Pintainho Coração Invasion Ensaio para testar a invasão das células neoplásicas e da Actividade de compostos potencialmente anti-invasivos
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a invasão das células tumorais em fragmentos de tecido normal vivendo em três dimensões. Esta técnica de cultura de órgãos é aplicada principalmente para testar drogas potencialmente anti-invasivos in vitro.
Abstract
O objectivo do ensaio de coração de galinha é oferecer um método de cultura de órgão relevante para estudar a invasão do tumor em três dimensões. O ensaio consegue distinguir entre as células invasivas e não invasivas, e permite estudo dos efeitos dos compostos de teste na invasão tumoral. As células cancerosas – quer como agregados ou células individuais – são confrontados com fragmentos de coração de galinha embrionário. Após cultura de órgãos em suspensão durante alguns dias ou semanas que confrontam as culturas são fixadas e incluídas em parafina para análise histológica. A interacção tridimensional entre as células cancerosas e o tecido normal é então reconstruído a partir de cortes seriados corados com hematoxilina-eosina ou após coloração imuno-histoquímica para epitopos no tecido cardíaco ou as células cancerosas que confrontam. O ensaio é consistente com o conceito recente que a invasão do câncer é o resultado de interações moleculares entre as células cancerosas e seus elementos hospedeiros do estroma vizinho (miofibroblastos, endothElial células, componentes da matriz extracelular, etc.). Aqui, neste ambiente estromal é oferecido para as células cancerosas como um fragmento de tecido vivo. Aspectos de apoio para a relevância do ensaio são múltiplas. Invasão no ensaio está de acordo com os critérios de invasão do câncer: ocupação progressiva e substituição no tempo e no espaço do tecido hospedeiro, e capacidade de invasão e não-invasivo in vivo das células que confrontam geralmente se correlaciona com o resultado do ensaio. Além disso, o padrão de invasão de células in vivo, tal como definido por patologistas, reflecte-se nas imagens histológicas no ensaio. A análise quantitativa relação estrutura-actividade (QSAR) dos resultados obtidos com vários compostos orgânicos congéneres potencialmente anti-invasivos permitiu o estudo das relações estrutura-actividade de flavonóides e calconas, e conhecidas drogas anti-metastáticos utilizados na clínica (por exemplo, inibidores de microtúbulos ) inibir a invasão no ensaio bem. However, o ensaio não leva em conta as contribuições imunológicas a invasão câncer.
Introduction
Invasão é a marca de tumores malignos. Esta actividade não só conduz à destruição dos tecidos circundantes, mas também está implicada na formação de metástases. Uma vez que doentes com cancro morrem de invasão e metástase, e tratamentos anti-invasivos eficientes são ainda escassos, ensaios de laboratório que simulam a invasão de células tumorais têm sido desenvolvidos. O objectivo do ensaio de coração de galinha é oferecer um método de cultura de órgão relevante para estudar a invasão do tumor em três dimensões. O ensaio consegue distinguir entre as células invasivas e não invasivas, e permite estudar os efeitos dos compostos de teste na invasão tumoral.
A lógica por trás da utilização do ensaio é o próprio conceito de que os tumores são ecossistemas em que as células neoplásicas interagem de forma contínua com o seu estroma (células hospedeiras e de matriz extracelular), e que por elas invasão interacções moleculares é uma sintonia fina. Assim, no ensaio de células de tumor são confrontados com livifragmentos ng embrionárias coração pintainho 2, que servem não só como substrato para a invasão de células tumorais, mas também como uma fonte de diferentes tipos de células do estroma e de elementos de matriz. O coração de galinha contém os miócitos, os fibroblastos e as células endoteliais, e a matriz extracelular é composta de laminina, fibronectina e diferentes tipos de colagénio. Desta forma, a técnica de cultura de órgãos tridimensional abrange muitas interacções celulares e moleculares envolvidas na invasão de tumores de doentes.
A principal vantagem do ensaio de coração de galinha é a implementação de efeitos estromais. Este aspecto é mais completa do que em outros ensaios de invasão in vitro que se baseiam na invasão de células tumorais em géis não vivos compostos de membrana basal 3 ou 4 moléculas de matriz intersticial. O conceito de confronto entre as células tumorais eo tecido hospedeiro vivo normal, como encontrados em experiências de cultura de órgãos foi apresentado por váriosautores incluindo Wolff e Schneider em França 5, Easty e Easty no Reino Unido 6 e 7 Schleich na Alemanha. Duas vantagens técnicas do ensaio de invasão coração pintainho em relação aos métodos citados é que o volume dos fragmentos podem ser facilmente padronizados, e que eles permanecem contráctil, o que permite a monitorização da integridade funcional durante a cultura de órgãos. Além disso, são preferidos os embriões de aves, porque eles podem ser facilmente dissecado a partir do conteúdo do ovo esterilizada. O ensaio tem semelhança conceptual para o ensaio de membrana pintainho chorioallantois 8, oferecendo um complexo do estroma circundante para as células tumorais.
O ensaio tem sido aplicado com sucesso para distinguir entre variantes de células invasivas e não invasivas dos mesmos tumores humanos, tais como na MCF-7 (mamária) 9 e HCT-8 (do cólon) 10 famílias de linhas celulares. A técnica é útil para testar compostos potencialmente anti-invasivas bem <sup> 11,12. Como explicado mais adiante, que pode ser usado para o estabelecimento de relações de moléculas orgânicas pequenas estrutura-actividade. O ensaio, no entanto, não levam em conta a contribuição de células imunológicas a invasão câncer. Deve ser salientado que a técnica não pode ser considerada como um sistema de análise de alto rendimento, por causa do elevado número de manipulações, o número limitado de passos do ensaio (máximo de 30 culturas) e o tempo de rotação (cerca de 1 mês).
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante a preparação de PHF, os fragmentos não pode ficar em suspensão, mas aderir à parede do vaso; isso pode ser superado através do aumento do volume do meio de cultura. Se o número de PHF é muito baixo e o seu tamanho é muito grande, diminuir o volume do meio de cultura. A falha das células de teste para agregar pode ser devido a flutuações na temperatura ou a infecção microbiana. Alternativamente, uma incapacidade de agregado pode ser uma característica intrínseca das células. Durante a fixação d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Marleen De Meulemeester for demonstrating the assay technique in the video film. B. I. R. is a Postdoctoral Research Fellow of the Research Foundation – Flanders (FWO – Vlaanderen). L.M.M. is a recipient of an Emmanuel van der Schueren grant from the Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).
Materials
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
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