Summary
ここでは、三次元での正常組織片をリビングへの腫瘍細胞の浸潤を研究するためのプロトコルを提示します。この器官培養技術は、主にin vitroで 、潜在的に抗浸潤薬をテストするために適用されます。
Abstract
ニワトリ心臓アッセイの目的は、三次元で腫瘍浸潤を研究するための関連する器官培養方法を提供することです。アッセイは、侵襲的および非侵襲的な細胞とを区別し、腫瘍浸潤に対する試験化合物の効果の研究を可能にすることができます。癌細胞は - のいずれかの凝集体または単一細胞として - ニワトリ胚の心臓の断片に直面しています。数日または数週間のための懸濁液中の器官培養した後に直面している培養物を固定し、組織学的分析のためにパラフィンに包埋しました。癌細胞と正常組織との間の三次元相互作用は、その後、ヘマトキシリン - エオシンで、または心臓組織内のエピトープまたは対向癌細胞に対する免疫組織化学的染色後の染色連続切片から再構築されます。アッセイは、癌浸潤は、癌細胞とその隣接する間質ホスト要素（筋線維芽細胞、endoth間の分子間相互作用の結果であることを最近の概念と一致していますelial細胞、細胞外マトリックス成分、等）。ここで、この間質環境は、生体組織片などの癌細胞に提供されます。アッセイの妥当性への支援の側面が複数あります。時間と宿主組織の空間の漸進的占領と交換、および直面細胞の生体内での侵襲性および非侵襲性は、一般的に、アッセイの結果と相関する：アッセイにおける侵入は癌浸潤の基準に従うものです。さらに、 インビボでの細胞の浸潤パターンは、病理学者によって定義されるように、アッセイでの組織学的画像に反映されています。多数の潜在的抗浸潤有機同族化合物を用いて得られた結果の定量的構造活性関係（QSAR）分析は、診療所で使用されるフラボノイドおよびカルコン、および既知の抗転移薬のための構造-活性関係（ 例えば、微小管阻害剤の研究を可能にしました）ならびにアッセイに侵入を阻害します。 HoweveR、アッセイは、アカウントに癌浸潤に対する免疫学的貢献を取ることはありません。
Introduction
侵略は、悪性腫瘍の特徴です。この活動は、周囲の組織の破壊につながるだけでなく、転移形成に関与しているだけでなく。癌患者は、浸潤および転移によって死亡し、効率的な抗侵襲治療はまだ不足しているので、腫瘍細胞の浸潤を模倣する実験用アッセイが開発されています。ニワトリ心臓アッセイの目的は、三次元で腫瘍浸潤を研究するための関連する器官培養方法を提供することです。アッセイは、侵襲的および非侵襲的な細胞とを区別し、腫瘍浸潤に対する試験化合物の効果を研究することを可能にすることができます。
アッセイの使用の理論的根拠は、腫瘍は、腫瘍細胞が継続的に間質（宿主細胞と細胞外マトリックス）と相互作用し、かつ、これらの分子相互作用を介して侵入を微調整1である生態系であり、実際の概念です。そのため、アッセイにおいて腫瘍細胞をliviに直面しています腫瘍細胞による浸潤のための基質として、また間質細胞とマトリックス要素の異なるタイプの供給源として働くだけでなく、ngのニワトリ胚の心臓断片2、。ニワトリの心臓は、筋細胞、線維芽細胞および内皮細胞を含む、細胞外マトリックスはラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲンの異なる種類で構成されています。このように、三次元器官培養技術は、患者の腫瘍の浸潤に関与する多くの細胞および分子間相互作用を覆います。
ニワトリの心臓アッセイの主な利点は、間質効果の実装です。この局面は、基底膜3または間質マトリックス4分子からなる非生物ゲルに腫瘍細胞の浸潤に基づいて、in vitroで他の浸潤アッセイよりも完全です。器官培養実験に見られるように、腫瘍細胞と正常な生体宿主組織との間の対立の概念は、いくつかによって導入されましたイギリス6、およびドイツ7のシュライヒでウルフとシュナイダーフランス5で、イースティとイースティ含む作者。引用された方法に比べて、ニワトリの心臓浸潤アッセイの二つの技術的利点は、フラグメントの量を簡単に標準化することができること、およびそれらが器官培養中に機能の完全性の監視を可能に収縮、残っていることです。それらは容易に卵の無菌内容から切除することができるのでさらに、鳥類の胚が好ましいです。アッセイは、腫瘍細胞に周囲の複雑な間質を提供することにより、ニワトリ漿尿膜の膜アッセイ8に概念的な類似性を有しています。
アッセイは、正常にかかる9およびHCT-8（大腸）10細胞株ファミリーMCF-7（乳房）と同様のヒト腫瘍の浸潤性および非浸潤性細胞の変異体を区別するために適用されています。技術は、同様に、潜在的に抗浸潤化合物を試験するのに有用です
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Protocol
別のアッセイ工程の1概観図。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
前培養ハートフラグメントの調製（たPHF）
- 9日間37℃での受精ニワトリ卵をインキュベートします。 （巣月曜日に、例えば ）は、腫瘍細胞凝集体と（木曜日に、例えば ）4日間のPHFのその後の製造を可能にする日付と最後の対立によってこのインキュベーションを完了します。
- 水中の70％（v / v）のエタノールでシェルを駆除。滅菌溶液および材料を用いて、組織培養キャビネット内のすべてのさらなる操作を行います。鈍ピンセットを用いて、胚の極でシェルを開きます。
- HOLによって胚を引き出し鼎除核スプーン（ 図2）と首。リンゲル塩溶液5 mLを含む直径5cmのガラスシャーレに胚を置きます。
- 両手の鋭いピンセットを用いて皮膚を開いてリッピングすることにより腹側胸部皮膚を開き、操作の同じ種類によって胸骨を削除し、その主要な血管を切断する顕微解剖の虹彩切除鋏を用いて心臓を解剖。較正された接眼グリッドを持つマクロスコープの下にあるすべてのさらなる操作を実行します。
摘出スプーンで卵から胚を持ち上げ図2。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
- のガラスシャーレに心を移し5％ウシ胎児血清を含むMEM-レガ3培養培地5mlを含む5cmの直径。顕微解剖虹彩切除術のはさみを使用して、心臓の上部頭蓋第三を切除することによって心房および関連する血管を削除します。鋭いピンセットで心室からの心膜を解剖。
- 顕微解剖虹彩切除術のはさみを使用して、心室における矢状片側切断を行い、優しく鋭いピンセットで振盪することにより血液を除去。
- 5％ウシ胎児血清を含む新鮮なMEM-レガ3培養培地5mlを含む5cmの直径を有する別のガラスペトリ皿に心室を移します。顕微解剖虹彩切除術のはさみを使って、直径約0.4mmの断片に心室をカット。一つの心は約100のフラグメントを得ることができます。
注：一つの心は、約100の断片を得ることができます - 皿の中央に向かってすべての心室の断片を駆動するために静かにペトリ皿を回転させます。 9月によるステンレス鋼針を持つすべてのコーパスのエリーナを削除心室断片からそれらをaratingとペトリ皿の周囲に向かってそれらを駆動します。
- （MEM-レガ3 + 10％v / vのウシ胎児血清）2培地mlの3を含有する50ミリリットルの三角フラスコにガラスパスツールピペットを用いて心臓断片を移します。
注：正確な中量は、個々のフラスコの可変底凸部に依存します。その底部中央には、液体のみの薄い膜で覆われるべきです。 - ストッパーを介して空気中に5％CO 2の混合物を用いてフラスコ（複数可）ガス、及び24時間、70回転/分（rpm）で37℃でgyrotoryシェーカー上のフラスコ（複数可）をインキュベートします。この懸濁培養工程のための理論的根拠は、腫瘍細胞の凝集物とのその後の対決のために適した球状心臓組織片を得ることです。
- ペトリ皿に心フラグメントおよびそれらの培養培地を転送します。針付きコーパスのエリーナ、壊死（暗い）フラグメント、および心臓断片のコングロマリットを捨てます。
- さらに60時間、ステップ1.9に記載のように培養液を6mlを含有する別の50ミリリットルの三角フラスコに残っている心臓断片をインキュベート。
注：このインキュベーション期間中に、断片が球状になるであろう。彼らは、筋芽細胞のコアと周囲の線維芽細胞の薄い層で構成されています。 - 線維芽細胞の薄い、均質層（半透明のカプセルを形成する）と、マクロスコープや針を用いて0.4mmの直径を示す回転楕円体の断片を選択します。一ニワトリの心臓は、約20の適切なのPHFが得られます。これらのPHFを移し、その多くは、新鮮な培地を含む別のペトリ皿に、37℃でリズミカルに収縮します。これらのPHFは、試験細胞との対決の準備ができています。
球状試験細胞集合体の調製と対決
- 半固形寒天培地を準備します。3回煮沸することによりリンガー塩溶液15mlに、寒天100mgを溶解させます。クール40°Cまでのサスペンションとリンガー塩溶液/卵白の7.5ミリリットルを追加します（1：1）および7.5ミリリットルのウシ胎児血清。
- 50ミリリットルの三角フラスコに、適切な培養培地中に1×10 5個の試験細胞/ mlを含有する懸濁液を6mlを調製します。対向培養開始が計画される前に、この3日間行います。 3日間70 rpmで37℃でgyrotoryシェーカーでフラスコをインキュベートします。使用される培地の種類に応じて、空気中5％または10％（v / v）のCO 2の混合物をフラスコにガス。
- 較正された接眼グリッドを搭載したマクロスコープの下で凝集体を表示します。外径0.2mmの球状細胞凝集体（針で）を選択します。
- 半固形寒天培地13を含む発生学的時計ガラスに培養液の最小量の8選択されたPHF（直径= 0.4 mm）を転送するためにパスツールピペットを使用してください。円を形成するために針で個々のPHFを移動します。吸引し、過剰な培地濾紙の小片を用いて（ 図3参照 ）。
のPHFの周りの余分な水分の図3.吸引 。八のPHFは発生学的時計皿で半固体寒天上に配置され、そして過剰な流体は、小さな三角形のピースオペアンプ濾紙で除去します。矢印は8個々のPHFを示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
- パスツールピペットを用いて円形に10選択された回転楕円体の細胞凝集体（直径= 0.2 mm）を持参してください。過剰な培地を吸引します。彼らはお互いに接触するまで、針でPHFのそれぞれに向けて1つの集約を移動します。濾紙の小片を用いて吸引し、過剰な媒体。
- パラフィンしたウォッチガラスの蓋を密封し、incuのPHFへの試験細胞の接着特性に応じて、24時間、4 - 37℃でお譲り。
- 予め温めた（37℃）培地で対向対を浸し、そして培地1.5 mlを含有する5ミリリットルの三角フラスコにパスツールピペットを用いて、各個々の組を転送します。
- 120回転数に調整し、37℃でgyrotoryシェーカー上のフラスコをインキュベートします。テストセル（ 図4参照）に使用される培地の種類に応じて、空気中の5％または10％（v / v）のCO 2とのフラスコガス。
- メディアの集中を避けるために、リンゲル塩溶液2mlで充填された2つの補助的な5ミリリットル三角フラスコに通して気体を湿ら。 8日毎に培地を更新します。
gyrotory SHAKの上に4小さな三角フラスコ図。ER培地1.5 mlのフラスコ中にガスを備えたシリコーン栓で密封されている-と出口針、37℃で120rpmで移動します。ガスは、（3,4）、分散個々の対向ペアと培地を含む小さなフラスコにさらに滅菌リンゲル塩溶液で満たされた大きな三角フラスコ（2）への入口チューブ（1）によって導かれ、（5および6）。最後に、使用済みのガスは、滅菌水トラップを大きなフラスコに回収された（7）、それが空気中に逃げることができ、そこから（8）。図は、自家製のプラットフォームプレートの上に培養電池の二組を示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
直面文化の3組織学
- ブアン·オランドの固定液を準備します。
- 単一蒸留水100mlに酢酸銅（中性）を2.5gを溶解しゆっくりとピクリン酸の4.0グラムを追加します。
- 紙フィルターを通して溶液を濾過します。ホルマリン10ml及び1mlの酢酸を追加します。単蒸留水で飽和塩化水銀溶液の1部をこの溶液9部を混合します。
注意：この解決策は、いくつかの有害物質が含まれています。ホルマリンは、皮膚に接触、吸入による毒性であり、飲み込みます。酢酸は、摂取後、口や腸管に対する腐食性があります。ピクリン酸は、ときに急速に加熱やパーカッションによるアレルギー性および爆発性です。塩化第二水銀は、粘膜とnefrotoxicに非常に腐食性です。ブアン·オランドの溶液を調製するための防護服と手袋を着用し、火から離れた換気の良い場所でそれを処理します。代替の固定手順をリン酸緩衝生理食塩水中の4％ホルムアルデヒドに基づいています。
- 次のようにインキュベーションの数日または数週間後に、個々の文化を修正しました。まず、リンゲル塩に文化を転送血清タンパク質を除去するために、数秒のためのソリューション。次に、約2時間、3ミリリットルブアン·オランドの固定溶液を含む直径3cmのでペトリ皿に浸します。
- できるだけ固定液を除去するために、2時間、水中でそれらをインキュベートする前に、培養物に水を脱イオン3ml中三回洗浄します。最後に、水中の70％（v / v）エタノール3 mlに移します。この溶液にO / Nで培養物を維持し、これは数日間延長することができます。
- 2時間ごとに96％の水（v / v）エタノール、100％エタノール、100％イソプロパノール、100％キシレン100mlを含有するジャーを順番に転送することにより脱水。
- （キシレンの最小量の）独立したカバーガラスに各培養を移し、パラフィン包埋のためのワインボトルカプセルの底にカバースリップを置き、56℃で液状のパラフィンワックスと固定材料をカバーしています。 24時間56℃でインキュベートし、次いでRTに埋め込まれた材料を冷却します。
注意：ベンゼン誘導体キシレンとしては、吸入後に毒性であり得るだけで換気の良い区域で処理する必要があります。
- （キシレンの最小量の）独立したカバーガラスに各培養を移し、パラフィン包埋のためのワインボトルカプセルの底にカバースリップを置き、56℃で液状のパラフィンワックスと固定材料をカバーしています。 24時間56℃でインキュベートし、次いでRTに埋め込まれた材料を冷却します。
- ワインボトルカプセルとカバーガラスを外し、固定された文化が含まれているパラフィンブロックを切り出します。
- ミクロトーム14を使用して、全体の対向対の厚さ8μmのパラフィン切片を作成し、粘着剤などの組織接着剤溶液で前処理されている3交流顕微鏡ガラススライド上のすべてのセクションを収集します。それは免疫染色を阻害するおそれがありますので、粘着剤としての卵白を避けます。
注：顕微鏡用ガラススライドの前処理は、組織接着剤溶液の1小滴とパスツールピペットで脱イオン水の3小滴を送達し、スライドをカバーするためにそれらを混合することによって行われます。 - 10分間、100ミリリットル、100％のキシレンを含むジャーに二回浸漬することにより、最初のスライドからパラフィンを除去します。
- に10秒間浸漬することにより、スライドを再水和キシレン/エタノール（1：1）水に、100％エタノール、96％（v / v）エタノール、70％水（v / v）のエタノール、そして最後に脱イオン水以下の溶液100mlを含有する瓶。
- 2分間の水中で96％（v / v）エタノール中のヨウ素（w / v）の0.5％100mlを含有する瓶に浸漬することにより塩化水銀結晶を溶解します。
- 10秒間水にチオ硫酸ナトリウム（w / v）の5％の100ミリリットルを含むジャーにセクションをクリアします。その後、蒸留水で十分にスライドを洗浄します。
- 、2分間100ミリリットルハリスヘマトキシリンを含むジャーにスライドをインキュベートする、0.1MのHClで簡単に水没し、その後10分間水道水の流水で洗います。
- 1分間の水（w / v）の0.1％エオシン100ミリリットルを含むジャーにインキュベートします。
- 、100％エタノールで二回脱イオン水、70％（v / v）エタノール、96％（v / v）エタノール、キシレン - エタノール：ソリューション次の一連の100mlを含有するジャーに簡単な浸漬を介して脱水（1：1） 、最後に100％キシレン。
- マウントスライド上にメディアの2つの別個の滴を提供することにより、メディアをマウントするとスライドが、これらは、それらの上にカバースリップを置くことによって展開し、それが24時間室温で硬化させてみましょう。
4.免疫組織化学
- トリス緩衝食塩水（TBS）を準備します。トリス - （ヒドロキシメチル） - アミノメタン（トリス塩基）6.0gの脱イオン水4.5 L中のNaClの45.0グラムを溶解します。 1MのHCl（約42 ml）でpHを7.6に持参してください。 5 L.を作るために蒸留水を追加します。
- Tris-HCl緩衝液を準備します。脱イオン水800mlにトリス塩基60gを溶解します。 6 M塩酸（約65 ml）でpHを7.6に持参してください。使用前に蒸留水で1リットル希釈10倍を作るために蒸留水を追加します。
- トリス-BSA 0.1％のバッファを準備します。トリス塩基12.1gの脱イオン水4.5 L中のNaClの45.0グラムを溶解します。 1MのHCl（約42 ml）でpHを8.2に持参してください。ウシ血清アルブミン（BSA）およびNaN 3を6.5gの5.0gの追加。 5 L.を作るために、脱塩水を追加
注意：アジ化ナトリウムは非常にあります毒性産物。酸と接触すると非常に有毒なガスを放出します。手袋を着用し、すべての手段により摂取を避けます。 NaN 3を形銅、鉛および他の金属との非常に敏感な爆発性化合物。多量の水と同一平面シンク。代替防腐剤は、0.01％のチオメルサールです。 - 商品を3.10に3.2に従ってください。
- TBS、トリス - 0.1％BSA緩衝液でスライドを浸して、紙タオルを使用して、セクションの周りに余分な水分を拭き取ってください。
- 共同のためでBSA（w / v）のトリス、0.1％TBSまたは5％の高湿度チャンバー内で30分間、BSA緩衝液（w / v）の（密閉箱希釈150μlの正常ヤギ血清1:20適用内部の高湿度を確保オープンウォーターレシピエントとスライドの-incubation）。その後、ペーパータオルで余分な水分を除去します。
- 高湿度チャンバ内に少なくとも2時間、1％（v / v）の正常ヤギ血清を補充したトリス、0.1％（w / v）のBSA中に希釈した150μlの一次抗血清を適用します。一次抗血清の最適希釈を決定empiri的。
注：免疫組織化学は、ニワトリの心臓抗原を検出するために使用することができるが、特異的な抗体を用いて、ニワトリの心臓抗原に記載の技術は、同様に（例えば、緑色蛍光タンパク質など）、他の抗原15に適用することができます。 - 5〜10分間ロッキングテーブル上BSA w / vのトリス、0.1％で二回スライドを洗浄します。
- ペーパータオルを使用して、余分な水分を除去し、過剰に150μlのヤギ抗ウサギ抗血清を適用する（ 例えば 、TBS中1:20）高湿度チャンバー内に少なくとも1時間。
- 5〜10分間ロッキングテーブル上にTBSで二回洗浄します。
- ペーパータオルを使用して、過剰な液体を除去します。高湿度チャンバ内で、少なくとも1時間、1％（v / v）の正常ヤギ血清を補充したTBSで250：1に希釈したペルオキシダーゼ - 抗ペルオキシダーゼ複合体を適用します。複合体の希釈はバッチに依存します。
- TBSでスライドを洗浄し、トリス塩酸緩衝液pH 7.6に移します。
- トリスにスライドを移し数分間、0.25gのジアミノベンジジン/ Lおよび0.01％（v / v）のH 2 O 2を含有する塩酸緩衝液。ニワトリ心臓が染色されたときに、インキュベーションを停止します。顕微鏡下で定期的に確認してください。
- 蒸留水に、10分間のTris-HClにスライドを移し、。
- アイテム3.13および3.14に従ってください。
注：簡単に固定時に破壊される抗原のために、培養物の凍結切片を免疫組織化学的分析のための代替を提供することができます。これは、次のプロトコルステップで説明します。 - 血清タンパク質を除去するためにリンゲル塩溶液3mlでの生活文化を洗ってください。
- クライオミクロトームの予冷（-16℃）試料ホルダーにメディアを埋め込む一滴を追加します。それが完全に凍結される前に、このドロップの上部にカバーガラスの端から培養組織を転送します。
- 、-16℃に文化を冷却厚さ6μm凍結切片を切断し、ゼラチンコーティングした上でそれらを収集ガラススライド。
- 4℃での保存前の10分間、4℃のアセトン中でスライドを修正しました。
- 商品を4.15〜4.5に従ってください。
検定結果の5評価
注：本アッセイでは、侵入が対向試験細胞によるPHFの進行職業として定義されています。対峙培養からのすべての連続切片の顕微鏡分析は、試験細胞集合体と三次元でのPHFとの間の相互作用の再構成を可能にします。
- 相互作用して、次の規模に応じてグレードの異なるパターンを観察します（ 図5を参照）。
グレード0：だけPHF観察しました。いいえ対峙細胞が観察されないことができます。
グレードI：直面する試験細胞はPHFに取り付けられているが、いなくても、最も外側の線維芽細胞層、心臓組織を占有しません。
グレード第IIa：PHFの職業は、外側の線維芽細胞様および筋芽細胞CEに限定されていますLL層。
グレードのIIb：PHFは、細胞凝集体を包囲しましたが、占領の兆候はありません。
グレードIII：直面している細胞はPHFを占領しましたが、無傷の心臓組織の元の量の半分以上残っています。
グレードIV：対峙細胞はPHFの元の体積の半分以上を占めています。
注：IとIIは、非侵襲的な細胞集団で観察されたグレードを、グレードIII及びIVは、侵入の典型的なされています。異なる時間枠内での進行を評価するために、組織学的分析は、異なるインキュベーション期間の後、固定培地に直面に適用されるべきです。
対向する癌細胞とのPHFとの間の相互作用の5例図 。文化が直面しているの組織切片は、ヘマトキシリン - エオシン（左パネル）またはimmunohistochemicallいずれか染色しましたニワトリの心臓（右パネル）に対する抗体を用いたY。インタラクショングレードは、プロトコルのテキストで定義されています。 （H：心臓組織、T：腫瘍細胞）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
薬品による治療後6毒性評価
- パスツールピペットで24ウェル組織培養マルチディッシュに最小限の量の対峙培養を転送します。
- 薬物を含まない培地500μlのを追加することにより、培養液を洗浄し、6時間後にリフレッシュします。
- 倒立顕微鏡（対物レンズ40倍）を使用して外植片からの細胞伸長のために毎日全てのウェルを検査します。直面している文化の生存の指標を得るために外植文化の総数で文化を外部増殖の数を割ります。溶剤で処理したもので、薬物処理培養の結果を比較します。
注：セルprolifためのKi67の免疫組織化学の使用を（eration）およびアポトーシスのためのTUNELアッセイ（）のは、毒性を評価するための外植片アッセイと相補的技術として提案されています。
直面文化の7成長評価
- デジタルphotocamera（対物レンズ50倍）を備えた顕微鏡を使用して、単に固定する前に、培養物の白黒写真を作ります
- mm単位で考慮に倍率を取る文化の（a）の大小（b）の直径を測定します。
- 式16を介してミリ3におおよその体積（V）を計算します
- V = 0.4 xaxb 2
- 対立の開始時にPHFおよび細胞凝集体を合わせた容量で、この最終容量を比較することによって、培養物の増殖を計算します。
注：孤立のPHFは培養中にその体積を減少させる傾向があるので、対向する対の成長は、腫瘍細胞に依存します。
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Representative Results
図5に示すように、組織切片は、成功した多数のアッセイの最終結果を示しています。培養物の組織学的音、生細胞を示し、腫瘍細胞と正常組織との間の相互作用を解析することを可能にします。さらに、正常組織からの免疫反応は、免疫拒絶システムが開発される前に、例えば、使用されるニワトリ胚の正確な年齢を確認する、観察することができません。培養期間中（グロス）の汚染がないことを示している目に見える細菌は、ありません。最後のセクションの丸みを帯びた周囲は三角フラスコの壁に（一時的な）接着性の兆候なしに懸濁液中で培養を確認します。
多くの化合物は、このアッセイで試験されています。薬物は、一般に対向PHF /腫瘍集合対が小さな三角フラスコ（ステップ2.7）に転送される時点で培地に供給されます。いくつかは、で知られている（ツールとして使用されましたhibitorsおよび活性化）は、腫瘍の浸潤の過程に関与する経路およびエフェクター分子を解明します。構造的に関連した他の化合物については、定量的構造活性相関（QSAR）は、ニワトリの心臓浸潤アッセイの結果に基づいて設立されました。そのため、関連ポリフェノールための計算記述子の数は、アッセイにおけるそれらの抗浸潤活性の予測を可能にするために使用されました。 15年間にわたって139の異なる類似体は、アッセイにおけるそれらの可能な抗浸潤効果について試験し、その活動は、4つのクラスに分類しました。トレーニングと93は、それぞれ、これらのポリフェノールの46で構成される検証セットをランダムに選択しました。 QSAR人工ニューラルネットワークによって検証セットの結果が予測され、実験的抗浸潤活性17（ 図6参照）との間に明確な相関を示しました。
データは、目の堅牢性を示します電子ニワトリ心臓浸潤アッセイ、予測結果と実験結果との相関関係は、15年にわたって有効であり、異なるポリフェノールとの最近の（未発表）予測調査で確認されたからです。 図6に示す混同行列は、弱さとグラフィカルアッセイの強さをまとめたものです。それは精度と再現性の大まかな表現を提供します。このグラフの解釈は、アカウントに器官培養を生きた生物学的変動、および浸潤結果の半定量的なスコアを取る必要があります。
ニワトリの心臓浸潤アッセイにおける小分子の活性の予測QSARモデル（人工ニューラルネットワーク）の図6.外部検証 。このモデルの出力は、化合物の抗浸潤活性クラスです。このような4つのクラスが定義されている、のreprCHIアッセイにおける分子は、抗浸潤活性を発揮する最低濃度（ すなわち、侵入グレードIまたはII）をesenting：クラス4（1μMまでアクティブ）、クラス3（10μM）、クラス2（100μM）クラス1（100μMという高濃度でない抗浸潤活性）。図示の混同行列を予測し、実験的に検証セットの化合物の抗浸潤活性のクラスを決定し比較します。検証セットは、46の化合物を含んで、トレーニングは93モデル予測は、単に分子構造から計算記述子に基づいており、したがって、仮想的な化合物を得ることができるセット。このように、合成努力がインシリコ活動に有望で分子に焦点を合わせることができる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
たPHFの準備中に、断片は懸濁液中に滞在しないかもしれないが、血管壁に付着します。これは、培養培地の体積を増加させることによって克服することができます。たPHFの数が少なすぎるとそのサイズが大きすぎる場合には、培地の容積を減少させます。集約する試験細胞の障害は、温度または微生物感染に対する変動に起因する可能性があります。あるいは、集約することができないことは、細胞の本質的な特性であってもよいです。 PHFへの凝集体の取り付けの際、接着不良は、半固体寒天培地の上またはろ紙の吸収により培養物の周りに複数の液体培地を除去することにより、インキュベーション時間を延長することによって克服することができます。この場合の微生物汚染についても確認してください。切片中の困難がパラフィンブロックの崩壊に起因する可能性があります。ブロックの保存期間が（再びパラフィンを融解）が長すぎるされている場合に発生します。アートをセクショニングするとifactsは、ミクロトームナイフの整合性を発生し、固定された培養物中のコーパスのエリーナの不在をチェックする必要があります。培養物中の壊死領域が悪く、培養条件の兆候です。これらの領域は、文化の中心に制限されている場合は、1が大きすぎる対立の音量を疑うべきです。 PHFおよび細胞凝集体の体積の適切な選択は確かに重要な要因です。不適切なpH制御、微生物汚染や固定アーティファクトに向かっしかし、より一般的な壊死ポイント。セクションでは、あまりにも暗く見えるとき最後に、ヘマトキシリンで浸漬時間が長すぎる可能性があります、またはセクションでは、（> 8μm）の厚すぎる場合があります。
ニワトリの心臓アッセイの多くの変形が侵入試験で正常に適用されてきました。これらの変化は、宿主組織、対向試験細胞の提示、及びインキュベーション条件の起源に関する。種からのハート断片ひよこ18以外の、そのような肝臓19、20肺、および脳21のような組織からは、検討されています。代わりに凝集体、生検標本22単層断片23、および細胞懸濁液は、器官培養におけるPHFに直面するために使用されています。懸濁培養は、しばしば半固体基板24の上に静的培養によって置換され、そして無血清対立セル25の特定のタイプの実行可能なことが示されています。一般的に、相互作用がしかし、コンピュータ支援自動画像解析システムも27,28を開発されている半定量的スケール26に従って説明します。後者の目的は、腫瘍細胞の浸潤の程度に関する定量的情報を提供します。
ニワトリの心臓アッセイが生きている宿主組織を含むように、セットアップは、 生体内での状況を再現しようとする、と明らかにOと比較していくつかの関連性がありますin vitroでの THERシステム（導入部を参照してください）。しかし、このアッセイは、天然の腫瘍、例えば、免疫学的因子が癌細胞の浸潤性挙動に影響を与えることができる環境に存在microecosystemのすべての要素を包含することができないことを認識すべきです。少なくとも一つの研究では、アッセイにおけるそのような要因が存在しないことは、ニワトリの心臓アッセイ29の結果と動物モデル30のものとの間に矛盾する結果につながっています。
将来のアプリケーションは、アッセイにおける心筋前駆細胞の研究になります。これらの細胞は、心臓病患者の梗塞ゾーンに治療的に注入することができるが、それらは心筋に統合することができる必要があります。ニワトリ心臓アッセイにおいて前駆細胞は、ニワトリの心臓断片に直面され、それらの遊走および分化を分析します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
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