (M - N). Cultures parallèles à celles décrites dans A ont été soumis à l'analyse du caryotype qui a révélé un complément normal de 46 chromosomes S'il vous plaît cliquez ici pour afficher une version plus grande of ce chiffre.

Figure 6
Figure 6. adipeux (96-A) et de fibroblastes (96-F) dérivé CSPi cultivées depuis plus de 20 passages dans le format de 96 puits robotique maintenu l'expression du gène de la pluripotence et différenciées en cardiomyocytes. ARNm total a été extrait de deux lignes iPSC robotisée culture ainsi que des cardiomyocytes différenciés des deux lignes (CM-A = adipeux cardiomyocytes iPSC dérivés, CM-F = fibroblastes iPSC dérivé cardiomyocytes, recueilli 14 jours après induction de la différenciation) et utilisé pour la RT-PCR pour sonder des marqueurs de la pluripotence NANOG, POU5F1, REX1, cardiomyocytes marqueur MYL7 et de contrôle de chargement GAPDH. Fibroblastes dermiques humains (HDF) ont également été collectées et utilisées en tant que non-iPSC, le contrôle non-cardiomyocytes. S'il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. fibroblastes et adipeux dérivé CSPi ont maintenu la capacité de se différencier en cardiomyocytes après long terme de 96 puits culture robotique (A - H). Adipeux et CSPi de fibroblastes cultivés dans le format de 96 puits robotique pour plus de 20 passages ont été différenciées en cardiomyocytes . 14 jours après induction de la différenciation, plaques lié cardiomyocytes 96 puits ont été dissociés et réétalées à une faible densité sur des lames de verre pour un marquage de la troponine T (rouge), la F-actine (vert) et noyaux (bleu). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

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Figure 8. Mettre en place la culture de cellules souches plaque de 96 puits. Échelle de la production de cellules souches dépend du nombre de plaques utilisées pour ensemencer le groupe suivant de plaques. L'utilisateur peut soit maintenir un niveau de production par passage le même nombre de plaques à chaque occasion scission ou d'accroître la production par ensemencement plusieurs plaques. Par exemple, dans le cycle 0, une plaque de 96 puits est des passages à douze nouvelles plaques (cycle 1), la création d'une expansion pli 12. Ce taux peut être maintenu que si l'un des douze plaques est un passage à une nouvelle série de douze plaques (Cycle 1 à 2) ou élargi par passage de plusieurs plaques (cycle 2 à 3). Au cours de passage, toutes les plaques ne sont pas utilisées pour maintenir la colonie sont disponibles pour les applications en aval. Par conséquent, les plaques 12 de façon routinière repiquage peut donner jusqu'à 144 plaques en deux passages 12 pour l'entretien de la colonie et 132 à d'autres fins."> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9. Efficacité de la culture basée plaque de 96 puits pour la production de cellules dépasse largement la culture manuelle. Comme indiqué dans la figure 8, une plaque peut être repiqué d'ensemencer douze plaques, qui peuvent ensuite être passées à 144 plaques. Ce taux d'expansion peut être réalisé en deux occasions séparées. Un technicien nécessite environ 3,5 minutes pour nourrir une plaque de 6 puits alors qu'ils dépensent environ 30 secondes avec une plaque de 96 puits pour l'examiner sur le microscope et le placer sur le robot. Si le technicien est en train 144 plaques, ils vont passer environ 1,2 plaques de manutention hr lorsque l'alimentation avec le robot alors que la culture manuelle nécessitera un 8 h dédié à nourrir. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.

Discussion

Dans la présente étude, nous avons développé une méthode de culture robotique pour la production iPSC que miniaturise et automatise l'alimentation et le passage dans un format de plaque à 96 puits, tout en permettant une échelle efficace jusqu'à. Un robot de manipulation liquide a été utilisé pour nourrir régulièrement colonies iPSC et leur passage à intervalles réguliers par dissociation enzymatique. Le robot est également programmé pour produire des plaques revêtues de gel de la matrice extracellulaire et effectuer un gradient de densité d'ensemencement. Lorsque fibroblastes et adipeux dérivé iPSCs ont été cultivées dans ce système pendant plus de 20 passages, environ 3 mois, la pluripotence a été maintenue, tout comme les caryotypes stables. Les deux lignées cellulaires sont capables de différenciation en cardiomyocytes. Ensemble, la collecte des protocoles décrits ici permet aux utilisateurs avec très peu d'expérience de la culture de cellules souches, ou l'accès limité à l'équipement de culture spécialisée, à la culture de cellules souches et d'atteindre la production de cellules de haute ou de la manipulation avec un minimum de travail et le coût multi-ligne.

44,47 - 49 pour maintenir la pluripotence. Alors que d'autres formats de cellules pluripotentes de rendement de la culture de cellules souches évolutive 20,23,29 méthode basée sur cette plaque nécessite pratiquement pas de changement de format de la culture, comme l'adaptation à la suspension, l'utilisation de produits chimiques anti-mousse ou l'utilisation prolongée de la Rho-kinase inhibiteur 20. Cette méthode de la plaque base peut donc rapidement, et de façon prévisible, accueillir de nouvelles lignes parce que les conditions de culture sont similaires. Comme l'utilisation des CSPi pour la modélisation de la maladie augmente 4,6,19,50, de nouvelles lignes iPSC sont générées en continu. Les techniques décrites ici sont les mieux adaptés à la culture nouvelle lignes dans un milieu à haut volume et le débit parce que la barrière à la transition sur le format est low. Cela est également vrai pour le travail et l'équipement nécessaire pour maintenir les colonies. Enfin, parce que le format et la manipulation sont similaires à l'environnement utilisé pour calculer et valider les lignes iPSC, le rendement de la culture, tels que la différenciation dirigée, est susceptible d'être plus prévisible.

La figure 8 illustre une stratégie de mise à l'échelle de la production de cellules souches dans des plaques à 96 puits. Une plaque (Cycle 0) est utilisée pour ensemencer robotisée 12 nouvelles plaques, une augmentation de 12 fois (cycle 0 à 1). Après plusieurs jours d'alimentation, l'un des douze plaques est à des passages pour ensemencer une autre série de douze plaques (cycle 1 au cycle 2). Les plaques onze autres sont maintenant disponibles pour d'autres usages et représentent la composante de la production du système. À ce rythme, le passage d'une plaque fournira 11 plaques chaque cycle, ou tous les 3-4 jours. Cette méthodologie peut être mise à l'échelle plus lorsque plusieurs plaques sont soumises à des passages comme représenté sur la transition de cycle 2 au cycle 3. Au cycle 3, deux plaques sonttoujours utilisé pour maintenir la colonie et des graines 24 de nouvelles plaques. Les 22 plaques restantes sont alors disponibles pour une utilisation après chaque cycle de passage. À tout moment dans le cycle de maintenance, l'utilisateur peut semer plusieurs plaques pour augmenter la production. Un exemple consisterait à chaque passage sur la colonne pour deux cycles de croissance. Le premier passage convertit une plaque en douze plaques, et chacun des douze plaques est utilisée pour ensemencer 144 plaques. Dans ce cas, un utilisateur commence par une plaque et après deux passages, ou environ 1,5-2 semaines de culture, compte 144 plaques. Par exemple, les fibroblastes et adipeux lignes iPSC rendement d'environ 25 à 75.000.000 cellules par plaque de 96 puits lorsqu'il est prêt au passage. 144 plaques pourraient donc représenter environ 4-7 x 10 9 cellules.

Quelle est la charge de travail pour la réalisation de 144 plaques à 96 puits robotisée? L'un des objectifs de ce travail était évolutive production de cellules souches qui a réduit la main-d'œuvre par rapport à (plaque-à-dire, 6 puits) traditionnelle culture de cellules souches. L'acc robotomplishes ce en allégeant la nécessité de manipuler physiquement chaque plaque lors de l'alimentation et de passages. Bien que les échelles de production de plaques à 96 puits comme il serait linéairement dans des plaques à 6 puits traditionnels, le temps de travail d'un technicien passe avec les plaques est sensiblement inférieure à l'aide de la culture robotique. L'efficacité de la culture de production robotisé est dérivée de cette différence (Figure 9). Il a été constaté techniciens pourraient retirer une plaque de 6 puits de l'incubateur, vérifier sur le microscope, puis aspirer et nourrir la plaque dans environ 3,5 minutes. En comparaison, les techniciens passent environ 30 sec enlever une plaque de 96 puits de l'incubateur et l'inspection sur le microscope de la densité et de la contamination avant de le placer sur le robot. Avec un protocole élargi d'alimentation similaire à celle décrite ci-dessus, six plaques à 96 puits peuvent être chargés et alimentés, ce qui prend environ 21 minutes, ou 3,5 minutes par plaque. Le temps total écoulé pour nourrir une plaque est comparable entre les robotsic et des méthodes manuelles, mais à alimentation manuelle 6 assiettes un technicien est nécessaire pour toutes les 21 min alors que le technicien ne consacre que 3 manipulation des six plaques pour le robot (une inspection de 30 secondes par assiette) min. Comme la figure 9 montre, le temps d'un technicien passe manipulation 144 plaques à l'aide du robot est d'environ 1,2 heures par opposition à 8 h à la main et le robot ne pourra jamais faire une erreur de manipulation des plaques ou le transfert de liquides.

Les 96 puits iPSC méthodes de culture décrites ici fournissent une plate-forme traitable pour les tâches de contrôle complexes. Parce que chaque puits est génétiquement identique et ensemencé à la même densité dans le même bassin initial, les variables peuvent être distribués à travers la plaque et entretenus par le robot avec des réservoirs disponibles dans le commerce pour séparer les conditions. Cela serait utile pour des expériences telles que la croissance sur les cellules souches de support 34,35,47 développement, le test de substrat ou de l'état de la culture et des études de toxicité en utilisant des cellules souches51. Étant donné que chaque ligne de cellules souches est unique en termes d'exigences optimales de taille de la colonie et de passage, on peut utiliser ce système pour moduler la densité ensemencement, la fréquence d'alimentation et la manipulation de passage en manipulant les colonnes récoltés, l'agitation mécanique pendant le passage et la fréquence d'alimentation. En parcourant ces variables permettra à l'utilisateur de trouver rapidement un ensemble de conditions appropriées pour la culture d'une nouvelle ligne ou de développer de nouvelles techniques de culture. Le robot est aussi capable de maintenir 96 colonies de cellules souches parallèles mais indépendants. Lorsque iPSC sont dérivées de cellules somatiques ou clone après manipulation génétique, de nombreux clones sont criblés en parallèle pour donner des lignes iPSC potentiels. Une fois que des cellules individuelles sont ensemencées dans des plaques à 96 puits, ce système peut se nourrir et de passage des plaques à 96 puits en gardant chaque colonie distincts. Cela permet un débit très élevé lors de la sélection des clones potentiels et élimine la difficulté de la culture physique 96 lignes parallèles. Cette méthode aussi unP ermet à plus grande échelle la production de chaque clone sorte que le matériau est facilement disponible pour une analyse parallèle. Enfin, nous envisageons l'intégration de ces techniques de culture avec un système de traite robotisé de la plaque qui délivre plaques et de l'incubateur permettant la culture entièrement automatisé. Cela pourrait être accompli avec la robotique plus complexes qui permettent une plus grande expansion depuis les protocoles de base décrites ici sont transférables à d'autres systèmes basés sur des plaques.

Les premières étapes essentielles à aborder dans les protocoles sont ceux qui préviennent et vérifier la contamination telle que les étapes 1,5 et 4,2. Contamination, comme discuté ci-dessus, peut être évitée avec succès si bonne technique stérile et le bon sens sont utilisés. Il est impératif, indépendamment du format de la culture de cellules souches, que le contrôle de l'opérateur de la contamination et de le faire dans ce protocole dans les étapes indiquées permettra de réduire considérablement le risque de contamination. L'application du gel de la matrice extracellulaire adéquate est une seconde essétape tielle à la réussite globale de ce protocole. Sans bien enrober les plaques à 96 puits, les cellules souches ne se développent pas. Un problème commun est le revêtement de puits incomplètes. L'expérience a montré que les bulles d'air, l'attraction électrostatique et capillarité entravent revêtement de complet bien. L'étape de pré-mouillage (1.6) a été développé pour améliorer de manière significative revêtement de fond de puits et ne doit pas être ignorée. Cette étape de pré-mouillage semble réduire l'hydrophobie apparente de la plaque de 96 puits en plastique de telle sorte que lorsque le revêtement de gel de la matrice extracellulaire est appliqué, il est réparti uniformément à travers le fond du puits et sur les côtés. Il est également recommandé de taper doucement les plaques à 96 puits contre une main propre une fois revêtu pour assurer la distribution de solution de gel de la matrice extracellulaire même. Les paramètres de dissociation sont également importantes pour optimiser. Incubation prolongée avec une enzyme ou un réactif de dissociation de l'EDTA sur la base se traduira par des cellules individuelles qui peuvent ou peuvent ne pas être l'objectif au cours du passage. Par conséquent, l'opérateurdevraient accorder une attention particulière à la façon dont le temps de dissociation, la force de trituration, et les répétitions de lavage affectent la morphologie des colonies et de la santé et d'ajuster en conséquence.

Comprendre les limites des techniques décrites ici sont primordiale pour le bon fonctionnement. Comme dans n'importe quel autre paramètre de culture cellulaire, l'utilisation de plaques à 96 puits présente un risque de contamination relativement élevé. Comme décrit ci-dessus, un technicien est le traitement de chaque plaque lors de l'alimentation et des passages; par exemple, lors de l'ouverture du couvercle, en mettant la plaque sur le lit de robot, et la vérification de la plaque sur le microscope. Par conséquent, comme l'a noté après l'étape 1.5, il est impératif de ne pas toucher l'intérieur d'un couvercle de plaque ou exposer cette partie à toute surface potentiellement contaminés tels que les blocs de chauffage en pente ou des broches verticales sur le lit. Au cours de l'élaboration du protocole de cette limitation a été découvert et a donné l'impulsion pour développer un rack de tenir les couvercles de la plaque pour maintenir la stérilité. De même, les réservoirs de dépression, embouts de pipette et outres fournitures sur le liquide lit robot de manutention sont des sources potentielles de contamination, car ils sont ouverts à l'environnement et géré par le technicien. Par conséquent, une bonne technique stérile doit être appliquée comme la réduction des mouvements sur les matières de culture exposées ou liquides ouverts. Une autre limitation est que lorsque le protocole est entartré, vérifier visuellement tous les puits de> 100 plaques à 96 puits est lourd. Cela peut être traitée par une inspection visuelle de l'ensemble de la plaque des signes de contamination, tels que les médias trouble, pour identifier les puits suspectes. Pour l'avenir jusqu'à l'échelle, l'utilisation d'un microscope automatisé et l'indicateur de la croissance cellulaire et la contamination potentielle sera incorporé.

En résumé, le 96 puits plate-forme haut débit décrit ici propose une méthode reproductible, haute fidélité pour la culture et la production de cellules souches dans un format de plaque. Cette méthode réduit l'expérience requise, l'équipement et la main-d'œuvre temps nécessaire dédiée à la culture de cellules souches touten conservant les avantages de la culture traditionnelle adhérente.

Disclosures

Les auteurs MKC, MJG, BEE, NJD et RO sont ou étaient à l'époque des employés de développement de InvivoSciences, INC qui a conçu et développé des protocoles robotiques décrites ici. TW est le SSP pour InvivoSciences INC. SH est un employé de Gilson INC.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH, R44 et R01 GM087784 HL109505. Auteurs remercient l'équipe technique et OEM à Gilson, INC pour le support technique étendu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
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Developmental Biology Numéro 99 iPSC à haut débit de manipulation des liquides robotique évolutive les cellules souches la culture de cellules souches automatisé 96 puits
Scalable plaque de 96 puits Basé iPSC Culture et production en utilisant un système robotique Liquid Handling
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Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, … More

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

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