Summary
Hier presenteren we een protocol om de invasie van tumorcellen bestuderen in levende normaal weefsel fragmenten in drie dimensies. Dit orgelcultuur techniek wordt vooral toegepast om potentieel anti-invasieve drugs testen in vitro.
Abstract
Het doel van de kippehart assay is een relevant orgaan kweekmethode op tumorinvasie bestuderen bij drie dimensies bieden. De test kan onderscheid maken tussen invasieve en niet-invasieve cellen, en maakt onderzoek naar de effecten van testverbindingen op tumorinvasie. Kankercellen - hetzij als aggregaten of enkele cellen - geconfronteerd worden met fragmenten van embryonale kuiken hart. Na orgaankweek in suspensie gedurende een paar dagen of weken de tegenover cultures gefixeerd en ingebed in paraffine voor histologische analyse. Het driedimensionale interactie tussen kankercellen en normale weefsel wordt vervolgens gereconstrueerd uit opeenvolgende coupes gekleurd met hematoxyline-eosine of na immunohistochemische kleuring voor epitopen in het hartweefsel of de naar elkaar kankercellen. De assay is consistent met de recent concept dat kankerinvasie het gevolg van moleculaire interacties tussen kankercellen en hun naburige stromale ontvangende elementen (myofibroblasten, endothEliel cellen, extracellulaire matrix componenten, etc.). Hier wordt dit stromale omgeving aangeboden aan de kankercellen als levend weefsel fragment. Ondersteuning aspecten de relevantie van de assay zijn meerdere. Invasie in de test volgens de criteria van kankerinvasie: progressief bezetting en vervanging in tijd en ruimte van het gastheerweefsel en invasiviteit en niet-invasief in vivo van de tegenover cellen doorgaans correleert met de uitkomst van de assay. Bovendien is de invasie patroon van cellen in vivo, zoals bepaald door pathologen, blijkt uit de histologische beelden in de assay. Kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie (QSAR) analyse van de met vele mogelijke anti-invasieve organische verbindingen congeneer resultaten kon de studie van structuur-activiteit relaties voor flavonoïden en chalconen en bekende anti-metastatische geneesmiddelen in de kliniek gebruikt (bijvoorbeeld, microtubule remmers ) remt invasie in de test ook. However, de assay geen rekening immunologisch bijdragen kankerinvasie.
Introduction
Invasion is het kenmerk van kwaadaardige tumoren. Deze activiteit leidt niet alleen tot de vernietiging van de omringende weefsels, maar is ook betrokken bij metastasevorming. Aangezien patiënten sterven aan kanker en metastase, en efficiënt anti-invasieve behandelingen zijn nog schaars, laboratoriumtesten die bootsen de invasie van tumorcellen ontwikkeld. Het doel van de kippehart assay is een relevant orgaan kweekmethode op tumorinvasie bestuderen bij drie dimensies bieden. De test kan onderscheid maken tussen invasieve en niet-invasieve cellen, en laat de effecten van testverbindingen op tumorinvasie te bestuderen.
De rationale achter het gebruik van de test is het idee dat tumoren ecosystemen waarbij de neoplastische cellen continu communiceren met hun stroma (gastheercellen en de extracellulaire matrix), en die door deze moleculaire interacties invasie verfijnd 1. Dus, in de assay tumorcellen worden geconfronteerd living embryonale kippehart 2 fragmenten, die niet alleen dienen als substraten voor invasie van de tumorcellen, maar ook als bron van verschillende bindweefselcellen en matrixelementen. De kippehart bevat myocyten, fibroblasten en endotheliale cellen en de extracellulaire matrix is samengesteld uit laminine, fibronectine en verschillende soorten collageen. Op deze manier wordt de driedimensionale orgaankweek techniek omvat vele cellulaire en moleculaire interacties betrokken zijn bij de invasie van tumoren van patiënten.
Het belangrijkste voordeel van het kippehart assay is de implementatie van stromale effecten. Dit aspect is vollediger dan in andere invasie in vitro assays die zijn gebaseerd op tumorcel invasie in niet-levende gels bestaande uit basaalmembraan 3 of 4 interstitiële matrix moleculen. Het concept van confrontatie tussen tumorcellen en normale leven gastheerweefsel zoals in orgaankweek experimenten werd door verscheidene ingevoerdauteurs waaronder Wolff en Schneider in Frankrijk 5, Easty en Easty in het Verenigd Koninkrijk 6 en Schleich in Duitsland 7. Twee technische voordelen van het kippehart invasie assay via genoemde werkwijzen is dat het volume van de fragmenten gemakkelijk gestandaardiseerd kan zijn, en dat deze documenten contractiele die functionele integriteit controle toelaat tijdens orgaankweek. Bovendien worden vogelembryo's de voorkeur, omdat zij gemakkelijk kunnen worden ontleed uit de steriele inhoud van het ei. De test moet conceptuele gelijkenis met het kuiken chorioallantois membraan assay 8 door het aanbieden van een complex stromale rondom de tumorcellen.
De test is met succes toegepast om onderscheid te maken tussen invasieve en niet-invasieve cellen varianten van dezelfde menselijke tumoren zoals in de MCF-7 (borstklier) 9 en HCT-8 (colon) 10 cellijn families. De techniek is nuttig om potentieel anti-invasieve testverbindingen en
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1. Schematische weergave van de verschillende test stappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Voorbereiding van de voorgekweekt Heart Fragments (PHF)
- Incubeer een bevrucht kippenei bij 37 ° C gedurende 9 dagen. Vul dit incubatie door een datum die verdere uitwerking van PHF's laat gedurende 4 dagen (bv op een donderdag) en de uiteindelijke confrontatie met tumorcel aggregaten (bijvoorbeeld op het nest maandag).
- Ontsmet de shell met 70% (v / v) ethanol in water. Het uitvoeren van alle verdere handelingen in een weefselkweek kabinet met steriele oplossingen en materialen. Open de shell op de embryonale paal met stompe tang.
- Trek het embryo door holding van de hals met een enucleatie lepel (figuur 2). Plaats het embryo in een glazen petrischaal met een diameter van 5 cm met 5 ml Ringer's zoutoplossing.
- Open het ventrale thoracale huid door het rippen van openen van de huid met een scherp pincet in beide handen, verwijder het borstbeen door dezelfde soort manipulatie en ontleden uit het hart met behulp van microdissectie iridectomie schaar om de grote bloedvaten los te koppelen. Voer alle verdere handelingen onder een macroscoop met een gekalibreerde oculaire raster.
Figuur 2. Het opheffen van het embryo uit het ei met een lepel enucleatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Transfer het hart om een glazen petrischaal meteen diameter van 5 cm met 5 ml MEM Rega 3-kweekmedium met 5% foetaal runderserum. Verwijder de atria en de bijbehorende schepen door resecting het bovenste craniale derde van het hart met behulp van microdissectie iridectomie schaar. Ontleden pericardium van de ventrikels met een paar scherpe tang.
- Maak een sagittale hemisectie in de ventrikels met microdissection iridectomy schaar, en het bloed te verwijderen door voorzichtig schudden met een scherpe tang.
- Breng de ventrikels in een glazen petrischaal met een diameter van 5 cm met 5 ml vers MEM-Rega 3 kweekmedium met 5% foetaal runderserum. Snijd de ventrikels in stukken van ongeveer 0,4 mm diameter met behulp van microdissectie iridectomiescharen. Een hart kan opleveren ongeveer 100 fragmenten.
Opmerking: Een hart kan opleveren ongeveer 100 fragmenten - Draai de petrischaal voorzichtig alle ventriculaire fragmenten drijven naar het midden van de schaal. Verwijder alle corpora aliena met een roestvrij stalen naald van septemberze arating van de ventriculaire fragmenten en rijden ze naar de omtrek van de petrischaal.
- Transfer het hart fragmenten met een glas Pasteur pipet om een 50 ml erlenmeyer met 2 tot 3 ml kweekmedium (MEM-Rega 3 plus 10% v / v foetaal runderserum).
Opmerking: Het exacte gemiddeld volume is afhankelijk van de variabele convexe bodem van de afzonderlijke kolven: het centrum van de bodem moet worden bedekt met een dunne film van slechts vloeistof. - Gas de kolf (s) met een mengsel van 5% CO 2 in lucht via de stoppen en incubeer de kolf (s) op een gyrotory schudinrichting bij 37 ° C bij 70 toeren / min (rpm) gedurende 24 uur. De reden voor deze schorsing cultuur stap is sferoïdale hartweefsel fragmenten die geschikt zijn voor de daaropvolgende confrontatie met tumorcel aggregaten te verkrijgen.
- Transfer het hart fragmenten en hun cultuur medium om een petrischaal. Gooi corpora aliena, necrotische (donker) fragmenten, en conglomeraten van het hart fragmenten met een naald.
- Incubeer de overgebleven hart fragmenten in een 50 ml Erlenmeyer kolf die 6 ml kweekmedium zoals beschreven in stap 1.9 nog eens 60 uur.
Opmerking: Tijdens deze incubatietijd zal de fragmenten bolvormig geworden. Ze bestaan uit een kern van myoblasten en een dunne laag van fibroblast cellen aan de omtrek. - Selecteer bolvormige fragmenten vertonen een dunne, homogene laag van fibroblast cellen (vormen van een doorzichtige capsule) en een diameter van 0,4 mm door middel van een macroscoop en naalden. Een kuiken hart zal opleveren ongeveer 20 geschikt PHFs. Breng deze PHF, waarvan vele ritmisch samentrekken bij 37 ° C, een andere petrischaal met vers kweekmedium. Deze PHFs zijn klaar voor de confrontatie met testcellen.
2. Voorbereiding en confrontatie van Spheroidal Test celaggregaten
- Bereid semi-vast agarmedium: los 100 mg agar in 15 ml Ringer's zoutoplossing door koken driemaal. Koelde suspensie tot 40 ° C en voeg 7,5 ml Ringer's zoutoplossing / eiwit (1: 1) en 7,5 ml foetaal runderserum.
- Bereid 6 ml van een suspensie met 1 x 10 5 testcellen / ml in hun respectievelijke kweekmedium in een 50 ml Erlenmeyer kolf. Doe dit 3 dagen voor aanvang van de kweek confronterende gepland. Incubeer de kolf in een gyrotory schudinrichting bij 37 ° C bij 70 rpm gedurende 3 dagen. Gas de kolven met een mengsel van 5% en 10% (v / v) CO 2 in de lucht, afhankelijk van het type gebruikte kweekmedium.
- Bekijk de aggregaten onder een macroscoop uitgerust met een gekalibreerde oculaire raster. Selecteer (met een naald) bolvormige cel aggregaten met een diameter van 0,2 mm.
- Gebruik een Pasteur pipet tot acht geselecteerde PHFs (diameter = 0,4 mm) over te dragen in een minimale hoeveelheid van de cultuur medium om een embryonale horloge-glas met halfvaste agarmedium 13. Verplaats de individuele PHFs met een naald om een cirkel te vormen. Zuig overtollige mediummet een klein stukje filtreerpapier (zie figuur 3).
Figuur 3. Aspiration van overtollig vocht rond PHFs. Acht PHFs zijn op semi-vaste agar geplaatst in een embryologische horlogeglas en overtollig vocht wordt verwijderd met een kleine driehoekige stukje op filter papier. Pijlen geven de 8 afzonderlijke PHFs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Breng ten gekozen bolvormige celaggregaten (doorsnede = 0,2 mm) in de cirkel met een Pasteur pipet. Zuig overtollige medium. Verplaats een totaal aan elk van de PHF met de naald totdat ze contact maken met elkaar. Zuig overtollige medium met behulp van een klein stukje van het filter papier.
- Sluit de deksel van de horloge-glas met paraffine en INCUverminder bij 37 ° C gedurende 4-24 uur, afhankelijk van de hechting van de testcellen aan de PHFs.
- Dompel de tegenover paren met voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium, en breng elke individuele af- met een Pasteur pipet in een 5 ml Erlenmeyer kolf die 1,5 ml kweekmedium.
- Incubeer de kolven op een gyrotory schudinrichting bij 37 ° C ingesteld op 120 rpm. Gas de kolven met 5% en 10% (v / v) CO 2 in de lucht, afhankelijk van het type gebruikte kweekmedium voor testcellen (zie figuur 4).
- Om de concentratie van de media te voorkomen, bevochtig de gassen door ze door twee aanvullende 5 ml erlenmeyers gevuld met 2 ml Ringer-zoutoplossing. Vernieuwen het kweekmedium per 8 dagen.
Figuur 4. Kleine erlenmeyers bovenop een gyrotory Shak. er de kolven met 1,5 ml kweekmedium zijn afgedicht met silicone stop voorzien van een gas in - en uitlaat naald, en verhuisde op 120 rpm bij 37 ° C. Het gas wordt geleid door een inlaatbuis (1) de grotere Erlenmeyer kolf (2) gevuld met steriele Ringer's zoutoplossing, en verder worden verdeeld (3 en 4) kleinere flessen met kweekmedium met individuele overliggende paren (5 en 6). Tenslotte wordt afgewerkt gas opgevangen in een grotere kolf met steriel waterafscheider (7), van waaruit het kan ontsnappen lob (8). De figuur toont twee sets van cultuur batterijen op de top van een zelfgemaakte platform plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Histologie van het Confronteren Culturen
- Bereid Bouin-Hollande's fixatie-oplossing.
- Los 2,5 g cupriacetaat (neutraal) in 100 ml gedestilleerd water enkelvoudige enVoeg langzaam 4,0 g picrinezuur.
- Filtreer de oplossing door een papieren filter. Voeg 10 ml formaline en 1 ml azijnzuur. Meng 9 delen van deze oplossing met 1 deel van een verzadigde oplossing van kwikchloride in één gedestilleerd water.
LET OP: Deze oplossing bevat verschillende giftige stoffen. Formaline is giftig bij inademing, aanraking met de huid en opname door de mond. Azijnzuur is bijtend voor de mond en darmkanaal na inname. Picrinezuur is allergeen en explosief toen snel verhit of door percussie. Kwikchloride is zeer corrosief voor de slijmvliezen en nefrotoxisch. Draag beschermende kleding en handschoenen voor het bereiden van Bouin-Hollande's oplossing, en omgaan in een goed geventileerde ruimte op afstand van de brand. Een alternatieve fixatieprocedure gebaseerd op 4% formaldehyde in met fosfaat gebufferde zoutoplossing.
- Bevestig de individuele kweken na enkele dagen of weken incubatie als volgt. Ten eerste, de overdracht van de culturen om zout Ringer'soplossing gedurende enkele seconden aan serumeiwitten te verwijderen. Vervolgens dompelen in petrischalen met een diameter van 3 cm met 3 ml Bouin-Hollande fixatie-oplossing gedurende ongeveer 2 uur.
- Spoel de kweken driemaal in 3 ml gedemineraliseerd water alvorens te incuberen in water gedurende 2 uur tot wel fixatie oplossing mogelijk te verwijderen. Breng tenslotte aan 3 ml 70% (v / v) ethanol in water. Houd de kweken in deze oplossing O / N, maar dit kan worden verlengd aantal dagen.
- Uitdrogen door overdracht achtereenvolgens met potjes met 100 ml 96% (v / v) ethanol in water, 100% ethanol en 100% isopropanol en 100% xyleen gedurende 2 uur elk.
- Overdracht elke cultuur een aparte glazen dekglaasje (met een minimale hoeveelheid xyleen), plaatst het dekglaasje op de bodem van een wijnfles capsule voor paraffine inbedding en dekken vaste materiaal met vloeibare paraffine bij 56 ° C. Incubeer bij 56 ° C gedurende 24 uur en koel dan het ingesloten materiaal tot kamertemperatuur.
LET OP: Als een benzeenderivaat xyleen giftige na inademing kan zijn en mogen alleen worden behandeld in goed geventileerde ruimten.
- Overdracht elke cultuur een aparte glazen dekglaasje (met een minimale hoeveelheid xyleen), plaatst het dekglaasje op de bodem van een wijnfles capsule voor paraffine inbedding en dekken vaste materiaal met vloeibare paraffine bij 56 ° C. Incubeer bij 56 ° C gedurende 24 uur en koel dan het ingesloten materiaal tot kamertemperatuur.
- Verwijder de fles wijn capsule en het dekglaasje, en knip de paraffine blok dat het vaste cultuur bevat.
- Maak 8 urn dikke paraffine secties van de hele confronterende paar met behulp van een microtoom 14, en het verzamelen van alle secties op drie afwisselende microscoop glasplaatjes die zijn voorbehandeld met weefsel lijm oplossing als een knelpunt middel. Vermijd het eiwit als een knelpunt middel, omdat het kan interfereren met immunokleuring.
Opmerking: Voorbehandeling van de microscoop objectglaasjes wordt uitgevoerd door het leveren van 1 druppeltje weefselhechtmiddel oplossing en 3 kleine druppels gedemineraliseerd water met een Pasteur pipet en het mengen ervan met de schuif. - Verwijder de paraffine uit de eerste dia tweemaal dompelen in een pot met 100 ml 100% xyleen gedurende 10 min.
- Hydrateren de dia's door onderdompeling gedurende 10 s inpotjes met 100 ml van de volgende oplossingen: xyleen / ethanol (1: 1) 100% ethanol, 96% (v / v) ethanol in water, 70% (v / v) ethanol in water en tenslotte met gedemineraliseerd water.
- Los kwikchloride kristallen door onderdompeling in een pot met 100 ml 0,5% (w / v) jodium in 96% (v / v) ethanol in water gedurende 2 min.
- Schakel de secties in een pot met 100 ml van 5% (w / v) natriumthiosulfaat in water gedurende 10 sec. Was daarna de dia's grondig in gedestilleerd water.
- Incubeer de glaasjes in een pot met 100 ml Harris 'hematoxyline gedurende 2 min, dompel even in 0,1 M HCl en vervolgens wassen in stromend leidingwater gedurende 10 min.
- Incubeer in een pot met 100 ml eosine 0,1% (w / v) in water gedurende 1 min.
- Uitdrogen via korte onderdompeling in potten met 100 ml van de volgende reeks oplossingen: gedemineraliseerd water, 70% (v / v) ethanol, 96% (v / v) ethanol, 100% ethanol tweemaal xyleen-ethanol (1: 1) en uiteindelijk in 100% xyleen.
- Monteer dedia's met montage medium door het leveren van 2 afzonderlijke druppels van het medium op de glijbaan, laat deze uit te breiden door er een dekglaasje op de top van hen, en laat het uitharden bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
4. Immunohistochemie
- Bereid Tris-gebufferde saline (TBS). Los 6,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris-base) en 45,0 g NaCl in 4,5 L gedemineraliseerd water. Breng op pH 7,6 met 1 M HCl (ongeveer 42 ml). Voeg gedestilleerd water tot 5 L. maken
- Bereid Tris-HCl buffer. Oplossen in 800 ml gedemineraliseerd water 60 g Tris base. Breng aan de pH 7,6 met 6 M HCl (ongeveer 65 ml). Voeg gedestilleerd water tot 1 L. Verdun 10x maken met gedestilleerd water voor gebruik.
- Bereid Tris-BSA 0,1% buffer. Los 12,1 g Tris base en 45,0 g NaCl in 4,5 L gedemineraliseerd water. Breng op pH 8,2 met 1 M HCl (ongeveer 42 ml). Voeg 5,0 g runderserumalbumine (BSA) en 6,5 g NaN3. Voeg gedemineraliseerd water tot 5 L. maken
LET OP: NaN3 is een zeergiftig product. Contact met zuren zeer giftige gassen. Draag handschoenen en inslikken vermijden door alle middelen. NaN3 vormen zeer gemakkelijk ontplofbare verbindingen met koper, lood en andere metalen. Spoel wastafels met overvloedige hoeveelheden water. Een alternatieve bewaarmiddel 0,01% thiomersal. - Volg artikelen 3,2-3,10.
- Dompel de dia's in TBS of Tris-0,1% BSA-buffer, en veeg het overtollige vocht rond de secties met behulp van een papieren handdoek.
- Breng 150 pi normale geit serum verdund 1:20 in TBS of 5% (w / v) BSA in Tris-0,1% (w / v) BSA buffer gedurende 30 min in een zeer vochtige kamer (een gesloten doos voor de co -incubation van de dia's met een open water ontvanger in het waarborgen van een hoge luchtvochtigheid). Verwijder vervolgens overtollige vloeistof met een papieren handdoek.
- Breng 150 pi primaire antiserum verdund in Tris-0,1% (w / v) BSA, aangevuld met 1% (v / v) normaal geit serum gedurende ten minste 2 uur in een zeer vochtige kamer. Bepaal de optimale verdunning van het primaire antiserum Empiritisch.
Opmerking: Immunohistochemie kan worden gebruikt om kippehart antigenen te detecteren maar, met specifieke antilichamen, kan de beschreven kippehart antigenen technieken worden toegepast op andere antigenen (bijvoorbeeld groen fluorescent eiwit) 15 ook. - Was de glaasjes tweemaal Tris-0,1% w / v BSA op een schommelende tafel voor 5-10 min.
- Verwijder overtollig vocht met een papieren handdoek en toepassen 150 pl geit anti-konijn antiserum werden (bv., 1:20 in TBS) gedurende ten minste 1 uur in een zeer vochtige kamer.
- Twee keer wassen met TBS op een schommelende tafel voor 5-10 min.
- Verwijder overtollige vloeistof met een papieren handdoek. Breng de peroxidase-anti-peroxidase-complex verdund 1: 250 in TBS dat was aangevuld met 1% (v / v) normaal geit serum gedurende ten minste 1 uur in een vochtige kamer. De verdunning van het complex afhangt van de batch.
- Was de dia's met TBS en overbrengen in Tris-HCl buffer pH 7,6.
- Overdracht van de dia's in een TrisHCl-buffer bevattende 0,25 g / l diaminobenzidine en 0,01% (v / v) H 2 O 2 gedurende enkele minuten. Stop de incubatie wanneer het kuiken hart wordt gekleurd. Controleer regelmatig onder de microscoop.
- Breng de objectglaasjes Tris-HCl gedurende 10 minuten en vervolgens gedestilleerd water.
- Volg de artikelen 3.13 en 3.14.
Opmerking: Voor antigenen die gemakkelijk vernietigd tijdens fixatie kan cryosectioning van de kweken alternatief voor immunohistochemische analyse bieden. Dit wordt beschreven in het volgende protocol stappen: - Was de levende kweken met 3 ml Ringer zoutoplossing aan serumeiwitten te verwijderen.
- Voeg een druppel van inbedding medium om de voorgekoeld (-16 ° C) specimen houder van een cryomicrotoom. Breng het gekweekte weefsel vanaf de rand van een glazen dekglaasje op de top van deze daling voordat het volledig is bevroren.
- Koel de cultuur tot -16 ° C, gesneden 6 pm dikke bevroren secties, en verzamel ze op gelatine-gecoatglasplaatjes.
- Zet de objectglaasjes in aceton bij 4 ° C gedurende 10 min voor opslag bij 4 ° C.
- Volg artikelen 4,5-4,15.
5. Evaluatie van de testresultaten
Opmerking: In deze test wordt gedefinieerd als de invasie geleidelijke bezetting van de PHF door de naar elkaar testcellen. Microscopische analyse van alle opeenvolgende secties uit een confrontatie cultuur maakt de reconstructie van de interactie tussen de test cel aggregaten en de PHFs in drie dimensies.
- Let op de verschillende patronen van interactie en kwaliteit volgens de volgende schaal (zie figuur 5).
Graad 0: Alleen PHF waargenomen. Nr confronteren cellen waarneembaar.
Grade I: De confrontatie testcellen worden aan de PHF bevestigd, maar het hartweefsel, zelfs niet de buitenste fibroblastische cel lagen niet te bezetten.
Grade IIa: Bezetting van de PHF beperkt tot de buitenste fibroblast-achtige en myoblast cell lagen.
Grade IIb: De PHF heeft omringd de cel aggregaten, maar er zijn geen tekenen van de bezetting.
Grade III: De confrontatie cellen hebben bezet de PHF, maar hebben meer links dan de helft van het oorspronkelijke bedrag van hartweefsel intact.
Graad IV: De confronterende cellen meer bezet dan de helft van het oorspronkelijke volume van de PHF.
Opmerking: Grades I en II worden waargenomen met noninvasive celpopulaties, terwijl klassen III en IV zijn kenmerkend voor invasie. Tot progressie binnen verschillende tijdspaden evalueren, moeten histologische analyse worden toegepast op confronteren na verschillende incubatieperioden vaste culturen.
Figuur 5. Voorbeelden van interacties tussen confronterende kankercellen en PHFs. Histologische coupes van het confronteren van culturen gekleurd ofwel met hematoxyline-eosine (links panelen) of immunohistochemically met een antilichaam tegen chick hart (rechts panelen). Interactie soorten worden gedefinieerd in het protocol tekst. (H: hartweefsel, T: tumorcellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Toxiciteit Evaluatie na Drug Behandelingen
- Breng de tegenover kweken in een minimaal volume 24-well weefselkweek multidishes met een Pasteur pipet.
- Was de culturen door het toevoegen van 500 pi van drugsvrije kweekmedium en vernieuwen na 6 uur.
- Inspecteer alle putjes daags cel uitgroei van de explantaten met behulp van een omgekeerde microscoop (40X objectief). Verdeel het aantal uitgroeiende culturen door het totale aantal geëxplanteerde kweken van een index van overleving van de naar elkaar cultures te verkrijgen. Vergelijk de resultaten van drug-behandelde kweken met oplosmiddel behandelde degenen.
Opmerking: het gebruik van Ki67 immunohistochemie (voor cel- Prolifking) en TUNEL assay (bij apoptose) worden voorgesteld als complementaire technieken om de explantatie assay voor de beoordeling van toxiciteit.
7. Groei Beoordeling van Confronting Cultures
- Maak zwart-wit foto's van de culturen net voor fixatie, met behulp van een microscoop uitgerust met een digitale fotocamera (objectief 50X)
- Meet in mm grotere (a) en kleinere (b) diameter van de kweek rekening houdend met de vergroting.
- Bereken het geschatte volume (V) in mm 3 via de formule 16
- V = 0,4 xaxb 2
- Bereken de groei van de kweek door het vergelijken van het eindvolume van de gecombineerde volumes van PHF en celaggregatie aan het begin van de confrontatie.
Opmerking: Omdat solitair PHF neiging om hun volume tijdens kweek te verlagen, de groei van de tegenover elkaar paren is afhankelijk van de tumorcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De histologische secties zoals aangegeven in figuur 5 tonen het resultaat van een aantal succesvolle assays. Het geluid histologie van de kweken aangeeft levensvatbare cellen en maakt het mogelijk om de interactie tussen tumorcellen en normale weefsels interpreteren. Bovendien kan geen immune reactie van het normale weefsel worden waargenomen, die de correcte leeftijd van het kippenembryo's bijvoorbeeld gebruikt bevestigt vóór de afstoting systeem ontwikkeld. Er zijn geen zichtbare bacteriën die zonder (bruto) verontreiniging geeft tijdens de kweekperiode. Tenslotte is de afgeronde rand van de secties bevestigt cultuur in suspensie zonder tekenen van (tijdelijke) vasthouden aan de erlenmeyer muur.
Vele verbindingen zijn getest in de assay. Geneesmiddelen worden in het algemeen geleverd aan het kweekmedium op het moment dat de naar elkaar PHF / tumor paren aggregaat worden overgebracht naar kleine Erlenmeyer kolven (stap 2.7). Sommige werden gebruikt als hulpmiddelen (bij bekendehibitors en activatoren) te wegen en effector moleculen betrokken bij het proces van tumorinvasie ontrafelen. Voor andere verbindingen die structureel verwant waren, een kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties (QSAR) werd opgericht op basis van de resultaten van het kuiken hart invasie assay. Dus, op gerelateerde polyphenolics een aantal rekenkundige descriptors werden gebruikt voor de voorspelling van de anti-invasieve werking van de assay mogelijk. Over een periode van 15 jaar 139 verschillende analogen werden getest op hun mogelijke anti-invasieve werking van de assay, en hun activiteiten werden gegroepeerd in 4 klassen. Een training en een validatie set bestaande uit 93 en 46 van respectievelijk de polyphenolics werden willekeurig geselecteerd. Via een QSAR kunstmatig neuraal netwerk de resultaten van de validatieverzameling toonden een duidelijke correlatie tussen de voorspelde en experimentele anti-invasieve activiteiten 17 (zie figuur 6).
De gegevens tonen de robuustheid van the chick hart invasie assay, omdat de correlatie tussen de voorspelde en experimentele resultaten geldig was meer dan 15 jaar, en bevestigd in een recent (ongepubliceerd) voorspelling studie met verschillende polyfenolen. De verwarring matrix getoond in Figuur 6 vat de zwakte en de sterkte van de assay grafisch: het geeft een ruwe expressie van de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. De interpretatie van deze grafiek moet rekening houden met de biologische variabiliteit van levend orgaan culturen, en de semi kwantitatieve score van de invasie resultaten.
Figuur 6. Externe validatie van een voorspellend model QSAR (kunstmatig neuraal netwerk) voor de activiteit van kleine moleculen in het kuiken hart invasie assay. De output van dit model is het anti-invasieve activiteitsniveau van een verbinding. Vier van dergelijke klassen zijn gedefinieerd, representing de laagste concentratie waarbij een molecuul uitoefent anti-invasieve werking (dat wil zeggen, invasie graad I of II) in het CHI assay: klasse 4 (actief tot 1 uM), klasse 3 (10 uM), klasse 2 (100 uM) en klasse 1 (zonder anti-invasieve activiteit bij concentraties tot 100 uM). De afgebeelde verwarring matrix vergelijkt voorspeld en experimenteel bepaalde anti-invasieve klassen voor de verbindingen van de validatie set. De validatie set bevat 46 verbindingen, de training ingesteld 93. Model voorspellingen zijn uitsluitend op descriptoren berekend op basis van moleculaire structuur gebaseerd, en kan dus worden verkregen hypothetische verbindingen. Op deze manier kunnen synthetische inspanningen worden gericht op moleculen met een veelbelovende in silico activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de voorbereiding van PHF's, kunnen de fragmenten niet blijven in suspensie, maar houden aan de vaatwand; Dit kan worden ondervangen door het volume van het kweekmedium. Als het aantal PHFs is te laag en hun grootte is te groot, te verlagen van het volume van het kweekmedium. Falen van de testcellen om te aggregeren kan te wijten zijn aan schommelingen in de temperatuur of microbiële infectie. Als alternatief kan een onvermogen om te aggregeren een intrinsieke eigenschap van de cellen. Bij bevestiging van de aggregaten PHF kunnen slechte adhesie worden overwonnen door verlenging van de incubatietijd bovenop de halfvast agar medium of door het verwijderen vloeibaarder kweekmedium rond de kweken door middel van absorberend filtreerpapier. Controleer ook voor microbiële verontreiniging in dit geval. Moeilijkheden tijdens het snijden kan het gevolg zijn van het uiteenvallen paraffineblokken: dit gebeurt wanneer de opslagperiode van de blokken te lang is (gesmolten paraffine weer). Bij het snijden artifacts optreden, de integriteit van de microtoom mes en de afwezigheid van corpora aliena in de vaste kweken worden gecontroleerd. Necrotische gebieden in de culturen zijn tekenen van slechte kweekomstandigheden. Indien ze zijn beperkt tot het midden van de kweken, moet men het volume van de botsingen te groot vermoeden. De juiste keuze van de hoeveelheden van de PHF en celaggregaten inderdaad een kritische factor. Echter, meer veralgemeende necrose punten richting ongepast pH-regeling, microbiële besmetting of fixatie artefacten. Ten slotte, wanneer de secties te donker, de onderdompeling periode in hematoxyline kan te lang zijn, of het delen kunnen te dik zijn (> 8 urn).
Vele variaties op het kippehart test met succes toegepast bij de invasie studies. Deze variaties hebben betrekking op de oorsprong van het gastheerweefsel, de presentatie van de tegenover testcellen en de incubatieomstandigheden. Hart fragmenten uit speciesmet uitzondering kuiken 18, en vanuit weefsels zoals lever 19, long- 20 en hersenen 21, zijn onderzocht. In plaats van aggregaten, biopten 22 monolayer fragmenten 23 en celsuspensies werden gebruikt ter confrontatie met PHF in orgaankweek. Suspensiekweken worden soms vervangen door statische kweken bovenop een halfvaste substraat 24, en serumvrije confrontatie bleken mogelijk bij bepaalde typen cellen 25 zijn. In het algemeen wordt de interactie beschreven volgens een semikwantitatieve schaal 26 hebben echter computergestuurde automatische beeldanalyse systemen ook ontwikkeld 27,28. Het laatste doel kwantitatieve informatie over de omvang van tumorcel invasie verschaffen.
Als kippehart assay omvat een levend gastheerweefsel de setup probeert de situatie in vivo recapituleren en duidelijk is van enig belang tegenover other systemen in vitro (zie inleiding sectie). Er moet echter worden onderkend dat de test niet alle elementen van de microecosystem aanwezig in natuurlijke tumoren omgevingen waar bijvoorbeeld immunologische factoren invasieve gedrag van de kankercellen te beïnvloeden omvatten. In ten minste één studie werd de afwezigheid van dergelijke factoren in de bepaling tot tegenstrijdige resultaten tussen de uitkomsten van de kippehart assay 29 en die van een diermodel 30.
Een toekomstige toepassing de studie van cardiomyocyten progenitorcellen in de assay. Deze cellen kunnen therapeutisch worden geïnjecteerd infarct zones van hartpatiënten, maar ze moeten kunnen integreren in het myocardium. In het kuiken hart test zal de stamcellen worden geconfronteerd met kuiken hart fragmenten en hun migratie en differentiatie zal worden geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al.
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B.
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
