Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
Pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) een subset van uitsluitend tumorigene kanker stamcellen (CSC), waarvan is aangetoond dat ze tumor initiatie, metastase en resistentie tegen radio- en chemotherapie rijden. Hier beschrijven we een specifieke methode voor het kweken van primaire menselijke pancreas CSCs als tumor bollen in verankering-onafhankelijke omstandigheden. Cellen worden gekweekt in serumvrij, niet hechtende voorwaarden om te verrijken CSCs terwijl de meer gedifferentieerde nakomelingen niet overleven en prolifereren gedurende de eerste tijd na zaaien van enkele cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het schatten van het percentage CSCs in een populatie van tumorcellen. Zowel size (die kan variëren 35-250 micrometer) en aantal tumor bolletjes gevormd vertegenwoordigt CSC activiteit geherbergd in beide bulk populaties van gekweekte kankercellen of vers geoogst en gedigereerd tumors 1,2. Met behulp van deze test, we onlangs bleek dat metformine selectief ablateert pancreatic CSCs; een bevinding die vervolgens verder werd bevestigd door aan te tonen verminderde expressie van pluripotency geassocieerde genen / oppervlak markers en verminderde in vivo tumorigeniciteit van metformine behandelde cellen. Als laatste stap voor preklinische ontwikkeling we behandelde muizen met gevestigde tumoren met metformine en vond aanzienlijk verlengde overleving. Klinische studies testen het gebruik van metformine bij patiënten met PDAC zijn nog gaande (bv NCT01210911, NCT01167738 en NCT01488552). Mechanistisch, vonden we dat metformine veroorzaakt een fatale energiecrisis in CSCs door verbetering van reactieve zuurstof species (ROS) productie en reducerende mitochondriale transmembraanpotentiaal. Daarentegen werden niet-CSC niet geëlimineerd door behandeling met metformine, maar onderging omkeerbare celcyclus. Daarom onze studie dient als geslaagd voorbeeld van het potentieel van in vitro gebied formatie als screeningsmethode om verbindingen die potentieel doelwit CSC identificerens, maar deze techniek verder in vitro en in vivo geldig worden om valse ontdekkingen elimineren.
Pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) is een van de meest agressieve vaste tumoren. Het is momenteel de 4e meest voorkomende kanker-gerelateerde dood in de westerse samenleving en zal naar verwachting stijgen naar de 2e meest voorkomende oorzaak in de komende tien jaar (~ 400.000 sterfgevallen per jaar wereldwijd) 3 .Op moment van de diagnose 90% van de patiënten aanwezig met gevorderde ziekte, waarbij een 5-jaars overleving van minder dan 5% heeft. Deze overlevingskans is teleurstellend gebleven ondanks steeds intensief onderzoek activiteiten 4 in de afgelopen 50 jaar onveranderd. Van de resterende 10% van de patiënten die in potentie 'genezen' ziekte door chirurgische resectie, wordt 80% sterven aan herhaling binnen 5 jaar. Al vele jaren de standaard van zorg voor gevorderde ziekte is geweest gemcitabine monotherapie, maar dit geeft slechts een marginale overlevingsvoordeel 5. Kleine verbeteringen op korte termijn overleven zijn bereikt door de toevoegingvan erlotinib 6 of capecitabine 7, maar de overlevingsvoordeel in de orde van weken de mediane algehele overleving nog ~ 6 maanden. Onlangs hebben meer bemoedigende resultaten naar voren gekomen voor gemcitabine / NAB -paclitaxel 8 en de FOLFIRINOX combinatie regime 9,10. Deze therapieën verbeteren mediane overleving met bescheiden 2 en 4 maanden respectievelijk, maar zijn zeer giftig en lange termijn overlevenden steeds hoge uitzondering. Hoewel de behandeling biedt het potentieel voor verbetering, deze zijn giftig regimes waar veel patiënten niet reageren of alleen tonen incrementele verbetering in de algemene overleving. Als gevolg daarvan, is er een dringende noodzaak om de huidige therapieën aan te vullen en om nieuwe, waarschijnlijk multimodale therapeutische benaderingen te ontwikkelen.
Tumor Heterogeniteit
Het wordt steeds duidelijker dat kanker heterogeniteit is niet alleen beperkt tot verschillende evolutionaire subklonen within elke tumor 11, maar ook gedreven door fenotypische en functionele heterogeniteit en plasticiteit binnen elke subkloon 12. Zogenaamde kanker stamcellen (CSC) of tumor bevorderen cellen zijn verantwoordelijk voor intraclonal heterogeniteit 13-16. Concreet CSCs vormen een subset van kankercel, waarvoor wij en anderen overtuigend bewijs heeft geleverd, tot aan de enkele cel, die zij vertegenwoordigen de wortel van de ziekte door die aanleiding geven tot alle gedifferentieerde nakomelingen binnen elke kanker subkloon 17. Wat nog belangrijker is, deze cellen zijn essentieel voor metastatisch gedrag en tevens een belangrijke bron voor terugval van ziekte na behandeling, zelfs bij relatief doeltreffend drugs kan induceren initiële tumorregressie (bijv nab -paclitaxel) 15,18-20. Het is belangrijk op te merken dat CSCs niet noodzakelijkerwijs bona fide stamcellen, noch ze ontstaan uit weefsel stamcellen in vele gevallen, maar ze hebben acquired bepaalde functies van stamcellen. De meeste hiervan zijn functioneel vermeld, bijvoorbeeld CSCs zijn uitgerust met een onbepaalde zelfvernieuwingscapaciteit waardoor ze resistent zijn tegen conventionele chemotherapie, en vertonen verhoogde invasiviteit die metastatische activiteit bevordert.
Functionele Cancer Stem Cell Fenotypes
De functionele fenotype van CSCs is gebaseerd op hun vermogen om zichzelf te vernieuwen, dat kan in vitro worden getest met behulp van seriële bol vorming en de vorming van kolonies assays respectievelijk. Nog belangrijker, CSCs staat zelfvernieuwing beer in vivo tumorgeniciteitsonderzoek die kan worden getest door beperkende verdunning in vivo assays als de uiteindelijke functionele uitlezing voorkeur tijdens seriële transplantatie indicatief exclusieve langlopende tumorigeniciteit. Bovendien is er heterogeniteit in de CSC compartiment met een duidelijke subpopulatie van CSCs met het exclusieve mogelijkheid om aanleiding te geven tot metastasen die niet alleen eendirect gevolg van hun exclusieve in vivo tumorgeniciteit. Inderdaad, metastastitic CSCs verwerven het vermogen om de primaire tumor te ontwijken, overleven anoikis en uiteindelijk translocatie en zaden secundaire plaatsen. Deze geavanceerde functionele vermogens kunnen worden getest in vitro gebruik van gewijzigd invasie assays en in vivo assays gebruikt metastase.
Targeting kankerstamcellen
Wij en anderen hebben overtuigend bewijs dat behandelingen gericht op de grootste tumor van gedifferentieerde PDAC cellen, zelfs in combinatie met stroma targeting agents voorzien, niet een grote invloed op de progressie van de tumor en de daaropvolgende resultaat niet hebben, tenzij in combinatie met een CSC-targeting strategie 21, 22. Aldus, gebaseerd op de cruciale functies van CSCs in ziekteprogressie en resistentie tegen therapie, die cellen zou een essentiële component voor elke nieuwe behandeling 18,20 betekenen, maar een veel beter begrip o vereisenf van de regelgeving machinerie van CSCs. Hoewel CSCs en hun meer gedifferentieerde nakomelingen dragen identieke genetische grond staten met betrekking tot genetische veranderingen, CSCs vertonen onderscheiden en dus epigenetisch vastberaden genexpressie profielen die modules delen met pluripotente stamcellen. De meeste genen die betrokken zijn bij het genereren geïnduceerde pluripotente stamcellen (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) zijn niet alleen gekoppeld aan kanker, maar hun expressie wordt meestal beperkt tot de CSCs compartiment. Bovendien is de functionele relevantie van CSCs door het verlies-van-functie experimenten met genetische instrumenten voor het richten CSCs zijn nu stevig gevestigd de CSC concept voor verschillende soorten kanker 23-25. Terwijl de meeste van deze benaderingen zijn gebaseerd op muismodellen en zijn dus niet gemakkelijk overdraagbaar in de kliniek, ze bieden proof-of-concept voor de potentiële klinische relevantie van targeting CSCs in combinatie met bulk tumorcellen.
Studeren kankerstamcellen In Vitro naar hun Achilles 'Heel Identificeer
Om nieuwe en klinisch toepasbare manieren identificeren voor het richten CSCs, worden de functies geregeld bestudeerd in vitro en bol vorming op grote schaal gebruikt in deze context. Oorspronkelijk ontwikkeld voor het bestuderen van normale stamcellen biologie, waaronder zelfvernieuwing en differentiatie capaciteit, was dit assay later aangepast CSCs in vitro onderzoeken en is gebruikt voor het onderzoeken CSCs geïsoleerd uit PDAC 20. We hebben ontdekt dat tumor bollen gevormd uit primaire menselijke PDAC cellen dragen alle duidelijke kenmerken van CSCs, hetgeen wijst zij bona fide pancreas CSCs 21 bevatten. Zo is de tumor bol assay is een krachtig hulpmiddel voor het screenen op effectievere behandelingen in vitro, maar de resultaten verder moeten worden geëvalueerd bij strengere in vivo assays. Inderdaad, moeten de gegevens gegenereerd met deze in vitro test worden behandeld met grote voorzichtigheid als the test kan onderhevig zijn aan fouten. Zeer gestandaardiseerde protocollen, waaronder geautomatiseerde telling van gevormde bolletjes, moeten worden vastgesteld om ervoor te zorgen reproduceerbare en voorspellende data.
In deze context, recent gebruikte we deze test pancreas CSCs afgeleid van een diverse set van primaire humane PDACs screenen en toonde aan dat deze cellen zeer gevoelig voor metabole herprogrammering door anti-diabetische verbinding metformine. Eerder had metformine is aangetoond dat kankercellen expansie door indirecte activering van AMP-geactiveerd proteïnekinase (AMPK) signalering en daaropvolgende remming van mTOR 26 uit waardoor eiwitsynthese en celproliferatie 27 remmen. Naast deze effecten op de tumor bulk populatie, hebben wij en anderen vonden dat metformine kan richten en zelfs elimineren de CSC subpopulatie in een aantal vaste tumoren zoals borstkanker, slokdarmkanker, glioblastoma en pancreaskanker 28-31 </ Sup>. Zo metformine vertegenwoordigt een veelbelovende en veilige nieuwe therapeutische strategie voor de verschillende vormen van kanker met momenteel onvervulde medische noodzaak. Bovendien gebruiken bol vorming als een manier om verrijken CSCs we aangetoond dat primaire effecten van metformine op pancreas CSCs was onafhankelijk van AMPK activering en meestal gebruikt zijn bescheiden mitochondriale toxiciteit (via remming van complex I), die blijkbaar was letaal voor de subset van CSCs alleen. Voor deze laatste konden we hun cellulaire zuurstofconsumptie en mitochondriale ROS productie beoordeelt indicatoren van de toxiciteit van het geneesmiddel op cellulair niveau. Vervolgens kunnen deze in vitro gegevens worden gevalideerd in preklinische muismodellen en zelfs in significant verlengde overleving 31. De hier gepresenteerde methode zorgt voor de snelle generatie drug gevoeligheid profielen voor CSCs, met inbegrip van studies over de effecten ervan op CSC metabolisme. We bieden nu uitgebreid experimentele details over de gebruikte comcomplementaire in vitro en in vivo procedures.
Met de opkomst en de daaropvolgende validatie van de CSC concept voor veel tumoren, is het gebied van de ontwikkeling van geneesmiddelen een nieuwe impuls gekregen, met het potentieel voor de ontwikkeling van efficiëntere behandelingen van kanker en vervolgens het verminderen van het risico voor de ziekte van recidive. Echter, het veld CSC is nog in een vroeg stadium en er moet meer in termen van begrip CSC oorsprong en voortplanting, en hun rol in het vormgeven van de tumor architectuur en het bevorderen van metastase te bereiken.
In deze context is het gebruik van reproduceerbare en betekenisvolle CSC assays en geïnformeerde interpretatie van verkregen data vormt een essentieel onderdeel van onze kennis van CSC biologie. Van vele biologische perspectieven, heeft bol vorming ontpopt als een zeer waardevolle test; Toch gebruikers moeten zich bewust zijn van de beperkingen om hun experimentele resultaten goed te interpreteren. Een belangrijk aspect om te overwegen nog voordat de evaluatie van de bol formatiegegevens is de oorsprong van het onderzochte monster, aangezien de verkregen uit verse patiënt afgeleide monsters leidt significant verschillend van die verkregen uit gevestigde kankercellijnen zijn.
Classic bol vorming assays omvatten enten cellen bij klonale dichtheid in ultralaag bevestigingsplaten en evalueren bol formatie in aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en / of basische fibroblastgroeifactor (b-FGF) verrijkt, maar serumvrij medium 21, 34. Het kweekmedium samenstelling is ook een belangrijk punt van overweging. In onze ervaring ontdekten we dat DMEM / F12 aangevuld met B27, bFGF en glutamine in de afwezigheid van serum een optimaal medium te groeien, uitbreiden en onderhouden van de CSC in ongedifferentieerde omstandigheden. We vonden dat in deze cultuur toestand (gemiddeld en ophanging) de cellen brengen grote hoeveelheden kanker stamcellen markers (inclusief CD133 +, CD44 + en CD24 +) en niet-differentiatie geassocieerde eiwitten niet uitdrukken (CK-20 En CK-19).
Een van de fundamentele uitgangspunten van deze assays is dat elke bol klonaal, dwz een bol gevolg van de groei van een stamcel. Echter, bollen zijn intrinsiek dynamische structuren die gevoelig zijn voor zelfs smelten bij lage dichtheid zaaien 35 zijn. Plating cellen is een cruciale stap in het protocol en de dichtheid van een cel / put kan zeker de aggregatie probleem te omzeilen. Maar zelfs voor prospectief naargelang voorouders, dit regelmatig resulteert in een zeer lage vorming sfeer te wijten aan lage intrinsieke bol vorming activiteit en kan ook worden toegeschreven aan beperkt autocriene stimulatie als gevolg van verwatering effecten. In onze ervaring zagen we dat slechts 30% van de cellen uitgeplaat kunnen bolletjes vormen. We raden het gebruik van ten minste 100 cellen / putje om consistente en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Andere kweekmethoden groei CSC zijn gebaseerd op vaste of halfvaste 3D cultures (bijvoorbeeld op basis van matrigel, collageen of methylcellulose). Deze werkwijzen zijn gebruikt voor celbeweging en daaropvolgende celaggregatie 36 beperken. Echter, elk van deze matrices beren hun eigen beperkingen. Bijvoorbeeld, matrigel een oplosbaar basale membraan geïsoleerd uit de Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumor en hoewel het extract lijkt de complexe extracellulaire tumoromgeving in veel weefsels, doet meerdere min of meer gedefinieerde groeifactoren die vaak maakt mechanistische bevatten studies regulerende elementen zeer moeilijk. Een ander punt van overweging is dat bol vormen capaciteit en stamcel functies niet uitwisselbaar termen 34. Hoewel bepaalde stamcellen en voorlopercellen bleken te vertonen bol vormend vermogen 37, niet bollen in vitro genereren niet in vivo stam / voorlopercellen functie uitgesloten. Bijvoorbeeld kan rustende stamcellen eenvoudigweg niet reageert op extracellulaire signalen die degeselecteerd in vitro kweekomstandigheden. Zo is op lange termijn in vitro en in vivo zelfvernieuwingscapaciteit van gezuiverd celpopulaties, bij voorkeur tijdens de seriële passage, moeten worden beoordeeld om te bewijzen of te weerleggen stamcel functie. In dit verband heeft de mogelijkheid om prospectief gelijktijdig propageren diverse populaties van stamcellen en progenitorcellen is een cruciaal aspect van de bol vormende assay en maakt deze assay zeer waardevol voor het gebied CSC; zolang de beperkingen in het achterhoofd worden gehouden voor de interpretatie van de verkregen gegevens.
Sphere-vormende assays zijn op grote schaal gebruikt om achteraf te identificeren stamcellen op basis van hun vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie bij de enkele cel niveau in vitro. De ontdekking van merkers die de toekomstige isolering van stamcellen en hun nakomelingen toelaten uit hun in vivo niche kunnen de functionele eigenschappen van gezuiverde populaties te definiëren. De combination van bol formatie test en de FACS is een succesvolle strategie om cellen van vast weefsel isoleren of verrijken specifieke subpopulaties van PDAC in de cultuur. Zo gelijktijdige expressie van EpCAM, CD24 en CD44 definieert een subpopulatie van CSCs bijwerken zelfvernieuwing, differentiëren en start een tumor, die de heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Hermann et al. toonde aan dat CD133 + cellen bezaten verhoogd proliferatief vermogen en CSC voorzien 15. Andere merkers zijn ook gebruikt voor de karakterisering van CSCs: ALDH- 1 (Aldehyde dehydrogenase-1) expressie is geassocieerd met zeer tumorigene cellen in pancreaskanker 38; cellen kunnen het DNA kleurstof Hoechst 33342 uitsluiten, genaamd side population (SP) cellen, hebben bewezen vermogen om tumoren te 39 initiëren. Recent toonden we aan dat een subcellulair autofluorescentie compartiment kenmerkt een duidelijke populatie van menselijke cellen met exclusieve CSC trekken over verschillende tumortypes40. Hoewel geen van deze merkers blijkt een zuivere populatie van CSCs selectief karakteriseren steeds complexere combinaties van markers gebruikt moeten worden voor FACS zuiveren verfijnder celpopulaties.
Veel vragen nog steeds over de precieze rol van CSCs in de oorsprong, progressie en resistentie van tumoren. Bijvoorbeeld, een manier om de kwestie van klonale evolutie pakken te bepalen of en hoe een CSC initieert een tumor, kon de patiënt te analyseren in verschillende stadia van de ziekte, en in het bijzonder volgen de aantallen CSCs tijdens en na de behandeling. Door het beantwoorden van deze vragen, kunnen we betekenisvolle vooruitgang van onze kennis van CSCs in solide tumoren te maken en drug therapieën om uiteindelijk te voorkomen progressie van de tumor en terugval te ontwikkelen.
The authors have nothing to disclose.
Het huidige onderzoek werd gesteund door een ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst Geen 256.974 (EPC-TM-NET) en No 602.783 (CAM-PAC ), de Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 & PI12 / 02.643), en het Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje). E. Lonardo werd ondersteund door Roche Fellowship. M. Cioffi werd gesteund door de La Caixa predoctorale Fellowship Programme.
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |