Introduction
伝統的なワクチンの開発は、主に試行錯誤の経験的なアプローチを採用しています。しかし、生体材料および免疫活性化の分子決定の発見の広い配列の最近の開発と、それが合理的に病原体1,2に由来し、生物物理学的および生化学的な手がかりでワクチン製剤を設計することが可能になりました。具体的には、様々な粒子状薬物送達プラットフォームはリンパに存在する分解からワクチン成分を保護し、抗原提示細胞への抗原提示細胞（APC）を、それらの同時送達を増強、それらは、サブユニット抗原および免疫刺激剤と共ロードされるように、ワクチン担体として検討されていますノード（LNS）は、このように免疫刺激と活性化3-5を最大化します。以前に強力なワクチンplatforとして実証されている。この報告書では、我々は、「病原体模倣」ナノ粒子系の合成を記載呼ばれるinterbilayer架橋多層小胞（ICMVs）、強固な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）および全身および粘膜組織区画6-9両方における体液性免疫応答の誘発のために、M。特に、ICMVsでのワクチン接種は、従来のアジュバントを用いたワクチン接種（ 例えば、ミョウバンとモンタニド）7と比較して、マラリア抗原に対して実質的に強化された血清IgGレベルを達成し、また、マウス9中の腫瘍細胞とウイルス攻撃モデルに対して強力なCTL応答を誘発しました。ここでは、モデルのワクチンナノ粒子系としてICMVsを使用して、我々は凍結切片組織7の共焦点イメージングを利用するのLNを排出する粒子径とゼータ電位測定と粒子輸送の追跡（dLNs）を含むワクチンナノ製剤の特徴付けのための方法を記載しています。また、我々は、ルシフェラーゼ発現抗原特異的CD8 + T細胞9,10の養子移入後のマウスにおけるCTL応答の展開を分析する全動物イメージングベースの方法を提示します。最後に、デナノ粒子6,9をワクチン接種したマウスにおける内因性のT細胞応答の長手方向の定量化のための末梢血単核細胞（PBMC）のスクライブテトラマー染色。
ICMVsその後、化学的にジチオール架橋剤6と脂質層内の架橋マレイミド官能化リン脂質頭部基によって安定化されている多層構造の中に簡単なリポソームの制御融合することにより合成脂質ベースのナノ粒子製剤です。 ICMVsが合成されると、ナノ粒子の小部分は、粒子サイズとゼータ電位動的光散乱（DLS）システムとゼータ電位アナライザーでの（ すなわち 、粒子の表面電荷）を決定するために使用することができます。 DLSは、拡散係数および粒子11の流体力学的サイズの決定を可能にする、粒子懸濁液の光散乱の変化を測定します。バッチからバッチ合成に一貫性の粒子サイズを達成することは非常に重要です以来、粒子サイズはdLNsおよびAPC 12,13によるその後の細胞取り込みにワクチン粒子のリンパ排水に影響を与える主な要因の一つです。また、ゼータ電位は、粒子と粒子表面電荷11の電気泳動移動度を決定することができる電流が印加された粒子の速度を測定することによって得ることができます。粒子の表面電荷は、貯蔵中およびin vivo投与後の14,15粒子分散液に直接影響するコロイド安定性を決定するため、粒子の一貫したゼータ電位値を確保することが重要です。 dLNsに粒子の局在化を追跡するために、ICMVsは、親油性染料と共有結合的にタグ化抗原を含む、所望のフルオロフォアで標識することができます。免疫化の後、マウスは、種々の時点で切除dLNsを安楽死させ凍結切片、および共焦点顕微鏡を用いて分析することができます。この技術は、リンパのDraIの可視化を可能にdLNsへのナノ粒子ワクチン担体および抗原の両方の寧。組織切片は、さらに、蛍光標識抗体で染色し、そのような我々は以前に7を示しているように胚中心の抗原および形成に関連する細胞の種類として、より多くの情報を得るために利用することができます。
粒子合成が最適化され、dLNsへトラフィッキングが確認されると、それは、 インビボ CTL拡張の誘発を検証することが重要です。ナノ粒子ワクチン接種に応答して、抗原特異的CD8 + T細胞の誘発を分析するために、我々は、詳細な免疫学的な分析を可能にOVA 257-264ペプチド（SIINFEKL）免疫優性CD8 + T細胞エピトープと、モデル抗原、オボアルブミン（OVA）を利用しています初期ワクチン開発16,17のための抗原特異的T細胞応答の。具体的には、抗原特異的CD8 + T細胞の増殖および移動の動態を調べるために、我々が生成しました（H-2K bの関連で）SIINFEKLに特異的なT細胞受容体（TCR）とCD8 + T細胞を有するOT-Iトランスジェニックマウスを用いて、ホタルルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウス（リュック）を交配することによって、二重トランスジェニックマウスモデル。これらのOT-I / Lucのマウスから、ルシフェラーゼを発現する、OT-I CD8 + T細胞を単離し、ナイーブC57BL / 6マウスへの養子移入のために調製することができます。播種後、OVA含有ナノ粒子で成功免疫は、動物全体のイメージングシステム9,10で生物発光シグナルを監視することによって追跡することができる転送T細胞の拡大をもたらします。この非侵襲的な全身イメージング技術は、長手方向の様式で末梢組織へのT細胞のリンパ組織の拡大と普及に関与するプロセスを明らかに、過去18〜20の他のウイルスまたは腫瘍抗原で使用されてきました。
養子移入の抗原特異的CD8 + T細胞の分析に相補的なendogeno米国T細胞応答が使用される、ワクチン接種は、4つのフルオロフォアタグ化MHCクラスI分子からなるペプチド-MHC四量体複合体は、ペプチドエピトープを負荷したペプチド-主要組織適合遺伝子複合体（MHC）四量体アッセイ21を用いて検査することができるポスト抗原特異的にTCRとラベルCD8 + T細胞に結合します。ペプチド-MHC四量体アッセイは、リンパ系および末梢組織中の抗原特異的CD8 + T細胞を同定するための端子剖検研究にまたは連続採血から得られた末梢血単核細胞（PBMC）と縦断的研究のいずれかで行うことができます。ペプチドMHC四量体でリンパ球を染色した後、フローサイトメトリー分析CTLの表現型またはCD8 + T細胞のうち、その頻度の定量に詳細な分析を行います。
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Protocol
このプロトコルで説明されているすべての実験は、ミシガン大学で動物の使用およびケアに関する大学委員会（UCUCA）によって承認され、確立されたポリシーとガイドラインに従って行いました。
ICMVsの1の合成とキャラクタリゼーションタンパク質抗原およびアジュバント分子との共同ロード
- - [4-（p個の -maleimidophenyl）ブチルアミド] 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DOPC）および1,2- dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- Nのモル比1：1を混ぜますのクロロホルム（MPB）、バッチ当たり1.26マイクロモルで合計脂質量を維持する（ すなわち、DOPC500μgのとMPBの630μgの）20mlのガラスバイアル（直径= 28ミリメートル、高さ= 61ミリメートル）で。
- 所望の濃度の脂質溶液に、モノホスホリルリピドA（MPLA）のような親油性薬物、または親油性染料（ 例えば、DID）を追加します。徹底的に余分な乾燥nitrogeでパージすることによって有機溶媒を除去Nガス及び真空O / Nの下でサンプルを置きます。
- 水溶性薬剤（ 例えば、タンパク質抗原）を含有する10mMのビス-トリスプロパン（BTP、pH7.0）中の200μLを加えることによって脂質膜を水和。 10秒室温で1時間ごとに10分間ボルテックス。
- 1.5 mlのマイクロチューブにガラスバイアルから内容を転送氷水浴中で場所のサンプル、および125 W / 20 kHzのプローブ先端の超音波処理器に設定40％の強度を用いて5分間連続して超音波処理します。
- 各バッチ（使用濃度2.4 mM）の、渦、および卓上マイクロ遠心を使用して簡単に遠心に150mMのジチオスレイトール（DTT）の4μlを添加します。
- 200 mMのCaCl 2を40μlを添加して、ピペット（使用濃度33 mM）のと混合。 DTTでの脂質層をMPB含有の架橋を可能にするために1時間37℃でサンプルをインキュベートします。
- 遠心分離機15分間20,000×gでのサンプル、上清を除去し、ddiH 2 Oの200μl中に再懸濁
- 上清からのCaCl 2、未反応のDTT、およびカプセル化されていない貨物の物質を除去するための第2のddiH 2 O洗浄後の手順を繰り返し、再び1.7遠心操作します。
- ddiH 2 Oで2 kDaのポリエチレングリコールチオール（PEG-SH）の10 mg / mlでの準備PEG-SH溶液100μlで各ICMVサンプルを再懸濁し、30分間37℃でインキュベートします。
- 2 ddiH 2 O回の洗浄（ステップ1.7）を実行し、4℃での最終的なICMVのPBSでペレットと店を懸濁します。粒子は、長期保存後に底に沈殿することができるように、使用ICMV懸濁液を混合する前に。
- 粒子の特徴付けのために、各バッチからICMVs少量の（〜10％）を除去し、ddiH 2 Oの1ミリリットルの全容量で個別に希釈DLSと（製造業者のプロトコルに従って）ゼータ電位測定システムを使用して試料のゼータサイザーセルと測定粒子径、多分散性指数、およびゼータ電位に単一のサンプルを置きます。
共焦点顕微鏡で蛍光タグ付きICMVsのリンパ節排出する2.検討
- フルオロフォアタグ付き抗原と親油性蛍光色素を負荷しICMVsの調製
- オボアルブミンなどのフルオロフォア標識タンパク質を、準備製造元の指示に従って、アレクサフルオロ555 - スクシンイミジルエステルと反応させました。
- 脂質シェルでフォアでタグ付けICMVsを製造するために、親油性蛍光色素（ 例えば、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'- Tetramethylindodicarbocyanine、（）DID）（脂質フィルムの製造中にステップを追加します1.2）0.05％モル脂質量で。脂質フィルムの水和（ステップ1.3）、フルオロフォアタグ付き抗原を含む使用バッファ、および完全なICMV合成の工程1.4から1.11に概説されるように。
- 尾の基部のナノ粒子の皮下投与
- 導入室Uを搭載した制御フロー気化器を用いてマウスを麻酔IACUCに応じて3％イソフルランと酸素流量の1.5 L /分をtilizingは、動物プロトコルを承認しました。マウスは無意識になると、注射部位への最適なアクセスを可能にし、動物に不快感を最小限に抑えるため、身に着けている麻酔に素早く前に次の手順を実行します。あるいは、麻酔を維持するために、適切なフィットノーズコーンを使用。マウスを、より長い5分間麻酔した場合は、手順後の刺激を最小限にするために必要な眼の潤滑を適用します。
- サニタイズと皮膚の下に針を視覚化するために使用することができます目に見える皮膚の小さなパッチを公開するために毛皮のパートに濡れた髪を濡らす70％エタノールで尾の付け根をスプレーします。
- PBSでワクチン接種量100μlのあたり抗原およびアジュバントの所望の量を含む粒子注入懸濁液（ 例えば、10μgのOVAと注入量100μlのあたり0.3μgのMPLAが過去6,9で使用されている）を準備します。
- 粒子懸濁int型を描きます27-29 G針を有するOA注射器と上向きにベベルと尾（生え際から〜5ミリメートル）の基部に針を挿入し、粒子懸濁液22の50μLを注入します。
- 過度の逆流を防止し、針を引き出すために均等に圧力を数秒待ちます。両方の排水鼠径LNををターゲットにするテールベースの反対側に注射を繰り返します。
- リンパ節の凍結切片を、共焦点顕微鏡での検査の準備。
- 動物プロトコルを承認しIACUCに応じて誘導され気胸に続くCO 2窒息でマウスを安楽死させます。 Bedoya 23で実証プロトコルに従って鼠径のLNを抽出し、4℃で1mlのPBSに組織を配置することによって、血液を洗い流します。
- 組織と組織からPBSを吸収し、組織cryomoldsで組織を置く（10×10×5ミリメートル3）10月は、媒体24を凍結してトップに予め充填されました。スナップTISを凍結します30秒間液体窒素中でブロックを訴えます。代わりに、30分間ドライアイス上で組織ブロックを配置します。 ℃の冷凍庫で-80凍結組織を保管してください。
- -20℃24に設定したクライオスタットに5〜10ミクロンの厚さの組織切片をカットします。
- 必要に応じて、免疫蛍光標識を行い、以前に示さ24と共焦点顕微鏡を用いて組織を調べます。
動物全体のイメージングとナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的、ルシフェラーゼを発現するCD8 + T細胞の3モニタリング拡張
- OT-I / LucをトランスジェニックマウスからのOVA特異的257-264、ルシフェラーゼを発現するCD8 + T細胞の単離
- CO 2窒息とOT-I /リュックトランスジェニックマウスを安楽死させると、動物のプロトコルを承認しIACUCに応じて気胸を誘発します。腹腔にアクセスし、慎重に膵臓23から組織を取り外して滅菌方法で脾臓を収穫し、組織培養フードに転送するために4℃でPBS + 2％FBS 5ml中の場所。
- （一度に3脾臓まで）50mlコニカル遠心分離管の上に70ミクロンのナイロンストレーナの脾臓を置きます。 3ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、ストレーナを介して細胞を粉砕。
- PBS + 2％FBSでプランジャとストレーナーを洗浄し、廃棄します。 300×gで10分間、10ミリリットル/ 50 mlチューブで脾臓に全量を血球計数器で計数するために、細胞懸濁液の少量のサンプルを取り、遠心。
- 市販の磁気陰性選択キットを用い、製造者の指示に従って、CD8 + T細胞集団を単離します。
- PBSで細胞を洗浄した後、単離されたCD8 + T細胞の数を数えます。単離されたCD8 + T細胞の純度を評価するために、次にαCD8-APC抗体の20μlを添加、10分間マウスCD16 / 32抗体（0.025 mg / mlの）20μlに〜20,000〜30,000細胞をインキュベート（0.005 mg / mlの）そして30分間インキュベートします。ペーBSA w / vのrform PBS中4℃でのインキュベーションは全て+ 1％。フローサイトメトリー分析25を行います。
- 養子単離されたCD8 + T細胞の移動およびその拡張ワクチン接種後の可視化
- 静脈尾静脈注射22（日-1）を介して、200μlのPBS体積で1-10×10 5個の細胞を投与することによって、ナイーブC57BL / 6マウスに、単離されたOT-I /リュックCD8 + T細胞の養子移入を行います。マウスは剃毛アルビノC57BL / 6、C57BL / 6マウスにおいて、毛皮、黒皮パッチは、生物発光信号を妨害する可能性があることを考慮すると、これらの研究に最適です。
- 以前（2.2節）に記載のように1日（0日）後、ワクチンを投与します。
- 300μlのPBSの容量で腹腔内キロマウス体重あたりルシフェリン150mgのを管理します。 10分後、（ステップ2.2.1のように）をイソフルランでマウスを麻酔し、5〜10分間Wの生物発光シグナルを取得することによりOT-I / LucのCD8 + T細胞を可視化動物全体のイメージングシステムi番目（IVIS;詳細な指示のためにウィルソン26を参照）。長期的な研究のために必要に応じて繰り返します。
抗原特異的CD8 + T細胞の分析のためのPBMCの4ペプチドMHCテトラマー染色
注：以下のプロトコル手順は、養子養子移入することなく、OT-I / LucのCD8 + T細胞またはC57BL / 6マウスで転送C57BL / 6マウスのいずれかを用いて行うことができます。
- ワクチン接種後の所望の時点で、K 2 EDTAでコーティングされたチューブに顎下出血法27を介してマウスからの血液の約100μLの（4-6滴）を採取し、凝固を防止するために数回転倒。
- 、マイクロ遠心チューブに血液の100μLを移すの溶解緩衝液1mlを添加し、赤血球（RBC）を除去するために、2〜3分間インキュベートします。 1,500×gで5分間遠心分離サンプル、上清を除去します。ペレットがまだの場合（RBCの不完全な除去を示す）赤ppearsは、溶解バッファーの短時間のインキュベーション（<1分）で溶解工程を繰り返します。
- 5分間1,500×gで1（/ BSA V W PBS + 1％）のFACS緩衝液mlの遠心分離で、残りのPBMCを洗ってください。
- 吸引し上清と非特異的結合とのFcR媒介性の抗体をブロックするために、マウスCD16 / 32抗体（0.025 mg / mlの）の20μlのサンプルを再懸濁します。 RTで10分間インキュベートします。
- 4ミリリットル丸底FACSチューブに微小遠心管から細胞を転送します。各サンプルに、製造業者の仕様書に従って、OVA四量-SIINFEKL-PEの溶液 B、H-2Kの20μlを添加して、氷上で30分間インキュベートします。
- 抗体カクテルを準備する（ 例えば、αCD8-APC、αCD44-FITC、およびαCD62L-PECy7抗体（それぞれ0.005、0.005、0.002 mg / mlの濃度、））。各実験サンプルに20μl加え、氷上で20分間インキュベートします。ラにより、単一の蛍光体のコントロールを準備します上に示した濃度の各蛍光団タグ付き四量体または抗体で細胞をbeling。
- FACS緩衝液で2回洗浄し、DAPIを2μg/ mlを含有するFACS緩衝液中に最終ペレットを再懸濁します。細胞は現在、フローサイトメトリー分析（詳細と例はScheffold 25に記載されています）の準備ができています。
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Representative Results
ICMVsの合成に関与するステップは、図1~6に示されている。簡単に言えば、任意の親油性薬剤または蛍光色素を含む脂質膜は、親水性薬物の存在下で水和します。例えばCa 2+などの二価カチオンは、多重膜小胞にアニオン性のリポソームの融合を駆動するために添加されます。例えば、DTTなどのチオール架橋剤は、脂質層を並置の「ステープル」マレイミド官能化脂質に添加し、最終的に残りの外部マレイミド基は、チオール化、PEG部分との反応で急冷されます。各バッチの小部分は、容易にDLSとゼータ電位分析システムを用いて粒子サイズ、多分散性指数、およびゼータ電位を測定することにより、品質管理測定に供することができます。得られた粒子は、OVA封入pの平均130±20nmのサイズ、0.22±0.02の多分散性指数、および-54±3 mVのゼータ電位を有する比較的均質です記事（ 図1Bおよび1C）。粒子の乾燥重量で測定された粒子の典型的な収率は、50％〜6です。
上記のプロトコルを使用して、ICMVsはフルオロフォア標識タンパク質の抗原および蛍光親油性色素で同時ロードすることができ、 生体内で抗原とナノ粒子の配信の可視化を可能にします。 ICMVsに対可溶性形態で抗原送達のパターンを比較するために、C57BL / 6マウスは、いずれの水溶性または標識されたDID ICMV製剤でAlexaFluor555タグ付きOVA100μgを尾の基部に皮下投与し、鼠径部のLNを排出する様々なで切除しましたDLN組織凍結切片の調製のための時間を指します。共焦点顕微鏡による可視化は、可溶性抗原を迅速に4時間以内dLNsに達したが、24時間（ 図2）7と非常に迅速に除去されたことを示しました。これとは対照的に、OVA-ロードICMVsは継続蓄積と、24時間によってdLNsの周辺で検出されましたdLNs中のOVA-ICMVsを大量に堆積し、4日目に調べたように（ 図2）。共焦点顕微鏡写真もAlexaFluor555タグ付きOVAの共局在を示し、ICMVsがICMVs 7内に封入されたタンパク質抗原および他の免疫賦活剤の安定した同時配信を可能にすることを示唆し、dLNs内ICMVsを標識しました。
OT-I / LucをトランスジェニックマウスからのCD8 + T細胞の単離を容易にマウス脾臓当たり〜8〜12×10 6個の細胞を得、市販の磁気陰性選択キットを用いて行うことができる。 図3は、養子で転送C57BL / 6マウスを示します×10 5 - 1日目の5 OT-I /リュックCD8 + T細胞は、いずれかのOVA10μgのMPLAと0.3μgのの皮下投与と水溶性又はICMV製剤で0日目に免疫しました。 IVISと生物発光イメージングは、最小限のOT-I /リュック信号を示したワクチン接種前に0日目に行きました。しかし、後4日目のワクチン接種により、マウスを免疫OVA / MPLA-ICMVs尾ベース領域28を排出LNをある鼠径LNを、内部に強固な生物発光信号を持っていました。対照的に、ワクチンの可溶性形態で免疫したマウスは、鼠径dLNs内OT-I / LucのCD8 + T細胞の非常に拡大縮小を示しました。
モデル抗原としてOVAを使用すると、免疫優性OVA 257-264ペプチド（SIINFEKL）に特異的な内因性のCD8 + T細胞の増殖のモニタリングを可能にします。例えば、C57BL / 6マウスを、0日目、21で免疫し、そして皮下10μgのOVAの投与およびICMVsまたは可溶性形態のいずれかで0.3μgのMPLA 35、およびPBMCにおけるCD8 + T細胞のうち、SIINFEKL特異的CD8 + T細胞の頻度SIINFEKL-H-2K b のテトラマー -PEで染色したPBMCのフローサイトメトリー分析によって決定した。 図4（a）は、41日目6にPBMCにおけるCD8 + T細胞のう ち、SIINFEKL-H-2K b のテトラマー+細胞の散布図サイトメトリーの代表的な流れを示している。FIGURE 4Bは、SIINFEKL四量体+ CD8 + T細胞のう ち、中央のメモリー表現型を有するCD62L + CD44 +細胞の代表的な散布図を示しています。 ICMVワクチン接種は、CD8のピーク28％SIINFEKLテトラマー+ T細胞を達成する、有意に強いCD8 + T細胞応答を誘発したのに対し、 図4Cに示されたPBMCの毎週モニタリングは、可溶性OVAのワクチンは、抗原特異的CD8 + T細胞の最小限の拡張を誘発することが示さ+日中はT細胞集団は、41 6。ここで紹介する四量体染色プロトコルを使用して、我々は、未処理またはPBSで処置した動物では（N = 15）0.04％のOVA特異的T細胞±0.11％のバックグラウンド頻度を観察し、我々は検出することができます0.05％±0.46パーセントと低い抗原特異的CD8 + T細胞の頻度の統計的に有意な増加（p値<0.005、データは示さず）。
抗原の図2.分析共焦点顕微鏡を用いてリンパ節に排出する。C57BL / 6マウスを、100μgの蛍光団共役OVA（赤で表示）および5μgのMPLA溶液中またはICMVs（青で表示）のいずれかで免疫しました。流入領域鼠径リンパ節は、指示された時点で凍結切片を切り出し、そして共焦点顕微鏡で画像化しました。代表的な共焦点顕微鏡写真が示されています。ピンクの信号は、OVAとICMVsの共局在を示しています。この図は、ムーンら 7から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 
図3. Monitorinワクチン接種後のG T細胞増殖。C57BL / 6アルビノマウス養子1日目に、5×10 5のLuc + OT-I CD8 + T細胞を静脈内に移しました。 0日目に、動物を10μgのOVAおよび0.1μgのMPLAのいずれかのような水溶性またはICMV製剤を投与しました。動物をイソフルランで麻酔し、（150mgの/ kgを、300μlの腹腔内注射）IVISで取得したリュック+ OT-1 CD8 + T細胞からの、および生物発光信号ルシフェリンを投与した。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。 
ICMVワクチン接種後の内因性OVA特異的CD8 + T細胞の図4.拡大。C57BL / 6マウスは、いずれかのOVA10μgのMPLAと0.1μgの免疫した私n個の溶液またはICMVs 0日、21日、および35（矢印）。末梢血単核細胞のう ち、OVA特異的T細胞の頻度を、SIINFEKL-MHC-I四量体+ CD8 + T細胞のフローサイトメトリー分析によって経時的に評価しました。 （A）41日目示すSIINFEKL-MHC-I四量体+ CD8 + T細胞および（B）CD62L + CD44 +細胞を、セントラルメモリーT細胞のマーカーで個々のマウスからの散乱プロットの代表的なフローサイトメトリー。 （C）T細胞の膨張および収縮の全体的な動態を示します。この図は、ムーンら 6から変更されている。 図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
この資料に記載されているプロトコルは、新たな脂質ベースのナノ粒子系の合成および特徴付けを記載ICMVsと呼ばれる、抗原特異的CD8 + T細胞応答を誘導するために、ナノ粒子ベースのワクチン製剤の有効性を検証する方法を提供します。 ICMV合成は、典型的には、多くの場合の損失をもたらす、製造のための有機溶媒を必要とする他の一般的に使用されるポリマーナノ粒子システム（ 例えば 、ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）酸 粒子）に比べて大きな利点である、すべての水の状態で終了しますタンパク質抗原29,30における抗原性。また、大規模な安定性と能力からICMVsの利点は、このようなAPC 31,32内の同じ細胞内区画を標的とする抗原およびアジュバントの同時送達を可能にする、疎水性および親水性の両方の分子6をカプセル化します。モデルワクチンナノ粒子としてICMVsを使用して、ここでは、手順を概説しています（3）非侵襲的生物発光イメージング技術および（4）ペプチドMHCを用いて、（1）ナノ粒子の合成とキャラクタリゼーション、dLNsにナノ粒子排水の（2）の検証、および抗原特異的CD8 + T細胞応答の誘発を検査するためのPBMCを上の四量体染色アッセイ。
それらは非常にin vivo投与の際にAPCによるリンパ排出および取り込みに影響を与えることができるように、それは、特に、粒子サイズ及び表面電荷のために、バッチからバッチへのナノ粒子合成の均一性を確保することが重要です。 DLSとゼータ電位分析は、粒子サイズおよび表面電荷に品質検査の迅速な方法を提供します。個々の粒子の形態の詳細な分析のために、これらの技術は、ガラス化し、水層6,33,34の「ソフト」粒子の形態を保持する低温電子顕微鏡（クライオEM）のような高分解能電子顕微鏡を用いて補完することができます。抗原とadjuvのカプセル化効率アリも決定し、合成の間に均一に保たれている必要があります。タンパク質抗原はabsorbance-と蛍光ベースのタンパク質定量キットを用いて定量化、またはSDS-PAGE 35及びクーマシーまたは銀染色36を利用して分析し、バンドの強度に基づいて定量することができる一方で、そのようなMPLAのようなアジュバントは、フルオロフォア6でタグ付けすることができ。最適な反応性は完全な合成のために必要であるとして、粒子製剤の不整合は、有効期限が切れたか、不十分に記憶された試薬から生じ得ます。この目的のために、マレイミドおよびチオール官能試薬は、頻繁に凍結融解サイクルなしで-80℃で少量ずつ維持されるべきです。
より大きな粒子（500〜2000 nm）は、組織常駐のDC 12,37により能動輸送を必要とするのに対し、100ナノメートル未満の粒子は、一般的に、効果的にdLNs 13にリンパ管、トラフィックを入力すると考えられています。私たちの手では、150から2の範囲の流体力学的サイズでICMVs50を効率的に局在化し、大規模なCTLおよび体液性応答6,7で、その結果、DLNに永続nm程度。投与の24時間以内に、ICMVs dLNsで被膜下洞マクロファージに関連していたし、フローサイトメトリーは、1日目と4の分析を行ったがdLNs内で最もICMVsがランゲルハンスに関連付けられた粒子の小部分のみでLN-常駐APCによって取り込まれたことを示しましたおよび皮膚のDC 7。これらの結果は、受動輸送がdLNsにICMV輸送の主要なモードであることを示しました。これらの研究は、dLNsにそれらの局在と分布パターンを描くために、フルオロフォアタグ化ナノ粒子とタンパク質抗原を利用してきました。凍結切片dLNsの共焦点顕微鏡は、LN構造の同定のための追加的な免疫組織化学を可能にする（ 例えば 、GL-7胚中心での発現）と配合成分（ 例えば 、樹状細胞と相互作用する細胞-のCD11c、マクロファージ- F4 / 80、CD169、およびB-細胞＆＃8211; B220）7,9。この技術は、細胞の分析は、粒子の取り込み7,9を担当APCのサブセットを描写するdLNsから回収し、フローサイトメトリーと並列に実行することができます または全動物イメージングと蛍光シグナルが強く、組織の自己蛍光が信号と干渉しないことを条件とする、dLNs 38,39に注射部位からワクチン送達を定量します。
効果的な免疫は、ワクチン接種に続いて、抗原特異的なトランスジェニックT細胞の生物発光の養子移入後の全身の生物発光イメージングによって追跡することができる抗原特異的細胞傷害性T細胞の強固な活性化および拡張が必要となります。この方法のさらなる利点は、このような免疫学的分析のために必要な動物の数を減少させ、骨の折れるセル分離procedurの使用を避ける、長期間同じ動物におけるCTL輸送の可視化のための反復可能性でありますエス。このイメージング技術を用いて、ICMVsタンパク質抗原と免疫刺激剤と共担持の肺投与は、肺中の抗原特異的CD8 + T細胞および縦隔LNSと遠位の粘膜組織へのCTLのその後の普及の強力な誘発につながったことが最近実証されています、パイエル板、盲腸、および膣管9を含みます。フローサイトメトリーは、これらの新たに拡張したCD8 + T細胞は、α4β7 +インテグリン発現と粘膜のウイルスチャレンジ9に対する媒介防御免疫応答によって特徴づけられる「粘膜ホーミング」表現型と刻印されたことを示しました。生物発光性CD8 + T細胞の全動物の画像化はまた、最近Hailemicheal らによって使用された、不完全フロイントアジュバント（IFA、水中油型エマルジ ョン）に処方腫瘍抗原ペプチドは、部位でT細胞の隔離をもたらしたことを実証した人注射の離れた腫瘍塊からワクチン「デポ」で、T細胞の機能不全と削除40につながります。
四量体染色は、様々なワクチン製剤21から得られた内因性のCTL応答のレベルを定量するために、過去に広く使用されてきました。この技術は、関連すると一般的に特異的な腫瘍関連抗原41,42に対するCTL応答を確認するために、初期のヒト癌免疫療法の臨床試験で利用されます。 PBMCを簡単にマウスから採取し、フローサイトメトリーのために調製することができます。したがって、より広範な分析を必要とする、前または癌モデルにおける腫瘍内で述べたようにしかし、それが原因でデポを形成するワクチンへの細胞局在化T細胞増殖の完全な範囲を明らかにしないことがあります。フローサイトメトリーを使用してこの方法の適合性は、メモリマーカー（CD44、CD62L、CD127、のBcl-2、及びKLRG-1）を用いて抗原特異的T細胞の決定は、エフェクター、中央メモリ、およびエフェクター記憶CEを区別することができ四量体+ T細胞のう ち、LLS 43または長期的な組織常駐的CTL 44,45（最近のレビュー46,47にまとめたように）。高度に拡張抗原特異的T細胞が免疫枯渇48,49の兆候を示すことができるので、四量体染色アッセイは、CTL応答のみ初期評価を提供します。 CTL応答の機能評価は、最小エピトープと同様にパーフォリンおよびグランザイムB 52および外の細胞内レベルを測定することにより、酵素結合免疫スポット（ELISpot）リンパ球のex vivo刺激後50または細胞内サイトカイン染色51で検査するサイトカイン放出により行うことができます脱顆粒53時のCD107aおよびCD107bの発現。また、CTLの細胞溶解作用を直接インビトロまたはインビボで行わ54-56 CTL細胞毒性アッセイで評価することができます。
体液性免疫応答の誘導ナノ粒子ワクチン接種後、ここに提示CD8 + T細胞の分析と並行して研究することができます。に結合する抗体中の抗体価エピトープ認識の抗体の親和性および幅は、カオトロピック剤を使用してELISAプロトコルを修正することによって評価することができるが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）の従来の方法によって分析することができる（ 例えば、尿素）基板と基板、それぞれ7などの抗原内のサブドメインを使用します。強力な体液性応答の誘発は、濾胞ヘルパーCD4 + T細胞の増殖（T FH）57が必要です。粒子ワクチン接種に対する応答におけるT FH細胞の増殖を調べるために、ここで提示プロトコルは容易にナイーブレシピエントマウスに養子細胞移入に続くOT-IIトランスジェニックマウスからの抗原特異的CD4 + T細胞の単離のために適合させることができます。フローサイトメトリーを阻止する分析でワクチン接種した後、リンパ組織を採取し、分析することができます（それらのCD4 + CXCR5 + PD-1 +表現型によって識別される）抗原特異的T FH細胞の鉱山拡大7。
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Disclosures
パーキンエルマーは、この資料の出版物中に発生し、生産コストを提供しました。
Acknowledgments
この研究は、米国立衛生研究所が1K22AI097291-01を付与することにより支持され、受賞数UL1TR000433下で国立衛生研究所のトランスレーショナル科学を前進させるための国立センターによるましました。また、MITの教授ダレルアーバインとワクチンナノ粒子とOT-I /リュックトランスジェニックマウスの初期の作品の彼らの貢献のためのフレッド·ハッチンソンがんセンター教授マティアスステファンを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo | ||
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