Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
غدية الأقنية البنكرياس (PDAC) يحتوي على مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية السرطانية مكون للأورام حصرا (الخلايا الجذعية السرطانية) والتي ثبت لدفع بدء الورم، ورم خبيث ومقاومة الاشعاعي والكيماوي. نحن هنا وصف منهجية محددة لزراعة الخلايا الجذعية السرطانية في البنكرياس الإنسان الأساسية في شكل كرات الورم في ظروف مرسى مستقل. تزرع الخلايا في المصل خالية، وظروف غير ملتصقة من أجل إثراء لالخلايا الجذعية السرطانية في حين ذريتهم أكثر متباينة لا البقاء على قيد الحياة وتتكاثر خلال المرحلة الأولى بعد زرع البذور من خلايا مفردة. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لتقدير نسبة الخلايا الجذعية السرطانية موجودة في عدد السكان من الخلايا السرطانية. سواء من حيث الحجم (التي يمكن أن تتراوح 35-250 ميكرومتر) وعدد من المجالات الورم شكلت يمثل النشاط CSC آوى في أي من السكان الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية مثقف أو المقطوع حديثا وهضمها الأورام 1،2. باستخدام هذا الاختبار، وجدنا مؤخرا أن الميتفورمين ablates انتقائي pancreatالخلايا الجذعية السرطانية جيم؛ وهو الاكتشاف الذي تم تؤكده أيضا في وقت لاحق من خلال إظهار التعبير تقلص من الجينات / علامات سطح المرتبطة تعدد القدرات وانخفاض في tumorigenicity المجراة من الخلايا المعالجة الميتفورمين. كخطوة أخيرة للتنمية قبل السريرية كنا نعامل والفئران الحاملة الأورام التي أقيمت مع الميتفورمين وجدت لفترات طويلة بشكل ملحوظ البقاء على قيد الحياة. تجري حاليا الدراسات السريرية اختبار استخدام الميتفورمين في المرضى الذين يعانون من PDAC (على سبيل المثال، NCT01210911، NCT01167738، وNCT01488552). ميكانيكيا، وجدنا أن الميتفورمين يؤدي الى أزمة الطاقة القاتلة في الخلايا الجذعية السرطانية من خلال تعزيز أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) الإنتاج والحد من إمكانات عبر الغشاء الميتوكوندريا. في المقابل، لم يكن القضاء عليها غير الخلايا الجذعية السرطانية عن طريق العلاج الميتفورمين، وإنما خضع عكسها اعتقال دورة الخلية. ولذلك، يخدم دراستنا كمثال ناجح للإمكانات تشكيل المجال في المختبر كأداة فحص لتحديد المركبات التي يحتمل استهداف CSCالصورة، ولكن هذه التقنية تحتاج إلى مزيد من في المختبر، والتحقق من صحة الجسم الحي للقضاء على الاكتشافات كاذبة.
البنكرياس غدية الأقنية (PDAC) هي واحدة من الأورام الصلبة الأكثر عدوانية. اليوم هو الأكثر شيوعا وفاة 4 تشرين المرتبطة بالسرطان في المجتمع الغربي، ويتوقع أن ترتفع إلى سبب 2 الثانية الأكثر شيوعا خلال العقد المقبل (~ 400،000 حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم) 3. وفي وقت التشخيص 90٪ من المرضى الحالي مع متقدمة من المرض، والتي لديها البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات أقل من 5٪. وظل هذا المعدل بقاء مخيب للآمال لم يتغير في السنوات ال 50 الماضية على الرغم من الأنشطة البحثية المكثفة على نحو متزايد 4. من 10٪ المتبقية من المرضى الذين لديهم مرض يحتمل "قابل للشفاء من خلال الاستئصال الجراحي، و80٪ يموتون من تكرار في غضون 5 سنوات. لسنوات عديدة كان مستوى الرعاية لمرض متقدمة حيد جيمسيتابين، ولكن هذا يمنح فقط البقاء على قيد الحياة ميزة هامشية 5. التحسينات الصغيرة في البقاء على قيد الحياة على المدى القصير قد تحققت من خلال إضافةمن erlotinib 6 أو 7 capecitabine، إلا أن فائدة البقاء على قيد الحياة هي في ترتيب أسابيع مع بقاء الكلي متوسط تزال ~ 6 أشهر. في الآونة الأخيرة، ظهرت نتائج مشجعة لجيمسيتابين / NAB -paclitaxel 8 والجمع FOLFIRINOX نظام 9،10. هذه العلاجات تحسن متوسط بقاء بنسبة متواضعة 2 و 4 أشهر على التوالي، ولكنها شديدة السمية والناجين على المدى الطويل لا تزال استثناء نادر. على الرغم من أن العلاج يوفر إمكانية للتحسين، وهذه هي الأنظمة السامة التي كثير من المرضى لا تستجيب أو تظهر فقط تحسن تدريجي في البقاء على قيد الحياة. ونتيجة لذلك، هناك حاجة ملحة لاستكمال العلاجات الحالية ووضع الرواية، وأساليب علاجية متعددة الوسائط على الأرجح.
ورم التجانس
لقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن عدم التجانس السرطان لا تقتصر فقط على متميز التطوري subclones داخلهان كل ورم 11، ولكن مدفوعة أيضا المظهري وعدم التجانس الوظيفي والمرونة داخل كل subclone 12. ما يسمى الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) أو الخلايا محفز للأورام هي المسؤولة عن عدم التجانس intraclonal 13-16. على وجه التحديد، الخلايا الجذعية السرطانية تمثل مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية، ونحن وغيرهم وقد وفرت أدلة قاطعة، وصولا الى خلية واحدة، وأنها تمثل جذور المرض مما أدى لجميع السلالات المتباينة داخل كل subclone السرطان 17. الأهم من ذلك، هذه الخلايا ضرورية لالسلوك المنتشر وتمثل أيضا مصدرا هاما للانتكاس المرض بعد العلاج، وحتى مع الأدوية الفعالة نسبيا قادرة على إحداث الانحدار الورم الأولي (على سبيل المثال، -paclitaxel NAB) 15،18-20. من المهم أن نلاحظ أن الخلايا الجذعية السرطانية لا تمثل بالضرورة بحسن نية الخلايا الجذعية، كما أنها لا تنشأ من خلايا جذعية الأنسجة في كثير من الحالات، وإنما لديهم ACQuired ميزات معينة للخلايا الجذعية. وتعرف معظم هذه ظيفيا، ليتم تجهيز سبيل المثال الخلايا الجذعية السرطانية مع غير محددة قدرة التجديد الذاتي مما يجعلها مقاومة للعلاج الكيميائي التقليدي، وتظهر زيادة الغزو الذي يعزز النشاط النقيلي.
وظيفية الجذعية للسرطان الظواهر الخلية
ويستند هذا النمط الظاهري وظيفية الخلايا الجذعية السرطانية على قدرتها على تجديد الذات، والتي يمكن اختبارها في المختبر باستخدام تشكيل المجال المسلسل والمقايسات تشكيل مستعمرة على التوالي. والأهم من ذلك الخلايا الجذعية السرطانية قادرة على التجديد الذاتي الدب في tumorigenicity الجسم الحي والتي يمكن اختبارها عن طريق الحد من التخفيف في المقايسات فيفو كما قراءات وظيفية في نهاية المطاف، ويفضل خلال زرع المسلسل يدل على حصرية tumorigenicity على المدى الطويل. وعلاوة على ذلك، هناك عدم التجانس داخل مقصورة CSC، مع جزء من السكان متميزة الخلايا الجذعية السرطانية التي تحمل القدرة الحصرية لتثير الانبثاث التي ليست مجردنتيجة مباشرة لالخالصة في tumorigenicity الجسم الحي. في الواقع، الخلايا الجذعية السرطانية metastastitic اكتساب القدرة على التهرب من الورم الرئيسي، البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف anoikis ونقل من والبذور المواقع الثانوية. ويمكن اختبار هذه القدرات الوظيفية المتقدمة في المختبر باستخدام المقايسات الغزو المعدلة والحية باستخدام فحوصات ورم خبيث.
استهداف الخلايا الجذعية للسرطان
نحن وغيرنا قد قدم أدلة مقنعة على أن العلاجات تركز على الورم الجزء الأكبر من الخلايا PDAC متباينة، حتى في تركيبة مع وكلاء استهداف سدى، لا يكون لها تأثير كبير على تطور الورم ونتيجة لاحقة ما لم جنبا إلى جنب مع استراتيجية CSC استهداف 21، 22. وهكذا، استنادا إلى المهام الحاسمة الخلايا الجذعية السرطانية في تطور المرض ومقاومة للعلاج، ينبغي لهذه الخلايا يعني عنصر أساسي لأي نهج العلاج رواية 18،20، ولكن سوف يتطلب فهم أشمل من ذلك بكثير سو آلية تنظيمية الخلايا الجذعية السرطانية. على الرغم من أن الخلايا الجذعية السرطانية وذريتهم أكثر متباينة تتحمل متطابقة دول الأرض الوراثية فيما يتعلق تغيرات جينية، الخلايا الجذعية السرطانية تظهر ملامح متميزة، وبالتالي العزم epigenetically التعبير الجيني أن حصة وحدات مع الخلايا الجذعية المحفزة. وليس فقط تم ربط معظم الجينات المسؤولة عن توليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (NANOG، Oct3 / 4، Klf4، Sox2) إلى السرطان، ولكن يقتصر التعبير عنها في الغالب إلى المقصورة الخلايا الجذعية السرطانية. وعلاوة على ذلك، فقد أنشأت الآن أهمية وظيفية الخلايا الجذعية السرطانية التي كتبها الخسارة من وظيفة التجارب باستخدام الأدوات الوراثية لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية بحزم مفهوم CSC لعدة أنواع السرطان 23-25. في حين أن معظم هذه الطرق تعتمد على نماذج الماوس، وبالتالي غير قابلة للتحويل إلى العيادة بسهولة، وأنها لا توفر إثبات صحة مفهوم لأهميتها السريرية المحتملة لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية في تركيبة مع الخلايا السرطانية بكميات كبيرة.
دراسة الخلايا الجذعية للسرطان في السادسترو إلى التعرف كعب أخيل تلك "
من أجل تحديد طرق جديدة وقابلة للتطبيق سريريا لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية، ودراسة خصائصها بانتظام في المختبر ويستخدم على نطاق واسع تشكيل المجال في هذا السياق. وضعت أصلا لدراسة الطبيعي بيولوجيا الخلايا الجذعية، بما في ذلك تجديد الذات والقدرة على التمايز، وقد تم تكييف هذا الاختبار في وقت لاحق لدراسة الخلايا الجذعية السرطانية في المختبر، واستخدمت لتحقيق الخلايا الجذعية السرطانية معزولة عن PDAC 20. لقد وجدنا أن مجالات ورم يتكون من خلايا PDAC الإنسان الأساسية تحمل كل سمات مميزة الخلايا الجذعية السرطانية، وبالتالي تشير إلى أنها تحتوي على الخلايا الجذعية السرطانية في البنكرياس حسنة النية 21. وهكذا، فإن فحص المجال الورم يمثل أداة قوية للكشف عن علاجات أكثر فعالية في المختبر، ولكنها تحتاج إلى مزيد من النتائج التي جرى تقييمها في أكثر صرامة في المقايسات الجسم الحي. في الواقع، ينبغي أن يعامل البيانات التي تم إنشاؤها مع هذا الاختبار في المختبر بحذر شديد كما في اله فحص قد يكون عرضة للخطأ كبير. بروتوكولات موحدة للغاية، بما في ذلك العد الآلي من المجالات تشكيلها، وينبغي وضع لضمان البيانات استنساخه والتنبؤية.
في هذا السياق، فإننا المستخدمة مؤخرا هذا الاختبار لفحص الخلايا الجذعية السرطانية في البنكرياس المستمدة من مجموعة متنوعة من PDACs الإنسان الابتدائية وبينت أن هذه الخلايا هي معرضة بشدة لإعادة برمجة التمثيل الغذائي من خلال مكافحة السكري ميتفورمين المجمع. سابقا، وقد تجلى ميتفورمين لمنع توسع الخلايا السرطانية عن طريق تنشيط غير مباشر من AMP تنشيط بروتين كيناز (AMPK) مما يشير إلى وتثبيط لاحق من mTOR س 26، مما أدى إلى انخفاض تخليق البروتين وتكاثر الخلايا 27. بالإضافة إلى هذه الآثار على السكان الورم بكميات كبيرة، ونحن وآخرون قد وجدت أن الميتفورمين هو قادرة على استهداف وفعلا القضاء على الخلايا الجذعية السرطانية حيوانية في عدد من الأورام الصلبة مثل سرطان الثدي وسرطان المريء، ورم أرومي وسرطان البنكرياس 28-31 </ سوب>. وبالتالي، يمثل الميتفورمين استراتيجية علاجية جديدة واعدة وآمنة لعدة سرطانات مع الحاجة غير الملباة الطبية حاليا. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام تشكيل المجال باعتبارها وسيلة لإثراء لالخلايا الجذعية السرطانية، أظهرنا أن الآثار الأولية الميتفورمين على الخلايا الجذعية السرطانية في البنكرياس مستقلة عن تفعيل AMPK وتعتمد في الغالب على سميتها الميتوكوندريا متواضعة (عن طريق تثبيط مجمع I)، الذي كان على ما يبدو قاتلة للمجموعة الفرعية الخلايا الجذعية السرطانية فقط. لهذا الأخير تمكنا من تقييم إنتاج واستهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا ROS الخلوي لكونها تبين سمية الدواء على المستوى الخلوي. وفي وقت لاحق، يمكن التحقق من صحة هذه البيانات في المختبر في نماذج الماوس قبل السريرية وبالفعل أدى لفترات طويلة بشكل ملحوظ البقاء على قيد الحياة 31. المنهجية الواردة في هذه الوثيقة تسمح للجيل السريع لمحات حساسية العقاقير لالخلايا الجذعية السرطانية، بما في ذلك دراسات على آثارها على CSC عملية التمثيل الغذائي. نحن نقدم الآن بمد تفاصيل التجريبية حول كوم المستخدمةplementary في التجارب المختبرية وإجراءات الجسم الحي.
مع ظهور والتحقق لاحقا لمفهوم CSC للعديد من الأورام، وقد اكتسب مجال تطوير الأدوية زخما جديدا، مع احتمال تطوير علاجات السرطان أكثر كفاءة وتقليل المخاطر للانتكاس المرض في وقت لاحق. ومع ذلك، الحقل CSC لا يزال في مرحلة مبكرة والمزيد الذي يتعين تحقيقه من حيث فهم CSC المنشأ والانتشار، ودورها في تشكيل بنية الورم وتعزيز ورم خبيث.
في هذا السياق، واستخدام المقايسات CSC استنساخه وذات مغزى وكذلك تفسير مستنير من البيانات التي تم الحصول عليها يمثل عنصرا حاسما لتعزيز فهمنا لCSC علم الأحياء. من وجهات نظر عديدة البيولوجية، برز تشكيل المجال باعتبارها فحص قيمة للغاية. مع ذلك يجب أن يكون المستخدمون على علم حدودها من أجل تفسير صحيح نتائجها التجريبية. أحد الجوانب الهامة للنظر حتى قبل تقييم المجال شكليةبيانات نشوئها هو أصل العينة التحقيق، لأن النتائج التي تم الحصول عليها من عينات المستمدة من المريض جديدة يمكن ان تكون مختلفة كثيرا عن تلك التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا السرطانية المعمول بها.
الكلاسيكية مجال فحوصات تشكيل تشمل إستزراع الخلايا في كثافة نسيلي في لوحات فائقة الانخفاض التعلق وتقييم تشكيل المجال في وجود عامل نمو البشرة (EGF) و / أو عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (ب-FGF) المخصب، ولكن خالية من مصل المتوسطة 21، 34. تكوين ثقافة المتوسطة هي أيضا قضية هامة للنظر فيها. في تجربتنا وجدنا أن DMEM / F12 تستكمل مع B27، bFGF والجلوتامين في غياب المصل كان وسيلة الأمثل لنمو وتوسيع والحفاظ على CSC في ظروف غير متمايزة. وجدنا أن في هذا الشرط الثقافة (متوسطة وتعليق) الخلايا تعبر عن كميات عالية من علامات الخلية الجذعية السرطانية (بما في ذلك CD133 +، CD44 + CD24 + و) و لا تعبر عن البروتينات المرتبطة التمايز (CK-20 وCK-19).
واحدة من الافتراضات الأساسية لهذه المقايسات هو أن كل مجال هو نسيلي، أي مجال واحد ناتج عن التوسع في الخلايا الجذعية واحدة. ومع ذلك، هي في جوهرها مجالات البنى الدينامية التي تكون عرضة لصهر حتى في انخفاض كثافة البذر 35. خلايا الطلاء هو خطوة حاسمة في البروتوكول وكثافة خلية واحدة / جيد بالتأكيد يمكن الالتفاف على مسألة التجميع. ولكن حتى بالنسبة الأسلاف فرز مستقبلي، وهذا يؤدي بانتظام في تشكيل المجال منخفض جدا بسبب انخفاض جوهري النشاط تشكيل المجال ويمكن أن تعزى أيضا إلى تحفيز autocrine محدودة بسبب تأثيرات التخفيف. في تجربتنا لاحظنا أن 30٪ فقط من خلايا مطلي قادرة على تشكيل المجالات. نوصي باستخدام لا يقل عن 100 خلية / جيدا للحصول على نتائج متسقة وقابلة للتكرار.
وتستند طرق ثقافة أخرى لCSC النمو على الثقافات 3D صلبة أو شبه صلبة (على سبيل المثال، على أساس مatrigel، والكولاجين أو ميثيل). وقد استخدمت هذه الأساليب للحد من التنقل الخلية واللاحق تجميع خلية 36. ومع ذلك، كل من هذه المصفوفات تتحمل القيود الخاصة بها. على سبيل المثال، matrigel هو الغشاء القاعدي للذوبان معزولة عن Engelbreth-هولم-سوان (EHS) الورم وعلى الرغم من أن استخراج يشبه المعقدة البيئة ورم الخلية وجدت في العديد من الأنسجة، فإنه يحتوي على عدة عوامل النمو أكثر أو أقل تحديدا والتي غالبا ما يجعل ميكانيكي دراسات لعناصر تنظيمية محددة صعبة للغاية. نقطة أخرى من الاعتبار هو أن وظائف الخلية القدرات ووقف تشكيل المجال ليست شروط للتبادل 34. بينما ثبت بعض الخلايا الجذعية والسلف لعرض فشل تشكيل مجال القدرة 37، لتوليد المجالات في المختبر لا يستبعد في الجسم الحي وظيفة الجذعية / السلف. على سبيل المثال، الخلايا الجذعية هادئة ببساطة قد لا يستجيب لمنبهات خارج الخلية التي تقدمهااختيار في ظروف المختبر الثقافة. وهكذا، على المدى الطويل في المختبر والمجراة قدرة التجديد الذاتي للسكان الخلية النقى تفضيلي أثناء الركض المسلسل، ينبغي تقييم من أجل إثبات أو دحض وظيفة الخلايا الجذعية. في هذا السياق، والقدرة على مستقبلي في وقت واحد نشر السكان متنوعة من الخلايا الجذعية والسلف هي أحد الجوانب الهامة للمقايسة تشكيل المجال ويجعل هذا الاختبار ذات قيمة عالية للحقل CSC. طالما يتم الاحتفاظ حدودها في الاعتبار لتفسير البيانات التي تم الحصول عليها.
وقد استخدمت على نطاق واسع المقايسات تشكيل المجال لتحديد بأثر رجعي الخلايا الجذعية على أساس قدرتها على التجديد الذاتي والتمايز في مستوى خلية واحدة في المختبر. اكتشاف علامات التي تسمح للعزلة المحتملين للخلايا الجذعية وذريتها من المجراة على مكانة يسمح للخصائص الوظيفية للسكان المنقى إلى تعريف. جombination من مجال تشكيل فحص وFACS هو استراتيجية ناجحة لعزل الخلايا من الأنسجة الصلبة أو إثراء مجموعات سكانية فرعية محددة من PDAC في الثقافة. على سبيل المثال، والتعبير في وقت واحد EpCAM، CD24 CD44 ويعرف جزء من السكان الخلايا الجذعية السرطانية قادرة على: التجديد الذاتي، التفريق والشروع في الورم، مما يعكس عدم تجانس الورم الأصلي. هيرمان وآخرون. أظهرت أن الخلايا CD133 + تمتلك تضاف قدرة التكاثري ويتميز CSC 15. وقد استخدمت أيضا علامات أخرى لتوصيف الخلايا الجذعية السرطانية: يرتبط ALDH- 1 (ألدهيد نازعة-1) التعبير مع الخلايا مكون للأورام عالية في سرطان البنكرياس 38؛ خلايا قادرة على استبعاد الصبغة DNA هويشت 33342 والسكان الجانب اسمه (SP) الخلايا، لديها القدرة المؤكدة لبدء الأورام 39. أظهرنا مؤخرا أن تألق ذاتي مقصورة التحت خلوية يميز السكان متميزة من خلايا الإنسان مع الصفات CSC حصرية عبر أنواع الأورام المختلفة40 على الرغم من أن أيا من هذه العلامات يبدو أن تميز السكان نقية الخلايا الجذعية السرطانية بشكل انتقائي، تركيبات أكثر وأكثر تعقيدا من علامات تحتاج إلى استخدامها لFACS تنقية السكان أكثر دقة من الخلايا.
لا تزال العديد من الأسئلة حول الدور الدقيق الخلايا الجذعية السرطانية في الأصل، والتقدم، ومقاومة المخدرات من الأورام. على سبيل المثال، وسيلة واحدة لمعالجة مسألة التطور نسيلي لتحديد إذا وكيف CSC واحد يبدأ الورم، يمكن أن يكون لتحليل عينات من المرضى في مراحل مختلفة من هذا المرض، وعلى وجه التحديد اتباع أرقام الخلايا الجذعية السرطانية أثناء وبعد العلاج. طريق الإجابة على هذه الأسئلة، يمكننا أن نجعل تقدم ملموس من معرفتنا الخلايا الجذعية السرطانية في الأورام الصلبة وتطوير علاج لمنع تطور الورم في نهاية المطاف والانتكاس.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث من قبل ERC المتقدم باحث جرانت (باسكال-CSC 233460)، البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) بموجب اتفاقية منحة لا 256974 (EPC-TM-NET) ولا 602783 (CAM-باك )، وSubdirección عامة دي Evaluación ذ فومنتو دي لا INVESTIGACION، فوندو دي INVESTIGACION SANITARIA (PS09 / 02129 وPI12 / 02643)، والبرنامج الوطني دي Internacionalización دي لا I + D، Subprogramma: الداعية إلى الاستقلال 2009 (PLE2009-0105؛ MINISTERIO دي ECONOMIA ذ Competitividad، إسبانيا). وأيد E. Lonardo من قبل زمالة روش. وأيد M. سيوفي من قبل برنامج زمالة دكتوراه مسبقا لا كايكسا.
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |