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Medicine

परीक्षण के लिए चिकी हार्ट आक्रमण परख कैंसर कोशिकाओं के invasiveness और संभावित विरोधी आक्रामक यौगिकों की गतिविधि

Published: June 6, 2015 doi: 10.3791/52792
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 3, 1, 1
1Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, University of Ghent, 2Department of Sustainable Organic Chemistry and Technology, University of Ghent, 3Department of Chemistry, University of Delhi

Summary

यहाँ, हम तीन आयामों में सामान्य ऊतक टुकड़े रहने में ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह अंग संस्कृति तकनीक मुख्य रूप से इन विट्रो में संभावित विरोधी आक्रामक दवाओं का परीक्षण करने के लिए लागू किया जाता है।

Abstract

लड़की दिल परख के लक्ष्य को तीन आयामों में ट्यूमर आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक अंग संस्कृति विधि का प्रस्ताव है। परख आक्रामक और गैर इनवेसिव कोशिकाओं के बीच भेद, और ट्यूमर आक्रमण पर परीक्षण यौगिकों के प्रभाव के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है सकते हैं। कैंसर की कोशिकाओं को - या तो समुच्चय या एकल कक्षों के रूप में - भ्रूण लड़की दिल के टुकड़े के साथ सामना कर रहे हैं। कुछ दिनों या हफ्तों के लिए निलंबन में अंग संस्कृति के बाद से भिड़ने संस्कृतियों तय कर रहे हैं और histological विश्लेषण के लिए आयल में एम्बेडेड। कैंसर की कोशिकाओं और सामान्य ऊतकों के बीच तीन आयामी बातचीत फिर hematoxylin-eosin के साथ या हृदय के ऊतकों में epitopes या भिड़ने कैंसर कोशिकाओं के लिए immunohistochemical धुंधला के बाद दाग धारावाहिक वर्गों से खंगाला है। परख कैंसर आक्रमण कैंसर की कोशिकाओं और उनके पड़ोसी स्ट्रोमल मेजबान तत्वों (myofibroblasts, endoth के बीच आणविक बातचीत का नतीजा है कि हाल ही में अवधारणा के साथ संगत हैelial कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स घटकों, आदि)। यहाँ, इस स्ट्रोमल वातावरण में एक जीवित ऊतक टुकड़ा के रूप में कैंसर कोशिकाओं के लिए पेशकश की है। परख की प्रासंगिकता को सहायक पहलुओं एकाधिक रहे हैं। प्रगतिशील व्यवसाय और प्रतिस्थापन समय में और मेजबान ऊतक की जगह है, और invasiveness और भिड़ने कोशिकाओं के vivo में गैर invasiveness आम तौर पर परख के परिणाम के साथ संबद्ध: परख में आक्रमण कैंसर के आक्रमण के मानदंडों के अनुसार है। इसके अलावा, विवो में कोशिकाओं के आक्रमण के पैटर्न, पैथोलॉजिस्ट द्वारा परिभाषित के रूप में, परख में histological छवियों में दिखाई देता है। कई संभावित विरोधी आक्रामक जैविक congener यौगिकों के साथ प्राप्त परिणामों के मात्रात्मक संरचना गतिविधि संबंध (QSAR) विश्लेषण क्लिनिक में प्रयोग किया जाता flavonoids और chalcones, और ज्ञात विरोधी मेटास्टैटिक दवाओं के लिए संरचना-गतिविधि के संबंध (जैसे, सूक्ष्मनलिका अवरोधकों के अध्ययन की अनुमति दी ) के रूप में अच्छी तरह से परख में आक्रमण को रोकना। Howeveआर, परख कैंसर आक्रमण करने के लिए खाते प्रतिरक्षात्मक योगदान नहीं ले सकती है।

Introduction

आक्रमण घातक ट्यूमर की पहचान है। इस गतिविधि आसपास के ऊतकों के विनाश की ओर जाता है, लेकिन यह भी मेटास्टेसिस गठन में फंसा हुआ ही नहीं। कैंसर रोगियों के आक्रमण और मेटास्टेसिस, और कुशल विरोधी इनवेसिव उपचार से मरने के बाद अभी भी ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण विकसित किया गया है कि नकल दुर्लभ, प्रयोगशाला assays के हैं। लड़की दिल परख के लक्ष्य को तीन आयामों में ट्यूमर आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक अंग संस्कृति विधि का प्रस्ताव है। परख आक्रामक और गैर इनवेसिव कोशिकाओं के बीच भेद, और ट्यूमर आक्रमण पर परीक्षण यौगिकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है।

परख के उपयोग के पीछे तर्क यह है कि ट्यूमर नियोप्लास्टिक कोशिकाओं लगातार उनके स्ट्रोमा (मेजबान कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स) के साथ बातचीत जहां पारिस्थितिकी प्रणालियों रहे हैं कि वास्तविक अवधारणा है, और इन आणविक बातचीत आक्रमण के माध्यम से कहा कि ठीक से देखते-1 है। तो, परख में ट्यूमर कोशिकाओं Livi के साथ सामना कर रहे हैंट्यूमर कोशिकाओं द्वारा आक्रमण के लिए substrates के रूप में, लेकिन यह भी stromal कोशिकाओं और मैट्रिक्स तत्वों के विभिन्न प्रकार के एक स्रोत के रूप में न केवल सेवा करते हैं जो एनजी भ्रूण लड़की दिल के टुकड़े 2,। लड़की दिल myocytes, fibroblasts और endothelial कोशिकाओं होता है, और बाह्य मैट्रिक्स laminin, फ़ाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन के विभिन्न प्रकार से बना है। इस रास्ते में, तीन आयामी अंग संस्कृति तकनीक रोगी ट्यूमर के आक्रमण में फंसा कई सेलुलर और आणविक मुलाकातों को शामिल किया गया।

लड़की दिल परख का मुख्य लाभ स्ट्रोमल प्रभाव के कार्यान्वयन है। इस पहलू तहखाने झिल्ली 3 या मध्य मैट्रिक्स 4 अणुओं से बना निर्जीव जैल में ट्यूमर सेल आक्रमण के आधार पर कर रहे हैं कि इन विट्रो में अन्य आक्रमण assays में अधिक से अधिक पूरा हो गया है। अंग संस्कृति प्रयोग के रूप में पाया ट्यूमर कोशिकाओं और सामान्य रहने मेजबान ऊतक के बीच टकराव की अवधारणा कई द्वारा शुरू किया गया हैजर्मनी में 7 वोल्फ और श्नाइडर फ्रांस 5 में, यूनाइटेड किंगडम 6 में Easty और Easty, और Schleich सहित लेखकों। उद्धृत तरीकों पर लड़की दिल आक्रमण परख के दो तकनीकी फायदे टुकड़े की मात्रा आसानी से मानकीकृत किया जा सकता है, और वे अंग संस्कृति के दौरान कार्यात्मक अखंडता की निगरानी की अनुमति देता है जो सिकुड़ा, रहना है। वे आसानी से अंडे की बाँझ सामग्री से विच्छेदित किया जा सकता है, क्योंकि इसके अलावा, एवियन भ्रूण पसंद कर रहे हैं। परख ट्यूमर कोशिकाओं के लिए आस-पास के एक जटिल स्ट्रोमल की पेशकश के द्वारा लड़की chorioallantois झिल्ली परख करने के लिए 8 वैचारिक समानता है।

परख सफलतापूर्वक इस तरह 9 और HCT-8 (colonic) 10 सेल लाइन परिवारों एमसीएफ-7 (स्तन) के रूप में ही मानव ट्यूमर से आक्रामक और गैर इनवेसिव सेल वेरिएंट के बीच भेद करने के लिए लागू किया गया है। तकनीक के रूप में अच्छी तरह से संभावित विरोधी आक्रामक यौगिकों का परीक्षण करने के लिए उपयोगी है

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Protocol

चित्र 1
चित्रा अलग परख कदम के 1. योजनाबद्ध सिंहावलोकन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Precultured दिल टुकड़े 1. तैयारी (PHFs)

  1. 9 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक निषेचित लड़की अंडे सेते हैं। (घोंसला सोमवार को, उदाहरण के लिए) ट्यूमर सेल समुच्चय के साथ एक (एक गुरुवार को, उदाहरण के लिए) 4 दिनों के दौरान PHFs के बाद तैयारी की अनुमति देता है कि तारीख और अंतिम टकराव से इस ऊष्मायन को पूरा करें।
  2. पानी में 70% (वी / वी) इथेनॉल के साथ खोल कीटाणुरहित। बाँझ समाधान और सामग्री का उपयोग कर एक टिशू कल्चर कैबिनेट में सब आगे जोड़तोड़ बाहर ले। कुंद संदंश का उपयोग भ्रूण ध्रुव पर खोल खोलें।
  3. Hol के द्वारा भ्रूण बाहर खींचोडिंग एक स्पष्टीकरण चम्मच (चित्रा 2) के साथ गर्दन। घंटी नमक समाधान के 5 एमएल युक्त 5 सेमी की एक व्यास के साथ एक गिलास पेट्री डिश में भ्रूण रखें।
    1. दोनों हाथों में एक तेज संदंश का उपयोग त्वचा खुला तेजस्वी द्वारा उदर वक्ष त्वचा खोलें, हेरफेर के एक ही प्रकार से उरोस्थि निकालने के लिए, और उसके प्रमुख रक्त वाहिकाओं को डिस्कनेक्ट करने के लिए microdissection के iridectomy कैंची का उपयोग कर दिल बाहर काटना। एक calibrated नेत्र ग्रिड के साथ एक macroscope के तहत सभी आगे जोड़तोड़ प्रदर्शन।

चित्र 2
एक स्पष्टीकरण के चम्मच से अंडे से बाहर भ्रूण भारोत्तोलन चित्रा 2। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. के साथ एक गिलास पेट्री डिश के लिए दिल स्थानांतरण5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ सदस्य रीगा 3 संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीग्राम से युक्त 5 सेमी की एक व्यास। Microdissection के iridectomy कैंची का उपयोग दिल के ऊपरी कपाल तीसरे resecting द्वारा अटरिया और एसोसिएटेड जहाजों निकालें। तेज संदंश की एक जोड़ी के साथ निलय से पेरीकार्डियम काटना।
  2. कैंची iridectomy microdissection का उपयोग कर निलय में एक बाण के समान hemisection बनाओ, और धीरे से एक तेज संदंश के साथ झटकों से खून निकाल दें।
  3. 5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ ताजा सदस्य रीगा 3 संस्कृति के माध्यम से 5 मिलीग्राम से युक्त 5 सेमी की एक व्यास के साथ एक गिलास पेट्री डिश में निलय स्थानांतरण। Microdissection के iridectomy कैंची का उपयोग करके व्यास में लगभग 0.4 मिमी के टुकड़ों में निलय काटें। एक दिल के बारे में 100 टुकड़े प्राप्ति कर सकते हैं।
    नोट: एक दिल के बारे में 100 टुकड़े उपज कर सकते हैं
  4. पकवान के केंद्र की ओर सभी निलय टुकड़े ड्राइव करने के लिए धीरे पेट्री डिश घुमाएँ। सितम्बर से एक स्टेनलेस स्टील सुई के साथ सभी निगम aliena निकालेंनिलय टुकड़े से उन्हें arating और पेट्री डिश की परिधि की ओर उन्हें ड्राइविंग।
  5. 2 मध्यम संस्कृति (सदस्य-रीगा 3 प्लस 10% वी / वी भ्रूण गोजातीय सीरम) के मिलीलीटर से 3 से युक्त एक 50 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क करने के लिए एक गिलास पाश्चर pipet के साथ दिल के टुकड़े स्थानांतरण।
    नोट: सटीक मध्यम मात्रा व्यक्ति बोतल के चर नीचे convexities पर निर्भर करता है: उनके नीचे के केंद्र तरल ही की एक पतली फिल्म से कवर किया जाना चाहिए।
  6. Stoppers के माध्यम से हवा में 5% सीओ 2 का एक मिश्रण के साथ कुप्पी (एस) गैस, और 24 घंटे के लिए 70 क्रांतियों / मिनट (आरपीएम) में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक gyrotory प्रकार के बरतन पर कुप्पी (ओं) को सेते हैं। इस निलंबन संस्कृति कदम के लिए तर्क ट्यूमर सेल समुच्चय के साथ बाद में टकराव के लिए उपयुक्त गोलाकार हृदय के ऊतकों टुकड़े प्राप्त करने के लिए है।
  7. एक पेट्री डिश के लिए दिल के टुकड़े और उनकी संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरण। एक सुई के साथ निगम aliena, परिगलित (काला) के टुकड़े, और दिल के टुकड़े की कंपनियों के संगठन त्यागें।
  8. एक और 60 घंटे के लिए कदम 1.9 में वर्णित के रूप में संस्कृति के माध्यम से 6 मिलीग्राम से युक्त एक और 50 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में शेष दिल के टुकड़े को सेते हैं।
    नोट: इस ऊष्मायन अवधि के दौरान, टुकड़े गोलाकार हो जाएगा। वे myoblasts का एक कोर और परिधि में तंतुप्रसू संबंधी कोशिकाओं की एक पतली परत से मिलकर बनता है।
  9. तंतुप्रसू संबंधी कोशिकाओं की एक पतली, सजातीय परत (एक पारदर्शी कैप्सूल बनाने) और एक macroscope और सुई के माध्यम से 0.4 मिमी की एक व्यास का प्रदर्शन गोलाकार टुकड़े का चयन करें। एक लड़की दिल के बारे में 20 उपयुक्त PHFs निकलेगा। ताजा संस्कृति के माध्यम से युक्त एक और पेट्री डिश के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर ताल अनुबंध होगा, जिनमें से कई इन PHFs, स्थानांतरण। ये PHFs परीक्षण कोशिकाओं के साथ टकराव के लिए तैयार हैं।

2. तैयारी और गोलाकार टेस्ट सेल समुच्चय के टकराव

  1. अर्द्ध ठोस अगर मध्यम तैयार: तीन बार उबलते द्वारा घंटी नमक समाधान के 15 मिलीलीटर में अगर की 100 मिलीग्राम भंग। ठंडाभ्रूण गोजातीय सीरम की और 7.5 मिलीलीटर: 40 डिग्री सेल्सियस के लिए निलंबन और घंटी नमक समाधान के 7.5 मिलीग्राम / अंडे का सफेद (1: 1) जोड़ें।
  2. एक 50 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में उनके उचित संस्कृति के माध्यम में 1 × 10 5 परीक्षण कोशिकाओं / एमएल युक्त निलंबन के 6 मिलीलीटर तैयार करें। भिड़ने संस्कृति की शुरुआत की योजना बनाई है इस से पहले 3 दिनों करो। 3 दिनों के लिए 70 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक gyrotory प्रकार के बरतन पर फ्लास्क सेते हैं। प्रयोग किया जाता संस्कृति के माध्यम के प्रकार पर निर्भर करता है, हवा में 5% या 10% (v / v) सीओ 2 का एक मिश्रण के साथ बोतल गैस।
  3. एक calibrated नेत्र ग्रिड से लैस एक macroscope तहत समुच्चय देखें। 0.2 मिमी की एक व्यास के साथ गोलाकार सेल समुच्चय (एक सुई के साथ) का चयन करें।
  4. Semisolid अगर मध्यम 13 से युक्त एक embryological घड़ी-कांच के लिए मध्यम संस्कृति की एक न्यूनतम राशि में आठ चयनित PHFs (व्यास = 0.4 मिमी) स्थानांतरित करने के लिए एक पाश्चर pipet का प्रयोग करें। एक चक्र के रूप में करने के लिए एक सुई के साथ अलग-अलग PHFs ले जाएँ। महाप्राण अतिरिक्त मध्यमफिल्टर पेपर के एक छोटे से टुकड़े का उपयोग कर (चित्रा 3 देखें)।

चित्र तीन
PHFs के आसपास अतिरिक्त तरल पदार्थ की चित्रा 3. आकांक्षा। आठ PHFs एक embryological घड़ी गिलास में अर्द्ध ठोस अगर पर रखा जाता है, और तरल पदार्थ के अतिरिक्त एक छोटी त्रिकोणीय टुकड़ा सेशन फिल्टर पेपर के साथ हटा दिया जाता है। तीर 8 व्यक्तिगत PHFs संकेत मिलता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. पाश्चर pipet का उपयोग सर्कल में दस चयनित गोलाकार सेल समुच्चय (व्यास = 0.2 मिमी) लाओ। अतिरिक्त मध्यम aspirate। वे एक दूसरे के साथ संपर्क बनाने के लिए जब तक सुई के साथ PHF में से प्रत्येक के प्रति एक समग्र ले जाएँ। फिल्टर पेपर के एक छोटे से टुकड़े का उपयोग कर महाप्राण अतिरिक्त मध्यम।
  2. आयल के साथ घड़ी की कांच के ढक्कन सील, और incuपीटा 4 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर - 24 एच, PHFs करने के लिए परीक्षण कोशिकाओं के चिपकने वाला गुणों पर निर्भर करता है।
  3. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) संस्कृति के माध्यम से भिड़ने जोड़े को विसर्जित कर दिया, और संस्कृति के माध्यम से 1.5 मिलीग्राम से युक्त एक 5 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में एक पाश्चर pipet के साथ प्रत्येक व्यक्ति जोड़ी हस्तांतरण।
  4. 120 आरपीएम करने के लिए समायोजित 37 डिग्री सेल्सियस पर एक gyrotory प्रकार के बरतन पर बोतल सेते हैं। परीक्षण कोशिकाओं (चित्रा 4 देखें) के लिए इस्तेमाल संस्कृति के माध्यम के प्रकार पर निर्भर करता है, हवा में 5% या 10% (v / v) सीओ 2 के साथ बोतल गैस।
    1. मीडिया की एकाग्रता से बचने घंटी नमक समाधान के 2 मिलीलीटर से भर दो अनुपूरक 5 मिलीलीटर Erlenmeyer बोतल के माध्यम से उन्हें पारित करके गैसों गीला करने के लिए। हर 8 दिनों संस्कृति के माध्यम ताज़ा करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. लघु Erlenmeyer एक gyrotory Shak के शीर्ष पर बोतल। एर संस्कृति के माध्यम से 1.5 मिलीलीटर के साथ बोतल एक गैस में से लैस सिलिकॉन stoppers के साथ सील कर रहे हैं - और आउटलेट सुई, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 120 rpm पर ले जाया गया। गैस (3 और 4) वितरित व्यक्ति से भिड़ने जोड़े के साथ संस्कृति के माध्यम से युक्त छोटे बोतल के लिए आगे बाँझ घंटी नमक समाधान के साथ भरा बड़ा Erlenmeyer कुप्पी (2) के लिए एक प्रवेश ट्यूबिंग (1) के नेतृत्व में, और (5 और 6)। अंत में, बिताया गैस एक बाँझ पानी के जाल के साथ एक बड़ा फ्लास्क में एकत्र किया जाता है (7), यह हवा में बच सकते हैं, जहां से (8)। आंकड़ा एक घर में बने मंच थाली के शीर्ष पर संस्कृति बैटरी के दो सेट से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

भिड़ने संस्कृति की 3. प्रोटोकॉल

  1. Bouin-Hollande के निर्धारण के समाधान तैयार है।
    1. एकल आसुत पानी की 100 मिलीलीटर में cupric एसीटेट के 2.5 ग्राम (तटस्थ) भंग औरधीरे-धीरे Picric एसिड का 4.0 जी जोड़ें।
    2. एक कागज फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर। Formalin के 10 एमएल और एसिटिक एसिड के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एकल आसुत जल में एक संतृप्त mercuric क्लोराइड समाधान के 1 भाग के साथ इस समाधान के 9 भागों मिलाएं।
      चेतावनी: यह समाधान कई जहरीले पदार्थ होते हैं। Formalin त्वचा के संपर्क में, साँस लेना द्वारा विषाक्त है, और अगर निगल लिया। एसिटिक एसिड घूस के बाद मुंह और आंत्र पथ के लिए संक्षारक है। Picric एसिड तेजी से गर्म या टक्कर से allergenic और जब विस्फोटक है। Mercuric क्लोराइड श्लेष्मा झिल्ली और nefrotoxic करने के लिए उच्च संक्षारक है। Bouin-Hollande के समाधान की तैयारी के लिए सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनते हैं, और आग से एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र दूरदराज में इसे संभाल। एक वैकल्पिक निर्धारण प्रक्रिया फॉस्फेट बफर खारा में 4% formaldehyde के आधार पर किया जाता है।
  2. कई दिनों या ऊष्मायन के सप्ताह के रूप में इस प्रकार के बाद अलग-अलग संस्कृतियों को ठीक करें। सबसे पहले, घंटी नमक संस्कृतियों का स्थानांतरणकुछ सेकंड के लिए समाधान सीरम प्रोटीन को हटाने के लिए। इसके बाद, लगभग 2 घंटे के लिए 3 मिलीलीटर Bouin-Hollande के निर्धारण के समाधान युक्त 3 सेमी की एक व्यास के साथ पेट्री डिश में विसर्जित कर दिया।
  3. जितना संभव हो उतना निर्धारण समाधान निकालने के लिए 2 घंटे के लिए पानी में उन्हें incubating से पहले संस्कृतियों पानी Demineralized 3 मिलीलीटर में तीन बार कुल्ला। अंत में, पानी में 70% (वी / वी) इथेनॉल के 3 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण। इस समाधान हे / एन में संस्कृतियों रखें, लेकिन इस दिन के एक नंबर के लिए बढ़ाया जा सकता है।
  4. 2 घंटा प्रत्येक के लिए 96% पानी में (वी / वी) इथेनॉल, 100% इथेनॉल या 100% isopropanol, और 100% xylene की 100 मिलीग्राम से युक्त जार के माध्यम से क्रमिक रूप से स्थानांतरित करके निर्जलीकरण।
    1. (Xylene की एक न्यूनतम राशि के साथ) एक अलग गिलास coverslip करने के लिए प्रत्येक संस्कृति स्थानांतरण, आयल embedding के लिए एक शराब की बोतल कैप्सूल के तल पर coverslip जगह है, और 56 डिग्री सेल्सियस पर तरल पैराफिन मोम के साथ तय की सामग्री को कवर किया। 24 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, और फिर आरटी के लिए एम्बेडेड सामग्री शांत करते हैं।
      चेतावनी: एक बेंजीन व्युत्पन्न xylene साँस लेना के बाद विषाक्त हो सकता है और केवल अच्छी तरह हवादार क्षेत्रों में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  5. शराब की बोतल कैप्सूल और coverslip निकालें, और निश्चित संस्कृति में शामिल है, जो तेल ब्लॉक में कटौती।
  6. एक सूक्ष्म 14 का उपयोग करते हुए पूरे भिड़ने जोड़ी के 8 माइक्रोन मोटी आयल वर्गों करें, और एक चिपके एजेंट के रूप में ऊतक चिपकने वाला समाधान के साथ pretreated किया गया है कि तीन बारी खुर्दबीन गिलास स्लाइड पर सभी वर्गों को इकट्ठा। यह immunostaining के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि एक चिपके एजेंट के रूप में अंडे का सफेद करने से बचें।
    नोट: खुर्दबीन गिलास स्लाइड के Pretreatment ऊतक चिपकने वाला समाधान के 1 छोटी सी बूंद और एक पाश्चर pipet साथ demineralized पानी की 3 छोटे बूंदों देने, और स्लाइड को कवर करने के लिए उन्हें मिश्रण द्वारा किया जाता है।
  7. 10 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर 100% xylene युक्त एक जार में दो बार डुबो कर पहली स्लाइड से तेल निकाल दें।
  8. में 10 एस के लिए विसर्जन के द्वारा स्लाइड rehydratexylene / इथेनॉल (1: 1) पानी में, 100% इथेनॉल, 96% (वी / वी) इथेनॉल, 70% पानी में (वी / वी) इथेनॉल, और अंत में demineralized पानी निम्न समाधानों में से 100 मिलीग्राम से युक्त जार।
  9. पानी में 96% में आयोडीन (वी / वी) इथेनॉल (w / v) 2 मिनट के लिए 0.5% की 100 मिलीग्राम से युक्त एक जार में विसर्जन के द्वारा mercuric क्लोराइड क्रिस्टल भंग।
  10. 10 सेकंड के लिए पानी में सोडियम Thiosulfate (w / v) 5% की 100 मिलीग्राम से युक्त एक जार में वर्गों को साफ़ करें। फिर आसुत जल में अच्छी तरह से स्लाइड्स धो लें।
  11. 2 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर हैरिस 'hematoxylin युक्त एक जार में स्लाइड्स सेते 0.1 एम एचसीएल में संक्षेप में डूब, और फिर 10 मिनट के लिए पानी के नल चलाने में धो लें।
  12. 1 मिनट के लिए पानी में (w / v) 0.1% eosin 100 मिलीग्राम से युक्त एक जार में सेते हैं।
  13. 100% इथेनॉल दो बार Demineralized पानी, 70% (वी / वी) इथेनॉल, 96% (वी / वी) इथेनॉल, xylene इथेनॉल: समाधान के निम्नलिखित श्रृंखला की 100 मिलीग्राम से युक्त जार में संक्षिप्त डुबकी के माध्यम से निर्जलीकरण (1: 1) , और अंत में 100% xylene।
  14. माउंटस्लाइड पर मध्यम 2 अलग बूंदों देने से बढ़ते मध्यम के साथ स्लाइड्स, उनमें से शीर्ष पर एक coverslip डाल द्वारा इन का विस्तार करते हैं, और यह 24 घंटे के लिए आरटी पर कड़ा करते हैं।

4. Immunohistochemistry

  1. Tris बफर खारा (टीबीएस) तैयार करें। Tris- (hydroxymethyl) -aminomethane (Tris आधार) की 6.0 ग्राम और Demineralized पानी के 4.5 एल में NaCl के 45.0 ग्राम भंग। 1 एम एचसीएल (लगभग 42 मिलीलीटर) के साथ पीएच 7.6 करने के लिए ले आओ। 5 एल बनाने के लिए आसुत जल जोड़ें
  2. Tris-एचसीएल बफर तैयार करें। Demineralized पानी की 800 मिलीलीटर में Tris आधार की 60 ग्राम भंग। 6 एम एचसीएल (लगभग 65 मिलीलीटर) के साथ पीएच 7.6 करने के लिए ले आओ। उपयोग करने से पहले आसुत जल के साथ 1 एल पतला 10x बनाने के लिए आसुत जल जोड़ें।
  3. Tris-बीएसए 0.1% बफर तैयार करें। Tris आधार के 12.1 ग्राम और Demineralized पानी के 4.5 एल में NaCl के 45.0 ग्राम भंग। 1 एम एचसीएल (लगभग 42 मिलीलीटर) के साथ पीएच 8.2 करने के लिए ले आओ। गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और नेन 3 से 6.5 ग्राम के 5.0 जी जोड़ें। 5 एल बनाने के लिए Demineralized पानी जोड़ें
    चेतावनी: NaN3 एक अत्यधिक हैविषाक्त उत्पाद। एसिड के साथ संपर्क बहुत विषाक्त गैसों मुक्त। दस्ताने पहनें और हर तरह से घूस से बचें। NaN3 रूपों तांबा, सीसा और अन्य धातुओं के साथ बहुत ही संवेदनशील विस्फोटक यौगिकों। पानी की प्रचुर मात्रा के साथ फ्लश डूब। एक वैकल्पिक परिरक्षक 0.01% thiomersal है।
  4. आइटम 3.2-3.10 का पालन करें।
  5. टीबीएस या Tris-0.1% BSA बफर में स्लाइड्स डुबकी, और एक कागज तौलिया का उपयोग कर वर्गों के आसपास अतिरिक्त तरल पदार्थ पोंछ।
  6. सहयोग के लिए में बीएसए (w / v) Tris-0.1% टीबीएस में या 5% में एक उच्च आर्द्रता चैम्बर में 30 मिनट के लिए बीएसए बफर (w / v) (एक बंद बॉक्स पतला 150 μl सामान्य बकरी सीरम 01:20 लागू करें अंदर उच्च आर्द्रता सुनिश्चित करने के लिए एक खुला पानी प्राप्तकर्ता) के साथ स्लाइड के -incubation। फिर एक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटा दें।
  7. एक उच्च आर्द्रता चैम्बर में कम से कम 2 घंटे के लिए 1% (वी / वी) सामान्य बकरी सीरम के साथ पूरक बीएसए (w / v) Tris-0.1% में पतला 150 μl प्राथमिक सीरमरोधी लागू करें। प्राथमिक सीरमरोधी का इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करते हैं empiriबड़ी सफाई।
    नोट: Immunohistochemistry लड़की दिल एंटीजन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन, विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग, लड़की दिल एंटीजन के लिए वर्णित तकनीक के रूप में अच्छी तरह से (जैसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में) अन्य प्रतिजन 15 के लिए लागू किया जा सकता है।
  8. 5-10 मिनट के लिए एक कमाल की मेज पर बीएसए वी / डब्ल्यू Tris-0.1% में दो बार स्लाइड धो लें।
  9. एक कागज तौलिया का उपयोग कर अधिक तरल पदार्थ निकालें और अधिक में 150 μl बकरी विरोधी खरगोश सीरमरोधी लागू होते हैं (उदाहरण के लिए।, टीबीएस में 1:20) में कम से कम 1 घंटे के लिए एक उच्च आर्द्रता चैम्बर में।
  10. 5-10 मिनट के लिए एक कमाल की मेज पर टीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  11. एक कागज तौलिया का उपयोग कर अधिक तरल पदार्थ निकालें। एक उच्च आर्द्रता चैम्बर में कम से कम 1 घंटे के लिए 1% (वी / वी) सामान्य बकरी सीरम के साथ पूरक टीबीएस में 250: 1 पतला peroxidase-विरोधी peroxidase जटिल लागू होते हैं। परिसर के कमजोर पड़ने के बैच पर निर्भर करता है।
  12. टीबीएस के साथ स्लाइड्स धो लें और Tris-एचसीएल बफर पीएच 7.6 करने के लिए स्थानांतरण।
  13. एक Tris- में स्लाइड स्थानांतरणकुछ मिनट के लिए diaminobenzidine की 0.25 ग्राम / एल और 0.01% (वी / वी) एच 2 ओ 2 युक्त एचसीएल बफर। लड़की दिल सना हुआ है जब ऊष्मायन बंद करो। माइक्रोस्कोप के तहत नियमित रूप से जांच करें।
  14. आसुत पानी के लिए फिर 10 मिनट के लिए Tris-एचसीएल के लिए स्लाइड स्थानांतरण और।
  15. आइटम 3.13 और 3.14 का पालन करें।
    नोट: आसानी से निर्धारण के दौरान नष्ट कर रहे हैं कि एंटीजन के लिए, संस्कृतियों के cryosectioning immunohistochemical विश्लेषण के लिए एक विकल्प की पेशकश कर सकते हैं। इस के बाद प्रोटोकॉल चरणों में वर्णित है:
  16. सीरम प्रोटीन को हटाने के लिए घंटी नमक समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ रहने संस्कृतियों धो लें।
  17. एक cryomicrotome की precooled (-16 डिग्री सेल्सियस) नमूना धारक को मध्यम एम्बेड करने की एक बूंद जोड़ें। यह पूरी तरह से जमे हुए है इस से पहले ड्रॉप के शीर्ष करने के लिए एक गिलास coverslip के किनारे से सुसंस्कृत ऊतक स्थानांतरण।
  18. 6 माइक्रोन मोटी जमे हुए वर्गों में कटौती, डिग्री सेल्सियस -16 के लिए संस्कृति शांत, और जिलेटिन लेपित पर उन्हें इकट्ठागिलास स्लाइड।
  19. 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एसीटोन में स्लाइड को ठीक करें।
  20. आइटम 4.5-4.15 का पालन करें।

परख परिणाम 5. मूल्यांकन

नोट: वर्तमान परख में, आक्रमण से भिड़ने परीक्षण कोशिकाओं द्वारा PHF के प्रगतिशील व्यवसाय के रूप में परिभाषित किया गया है। एक से भिड़ने संस्कृति से सभी लगातार वर्गों का सूक्ष्म विश्लेषण परीक्षण सेल समुच्चय और तीन आयामों में PHFs के बीच बातचीत के पुनर्निर्माण की अनुमति देता है।

  1. संपर्क और निम्नलिखित पैमाने के अनुसार ग्रेड के विभिन्न पैटर्न का पालन (चित्रा 5 देखें)।
    ग्रेड 0: केवल PHF मनाया। कोई भिड़ने कोशिकाओं मनाया जा सकता है।
    मैं ग्रेड: भिड़ने परीक्षण कोशिकाओं PHF से जुड़े होते हैं, लेकिन हृदय के ऊतकों, नहीं भी सबसे बाहरी तंतुप्रसू सेल परतों पर कब्जा नहीं है।
    ग्रेड IIa: PHF के कब्जे बाहरी तंतुप्रसू की तरह है और myoblast सीई तक सीमित हैडालूँगा परतें।
    ग्रेड IIb: PHF सेल समुच्चय को घेर लिया गया है, लेकिन कब्जे के कोई संकेत नहीं हैं।
    ग्रेड III: भिड़ने कोशिकाओं PHF कब्जा कर लिया है, लेकिन बरकरार हृदय के ऊतकों की मूल राशि की तुलना में आधे से अधिक छोड़ दिया है।
    ग्रेड चतुर्थ: भिड़ने कोशिकाओं PHF की मूल मात्रा की तुलना में आधे से अधिक पर कब्जा कर लिया है।
    नोट: मैं और द्वितीय noninvasive सेल आबादी के साथ मनाया जाता है ग्रेड, ग्रेड तृतीय और चतुर्थ आक्रमण के प्रतीक हैं, जबकि। अलग-अलग समय फ्रेम के भीतर प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए, histological विश्लेषण अलग ऊष्मायन अवधि के बाद तय की संस्कृतियों से भिड़ने के लिए लागू किया जाना चाहिए।

चित्रा 5
भिड़ने कैंसर की कोशिकाओं और PHFs के बीच बातचीत की 5. उदाहरण चित्रा। संस्कृतियों से भिड़ने के histological वर्गों दाग या तो hematoxylin-eosin (बाएं पैनल) या immunohistochemicall साथलड़की दिल (सही पैनल) के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ वाई। इंटरेक्शन ग्रेड प्रोटोकॉल पाठ में परिभाषित कर रहे हैं। (एच: हृदय के ऊतकों, टी: ट्यूमर कोशिकाओं)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

6. विषाक्तता आकलन दवा उपचार के बाद

  1. एक पाश्चर pipet के साथ 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर multidishes करने के लिए एक न्यूनतम मात्रा में भिड़ने संस्कृतियों स्थानांतरण।
  2. दवा मुक्त संस्कृति के माध्यम से 500 μl जोड़कर संस्कृतियों धो लें, और 6 घंटे के बाद ताज़ा करें।
  3. एक औंधा माइक्रोस्कोप (ऑब्जेक्टिव लेंस 40X) का उपयोग explants से सेल परिणाम के लिए दैनिक सभी कुओं का निरीक्षण किया। भिड़ने संस्कृतियों के अस्तित्व का एक सूचकांक प्राप्त करने के लिए explanted संस्कृतियों की कुल संख्या से संस्कृतियों outgrowing की संख्या फूट डालो। विलायक इलाज वालों के साथ दवा इलाज संस्कृतियों के परिणामों की तुलना करें।
    नोट: सेल prolif के लिए Ki67 immunohistochemistry के उपयोग (eration) और TUNEL के परख की () apoptosis के लिए विषाक्तता का आकलन करने के लिए explant परख करने के लिए पूरक तकनीक के रूप में सुझाव दिया है।

भिड़ने संस्कृति की 7. ग्रोथ का आकलन

  1. एक डिजिटल photocamera से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग, बस निर्धारण से पहले संस्कृतियों की सफेद काले और तस्वीरें (ऑब्जेक्टिव लेंस 50X)
  2. मिमी में खाते में बढ़ाई ले रही संस्कृति (क) बड़े और छोटे (ख) व्यास उपाय।
  3. सूत्र 16 के माध्यम से 3 मिमी में अनुमानित मात्रा (वी) की गणना
  4. वी = 0.4 xaxb 2
  5. टकराव के शुरू में PHF और सेल कुल के संयुक्त संस्करणों के साथ इस अंतिम मात्रा की तुलना द्वारा संस्कृति के विकास की गणना।
    नोट: एकान्त PHFs संस्कृति के दौरान उनकी मात्रा कम करने के लिए करते हैं, भिड़ने जोड़े के विकास को ट्यूमर कोशिकाओं पर निर्भर है।

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Representative Results

चित्रा 5 के रूप में पेश histological वर्गों सफल assays के एक नंबर के अंतिम परिणाम दिखाते हैं। संस्कृतियों की आवाज ऊतक विज्ञान व्यवहार्य कोशिकाओं को इंगित करता है और ट्यूमर कोशिकाओं और सामान्य ऊतकों के बीच बातचीत की व्याख्या करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, सामान्य ऊतकों से कोई प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिरक्षा अस्वीकृति प्रणाली विकसित की है, इससे पहले कि जैसे इस्तेमाल किया लड़की भ्रूण की सही उम्र की पुष्टि करता है, जो मनाया जा सकता है। संस्कृति की अवधि के दौरान (सकल) संदूषण के अभाव को इंगित करता है जो दिखाई नहीं बैक्टीरिया होते हैं। अंत में वर्गों के गोल परिधि Erlenmeyer फ्लास्क दीवार के लिए (अस्थायी) से पालन करने का संकेत के बिना निलंबन में संस्कृति की पुष्टि करता है।

कई यौगिकों परख में परीक्षण किया गया है। भिड़ने PHF / ट्यूमर कुल जोड़े छोटे Erlenmeyer बोतल (कदम 2.7) को स्थानांतरित कर रहे हैं जब ड्रग्स आम तौर पर इस समय संस्कृति के माध्यम से दिया जाता है। कुछ में जाना जाता है (औजार के रूप में इस्तेमाल किया गयाhibitors और activators) ट्यूमर आक्रमण करने की प्रक्रिया में फंसा रास्ते और प्रेरक अणुओं को जानने की। संरचनात्मक रूप से संबंधित थे जो अन्य यौगिकों के लिए, एक मात्रात्मक संरचना गतिविधि संबंध (QSAR) लड़की दिल आक्रमण परख के परिणामों के आधार पर स्थापित किया गया था। तो, संबंधित polyphenolics के लिए कम्प्यूटेशनल वर्णनकर्ता के एक नंबर परख में उनके विरोधी आक्रामक गतिविधि का पूर्वानुमान सक्षम करने के लिए इस्तेमाल किया गया। 15 साल की अवधि के दौरान 139 विभिन्न एनालॉगों परख में उनके संभव विरोधी आक्रामक प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया है, और उनकी गतिविधियों के 4 वर्गों में बांटा गया था। एक प्रशिक्षण और 93 और क्रमशः उन polyphenolics के 46 से मिलकर सत्यापन सेट बेतरतीब ढंग से चयन किया गया था। एक QSAR कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क के माध्यम से सत्यापन सेट के परिणाम (6 चित्रा देखें) भविष्यवाणी की है और प्रयोगात्मक विरोधी आक्रामक गतिविधियों के 17 के बीच एक स्पष्ट संबंध दिखाया।

डेटा वीं की मजबूती दिखानेई लड़की दिल आक्रमण परख, भविष्यवाणी की है और प्रयोगात्मक परिणामों के बीच संबंध 15 साल से अधिक मान्य है, और विभिन्न polyphenolics साथ हाल ही में (अप्रकाशित) भविष्यवाणी अध्ययन में पुष्टि की गई है। चित्रा 6 में प्रस्तुत भ्रम मैट्रिक्स कमजोरी और रेखांकन भी परख की ताकत सार: यह सटीकता और reproducibility के किसी न किसी अभिव्यक्ति देता है। इस ग्राफ की व्याख्या के खाते में अंग संस्कृतियों रहने की जैविक परिवर्तनशीलता, और आक्रमण परिणामों की अर्द्ध मात्रात्मक स्कोर लेना चाहिए।

चित्रा 6
चित्रा 6 लड़की दिल आक्रमण परख में छोटे अणुओं की गतिविधि के लिए एक भविष्य कहनेवाला QSAR मॉडल (कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क) के विदेश सत्यापन। इस मॉडल का उत्पादन एक यौगिक के विरोधी आक्रामक गतिविधि वर्ग है। चार ऐसे वर्गों में परिभाषित किया गया है, reprएक अणु विरोधी आक्रामक गतिविधि डाल रही है, जिस पर सबसे कम एकाग्रता esenting (यानी, आक्रमण ग्रेड मैं या द्वितीय) ची परख में: कक्षा 4 (नीचे 1 माइक्रोन के लिए सक्रिय), कक्षा 3 (10 माइक्रोन), कक्षा 2 (100 माइक्रोन) और कक्षा 1 (100 माइक्रोन के रूप में उच्च सांद्रता में कोई विरोधी आक्रामक गतिविधि)। दर्शाया भ्रम मैट्रिक्स भविष्यवाणी की है और प्रयोगात्मक सत्यापन सेट के यौगिकों के लिए विरोधी आक्रामक गतिविधि कक्षाएं निर्धारित तुलना करती है। सत्यापन सेट प्रशिक्षण 93 मॉडल भविष्यवाणियों केवल आणविक संरचना से गणना की वर्णनकर्ता के आधार पर कर रहे हैं, सेट, और इस तरह काल्पनिक यौगिकों के लिए प्राप्त किया जा सकता है, 46 यौगिकों शामिल हैं। इस तरह, कृत्रिम प्रयासों सिलिको गतिविधि में वादा किया साथ अणुओं पर ध्यान केंद्रित किया जा सकता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

PHFs की तैयारी के दौरान, टुकड़े निलंबन में नहीं रह सकते हैं, लेकिन पोत दीवार का पालन करना; इस संस्कृति के माध्यम से की मात्रा को बढ़ाने के द्वारा दूर किया जा सकता है। PHFs की संख्या बहुत कम है और उनके आकार बहुत बड़ा है, संस्कृति के माध्यम से की मात्रा कम होती है। कुल करने के लिए परीक्षण कोशिकाओं की विफलता के तापमान में या सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण के लिए उतार-चढ़ाव की वजह से हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, कुल करने में असमर्थता कोशिकाओं का अभिन्न विशेषता हो सकती है। PHF करने के समुच्चय की कुर्की के दौरान, गरीब आसंजन semisolid अगर मध्यम के शीर्ष पर ऊष्मायन अवधि बढ़ा कर या फिल्टर पेपर अवशोषित के माध्यम से संस्कृतियों के आसपास और अधिक तरल पदार्थ संस्कृति के माध्यम से निकाल कर दूर किया जा सकता है। इस मामले में माइक्रोबियल संदूषण के लिए भी की जाँच करें। सेक्शनिंग में भी कठिनाइयों का तेल ब्लॉक के विघटन के कारण हो सकता है: ब्लॉक के भंडारण अवधि (एक बार फिर आयल पिघल) भी लंबे समय के लिए किया गया है जब यह होता है। कला सेक्शनिंग जबifacts सूक्ष्म चाकू की अखंडता और तय संस्कृतियों में निगम aliena के अभाव जाँच की जानी चाहिए, होते हैं। संस्कृतियों में परिगलित क्षेत्रों गरीब संस्कृति की स्थिति के संकेत मिल रहे हैं। इन क्षेत्रों की संस्कृतियों के केंद्र के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, एक बहुत बड़ी जा रहा टकराव की मात्रा पर शक करना चाहिए। PHF और सेल समुच्चय की मात्रा का उचित चयन वास्तव में एक महत्वपूर्ण कारक है। हालाँकि, और अधिक अनुचित पीएच नियंत्रण, माइक्रोबियल संदूषण या निर्धारण कलाकृतियों की ओर नेक्रोसिस अंक सामान्यीकृत। वर्गों भी अंधेरा दिखाई अंत में, जब hematoxylin में विसर्जन की अवधि भी लंबी हो सकती है, या वर्गों भी मोटी हो सकता है (> 8 माइक्रोन)।

लड़की दिल परख पर कई रूपों आक्रमण अध्ययन में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इन बदलावों मेजबान ऊतक, भिड़ने परीक्षण कोशिकाओं की प्रस्तुति, और ऊष्मायन शर्तों की उत्पत्ति से संबंधित हैं। प्रजातियों से दिल के टुकड़ेलड़की 18 के अलावा अन्य, और इस तरह के जिगर 19, फेफड़ों के 20, और मस्तिष्क 21 के रूप में ऊतकों से, जांच की गई है। इसके बजाय समुच्चय के, बायोप्सी 22 monolayer के टुकड़े 23 नमूनों, और सेल निलंबन अंग संस्कृति में PHF के साथ सामना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। सस्पेंशन संस्कृतियों कभी कभी एक semisolid सब्सट्रेट 24 के ऊपर स्थिर संस्कृतियों के द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं, और सीरम मुक्त टकराव की कोशिकाओं को 25 के कुछ प्रकार के साथ संभव होना दिखाया गया है। आम तौर पर, बातचीत फिर भी एक अर्द्ध मात्रात्मक पैमाने 26 के अनुसार वर्णन किया गया है, कंप्यूटर की मदद से स्वचालित छवि विश्लेषण सिस्टम भी 27,28 विकसित किया गया है। बाद के उद्देश्य ट्यूमर सेल आक्रमण की सीमा पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए।

लड़की दिल परख रहने वाले एक मेजबान ऊतक भी शामिल है के रूप में, सेटअप विवो में स्थिति की पुनरावृत्ति करने का प्रयास करता है, और स्पष्ट रूप से ओ के साथ तुलना में कुछ हद हैइन विट्रो में वहाँ सिस्टम (परिचय अनुभाग देखें)। यह, हालांकि, परख प्राकृतिक ट्यूमर, उदाहरण के लिए प्रतिरक्षा कारकों कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, जहां के वातावरण में मौजूद microecosystem के सभी तत्वों को शामिल करने के लिए विफल रहता है कि मान्यता प्राप्त होना चाहिए। कम से कम एक अध्ययन में, परख में इस तरह के कारकों के अभाव लड़की दिल परख 29 के परिणामों और एक पशु मॉडल 30 के उन लोगों के बीच परस्पर विरोधी परिणामों के लिए प्रेरित किया।

एक भविष्य आवेदन परख में cardiomyocyte मूल कोशिकाओं का अध्ययन किया जाएगा। इन कोशिकाओं को हृदय रोगियों की रोधगलन क्षेत्रों में उपचारात्मक इंजेक्ट किया जा सकता है, लेकिन वे मायोकार्डियम में एकीकृत करने में सक्षम होना चाहिए। लड़की दिल परख में मूल कोशिकाओं लड़की दिल के टुकड़े के साथ सामना किया जाएगा, और उनके प्रवास और भेदभाव का विश्लेषण किया जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ringer's salt solution Braun CEO123
Bacto-agar Becton Dickinson 214010
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar VWR 103157P
BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. Sigma A4503-500G
MEM-Rega 3 Life Technologies  19993013
Gyrotory shakers New Brunswick Scientific G10 and G33
Erlenmeyer flasks 50 ml Novolab 92717
Glass Petri dishes Novolab 68516
Iridectomy scissors Rumex 11-0625
Macroscope with calibrated ocular grid Wild 157702
Paraffin wax International Medical products 8599956
Eosin Y Sigma 230251-25g
Harris' hematoxylin Sigma HHS32-1L
Coverslipping resin (Tissue-Tek) Sakura 4494
Paraffin melting apparatus GFL 1052
Microtome for paraffin sectioning Reichert
Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets Novolab 2602421 and 260243
Diaminobenzidine Sigma D8001
REAX rocking table Heidolph 54131
24-well tissue dishes VWR NUNC142475
Ophtalmological enucleation spoon Rumex 16-060
Sharp forceps Rumex 4-111T
Blunt forceps Nickel-Electro LTD 7112
Erlenmeyer flasks 5 ml Novolab 211901
Microscope slides washed and degreased International Medical products 8613908

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References

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