Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) indeholder en delmængde af udelukkende tumorgene cancer stamceller (CSCS), som har vist sig at drive tumor initiering, metastaser og modstandsdygtighed over for radio- og kemoterapi. Her beskriver vi en specifik metode til dyrkning af primære humane pancreas CSCS som tumor kugler i forankringsuafhængige betingelser. Celler dyrkes i serum-fri, ikke-adhærente betingelser for at berige for CSCS mens deres mere differentierede afkom ikke overlever og prolifererer i den indledende fase efter podning af enkeltceller. Dette assay kan anvendes til at estimere procentdelen af CSCS stede i en population af tumorceller. Både størrelse (som kan variere fra 35 til 250 mikrometer) og antallet af tumor dannede kugler repræsenterer CSC aktivitet nærede i enten bulk-populationer af dyrkede cancerceller eller friskhøstede og fordøjet tumorer 1,2. Anvendelse af dette assay for nylig fandt vi, at metformin selektivt ablaterer pancreatic CSCS; en konstatering af, at efterfølgende blev yderligere bekræftet ved at demonstrere formindsket udtryk for pluripotens-associerede gener / overflademarkører og reduceret in vivo tumorgenicitet for metformin-behandlede celler. Som det sidste skridt for præklinisk udvikling, vi behandlede mus med etablerede tumorer med metformin og fundet signifikant forlænget overlevelse. Kliniske undersøgelser afprøver brugen af metformin til patienter med PDAC er i øjeblikket i gang (f.eks NCT01210911, NCT01167738 og NCT01488552). Mekanistisk, fandt vi, at metformin inducerer en fatal energikrise i CSCS ved at forbedre reaktive ilt arter (ROS) produktion og reduktion af mitokondrie transmembranpotentiale. I modsætning hertil blev der ikke-CSCS ikke elimineres ved metformin behandling, men snarere undergik reversibel cellecyklusstandsning. Derfor vores undersøgelse tjener som et vellykket eksempel for potentialet i in vitro sfære dannelse som et screeningsværktøj til identifikation af forbindelser, der potentielt er målrettet mod CSCs, men vil denne teknik kræver yderligere in vitro og in vivo validering til at eliminere falske opdagelser.
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) er en af de mest aggressive solide tumorer. Det er i øjeblikket den 4. hyppigste kræftform dødsfald i det vestlige samfund og forventes at stige til 2. hyppigste årsag inden for det næste årti (~ 400.000 dødsfald om året på verdensplan) 3 .På diagnosetidspunktet 90% af patienterne er til stede med fremskreden sygdom, som har en 5-års overlevelse på mindre end 5%. Denne overlevelsesraten er skuffende uændret i de sidste 50 år på trods af stadig mere intensive forskningsaktiviteter 4. Af de resterende 10% af patienter, som har potentielt "helbredes sygdom gennem kirurgisk resektion, vil 80% dø af tilbagefald inden for 5 år. I mange år standarden for pleje af fremskreden sygdom har været gemcitabin monoterapi, men dette kun giver en marginal overlevelse fordel 5. Små forbedringer kortsigtet overlevelse er blevet opnået ved tilsætningaf erlotinib 6 eller capecitabin 7, men overlevelse fordel er i størrelsesordenen uger med mediane samlede overlevelse stadig ~ 6 måneder. For nylig har mere opmuntrende resultater opstået for gemcitabin / nab -paclitaxel 8 og FOLFIRINOX kombinationen regime 9,10. Disse behandlinger forbedrer median overlevelse ved en beskeden 2 og 4 måneder henholdsvis, men er meget giftige og langsigtede overlevende er stadig en sjælden undtagelse. Selvom behandling giver mulighed for forbedringer, disse er giftige regimer, som mange patienter ikke reagerer, eller kun vise trinvis forbedring i samlet overlevelse. Som en konsekvens heraf er der et presserende behov for at supplere de nuværende behandlinger og udvikle nye, mest sandsynlige multimodale behandlingsmetoder.
Tumor Heterogenitet
Det bliver stadig mere tydeligt, at kræft heterogenitet ikke kun begrænset til distinkt evolutionær subkloner within hver tumor 11, men også drevet af fænotypiske og funktionel heterogenitet og plasticitet inden for hver subklon 12. Såkaldte cancer stamceller (CSCS) eller tumorfremmende celler er ansvarlige for intraclonal heterogenitet 13-16. Konkret udgør CSCS en delmængde af kræftcelle, som vi og andre har givet afgørende bevis, ned til den enkelt celle, at de repræsenterer roden til sygdommen ved at give anledning til alle differentierede afkom inden for hver kræft subklon 17. Hvad vigtigere er, disse celler er afgørende for metastatisk adfærd og også udgør en vigtig kilde for sygdomstilbagefald efter behandling, selv med relativt effektive lægemidler stand til at inducere indledende tumorregression (f.eks nab -paclitaxel) 15,18-20. Det er vigtigt at bemærke, at CSCS ikke nødvendigvis repræsenterer bona fide stamceller, heller ikke de udspringer fra væv stamceller i mange tilfælde, men snarere de har ACQgendannes for visse funktioner i stamceller. De fleste af disse er funktionelt defineret, f.eks CSCS er udstyret med ubestemt selvfornyelse kapacitet, hvilket gør dem modstandsdygtige over for konventionel kemoterapi, og viser øget invasionsevne der fremmer metastatisk aktivitet.
Funktionelle Kræft stamceller fænotyper
Den funktionelle fænotype af CSCS er baseret på deres evne til at forny sig selv, som kan testes in vitro ved anvendelse af serielle sfære dannelse og kolonidannelse assays hhv. Endnu vigtigere, CSCS stand til selvfornyelse bear in vivo tumorgenicitet, der kan afprøves ved begrænsende fortynding in vivo-assays som den ultimative funktionelle udlæsning, fortrinsvis under seriel transplantation indikerer eksklusiv langsigtet tumorigenicitet. Desuden er der heterogenitet inden for CSC rummet, med en tydelig underpopulation af CSCS bærer den eksklusive mulighed for at give anledning til metastaser, der ikke blot er endirekte konsekvens af deres eksklusive in vivo tumorigenicitet. Faktisk metastastitic CSCS erhverve evnen til at unddrage sig den primære tumor, overlever anoikis og i sidste ende translokere og frø sekundære sites. Disse avancerede funktionsevne kan testes in vitro ved anvendelse af modificerede invasions assays og in vivo under anvendelse af metastase assays.
Målretning cancerstamceller
Vi og andre har tilvejebragt overbevisende dokumentation for, at behandlinger med fokus på hovedparten tumor af differentierede PDAC celler, selv i kombination med stroma-targeting agenter, ikke har en stor indvirkning på tumorprogression og efterfølgende resultat, medmindre kombineret med en CSC-targeting strategi 21, 22. Således er baseret på de afgørende funktioner CSCS i sygdomsprogression og modstandsdygtighed over for behandling, bør disse celler betyde et væsentligt element for enhver ny behandling tilgang 18,20, men vil kræve en langt mere grundig forståelse of de lovgivningsmæssige maskineri CSCS. Selvom CSCS og deres mere differentierede afkom bære identiske genetiske jorden stater med hensyn til genetiske ændringer, CSCS udviser tydelig og dermed epigenetisk beslutsom genekspression profiler som deler moduler med pluripotente stamceller. De fleste af de involverede i at generere inducerede pluripotente stamceller (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) gener er ikke kun været forbundet med kræft, men deres udtryk er for det meste begrænset til CSCS rum. Desuden har den funktionelle relevans CSCS ved tab-of-funktion forsøg med genetiske værktøjer til at målrette CSCS nu fast etableret CSC koncept for flere kræftformer 23-25. Mens de fleste af disse tilgange er baseret på musemodeller og derfor ikke let overføres til klinikken, de giver proof-of-concept for den potentielle kliniske relevans af målretning CSCS i kombination med bulk-tumorceller.
Studere Kræft stamceller i Vitro at identificere deres akilleshæl
For at identificere nye og klinisk relevante måder at målrette CSCS, er deres funktioner regelmæssigt undersøgt in vitro og sfære dannelse er meget udbredt i denne sammenhæng. Oprindeligt udviklet til at studere normal stamcelle biologi, herunder selv-fornyelse og differentiering kapacitet, blev denne analyse senere tilpasset til at studere CSCS in vitro og har været brugt til undersøgelse CSCS isoleret fra PDAC 20. Vi har fundet, at tumor kugler dannet af primære humane PDAC celler bærer alle distinkte funktioner i CSCS derfor indikerer de indeholder bona fide bugspytkirtlen CSCS 21. Således tumor sfære analysen er et effektivt redskab til screening for mere effektive behandlingsformer in vitro, men resultaterne skal evalueres yderligere i strengere in vivo assays. Faktisk bør data genereret med dette in vitro assay behandles med stor forsigtighed, da the assay kan gøres til genstand for væsentlige fejl. Meget standardiserede protokoller, herunder automatiseret optælling af dannede kugler, bør oprettes for at sikre reproducerbare og prædiktive data.
I denne sammenhæng har vi for nylig brugt denne analyse til at screene pancreas CSCS afledt af et bredt sæt af primære humane PDACs og viste, at disse celler er meget sårbare over for metabolisk omprogrammering af anti-diabetisk sammensatte metformin. Tidligere havde metformin blevet påvist at inhibere cancercelle ekspansion ved indirekte aktivering af AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) signalering og efterfølgende hæmning af mTOR 26, hvilket resulterer i reduceret proteinsyntese og celleproliferation 27. Ud over disse virkninger på kolben tumor befolkning, har vi og andre fundet, at metformin er i stand til at målrette og faktisk eliminere CSCS subpopulation i en række faste tumorer, såsom bryst-, esophageal cancer, glioblastom og pancreascancer 28-31 </ Sup>. Således metformin repræsenterer en lovende og sikker ny terapeutisk strategi for flere kræftformer med i øjeblikket udækket medicinsk behov. Desuden bruger kugle dannelse som en måde at berige for CSCS viste vi, at metformin primære virkninger på pancreas CSCS var uafhængig af AMPK aktivering og for det meste har påberåbt sig sin beskedne mitokondrietoksicitet (via hæmning af kompleks I), som tilsyneladende var dødelig for delmængde af CSCS alene. For sidstnævnte kunne vi vurdere deres cellulære ilt forbrug og mitokondrie ROS produktion som indikatorer for lægemidlets toksicitet på celleniveau. Efterfølgende kunne disse in vitro-data valideres i prækliniske musemodeller og faktisk resulterede i signifikant forlænget overlevelse 31. Den metode præsenteret heri muliggør hurtig generering af narkotika følsomhed profiler til CSCS, herunder undersøgelser af deres virkninger på CSC stofskifte. Vi har nu leverer udvidet eksperimentelle detaljer om de udnyttede complerende in vitro og in vivo procedurer.
Med fremkomsten og efterfølgende validering af CSC begreb for mange tumorer, har inden for lægemiddeludvikling fået ny fremdrift, med mulighed for at udvikle mere effektive kræftbehandling og efterfølgende reducere risikoen for sygdom tilbagefald. Men CSC feltet er stadig på et tidligt stat og mere skal nås i form af forståelse CSC oprindelse og udbredelse, og deres rolle i udformningen af tumor arkitektur og fremme metastaser.
I denne sammenhæng er anvendelsen af reproducerbare og meningsfulde CSC assays samt den informerede fortolkning af opnåede data repræsenterer en afgørende komponent for at fremme vores forståelse af CSC biologi. Fra mange biologiske perspektiver har sfære dannelse opstået som en særdeles værdifuld assay; alligevel brugere bør være opmærksomme på dens begrænsninger med henblik på korrekt fortolke deres eksperimentelle resultater. Et vigtigt aspekt at overveje endnu før evalueringen af kugle formation data er oprindelsen af den undersøgte prøve, da de opnåede resultater fra friske patient-afledte prøver kan være væsentligt forskellige fra dem, der opnås fra etablerede cancercellelinier.
Klassiske sfære formation assays involverer podning celler ved klonal densitet i ultralav-fastgørelsesplader og evaluering sfære dannelse i nærvær af epidermal vækstfaktor (EGF) og / eller basisk fibroblastvækstfaktor (b-FGF) beriget, men serum-frit medium 21, 34. Dyrkningsmediet sammensætning er også et vigtigt spørgsmål at overveje. Vores erfaring fandt vi, at DMEM / F12 suppleret med B27, bFGF og glutamin i fravær af serum var et optimalt medium at vokse, udvide og vedligeholde CSC i udifferentierede betingelser. Vi fandt, at i denne kultur tilstand (medium og suspension) cellerne udtrykker høje mængder af kræft stamceller markører (herunder CD133 +, CD44 + og CD24 +) og udtrykker ikke differentiering-associerede proteiner (CK-20 Og CK-19).
En af de grundlæggende forudsætninger for disse analyser er, at hver kugle er klonal, dvs en kugle skyldes udvidelsen af en enkelt stamcelle. Men kugler er uløseligt dynamiske strukturer, der er tilbøjelige til at smelte, selv ved lav udsåningstæthed 35. Plating celler er et afgørende skridt i protokollen og tætheden af en celle / brønd kan helt sikkert omgå sammenlægning spørgsmålet. Men selv for fremadrettet sorteret progenitorer, dette resulterer jævnligt i meget lav sfære dannelse på grund af lav iboende sfære dannelse aktivitet og kan også tilskrives begrænset autokrin stimulering grund fortyndingsvirkninger. Vores erfaring observerede vi, at kun 30% af celler udpladet er i stand til at danne sfærer. Vi anbefaler at bruge mindst 100 celler / brønd for at opnå konsistente og reproducerbare resultater.
Andre dyrkningsmetoder for vækst CSC er baseret på faste eller halvfaste 3D kulturer (f.eks, baseret på matrigel, collagen eller methylcellulose). Er blevet anvendt disse metoder til begrænsning celle mobilitet og efterfølgende celleaggregering 36. Men hver af disse matricer bærer, deres egne begrænsninger. For eksempel Matrigel er en opløselig basalmembran isoleret fra Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumor, og selvom ekstrakten ligner det komplekse ekstracellulære miljø tumor findes i mange væv, det indeholder flere mere eller mindre definerede vækstfaktorer, som ofte gør aftalen mekanistisk undersøgelser for specifikke regulatoriske elementer meget vanskelige. Et andet forhold er, at kugle-dannende kapacitet og stamceller funktioner er ikke udskiftelige vilkår 34. Selv om der er vist visse stamceller og progenitorceller at udvise kugle-dannende evne 37, manglende generere sfærer in vitro udelukker ikke in vivo stamceller / progenitor funktion. For eksempel kan hvilende stamceller simpelthen ikke reagere på de ekstracellulære signaler, som denudvalgte in vitro dyrkningsbetingelser. Således langsigtet in vitro og in vivo selvfornyelse kapacitet oprensede cellepopulationer, fortrinsvis under seriepassage, bør vurderes med henblik på at bevise eller modbevise stamcelle-funktion. I denne sammenhæng evnen til fremadrettet og samtidig udbrede forskelligartede populationer af stamceller og progenitorceller er et afgørende aspekt af kuglen-dannende assay og gør dette assay meget værdifuldt for CSC område; så længe dens begrænsninger holdes i tankerne for fortolkningen af de opnåede data.
Sphere-dannende assays er ofte blevet brugt til med tilbagevirkende kraft at identificere stamceller baseret på deres evne til selv at fornyelse og differentiering på enkelt celle niveau in vitro. Opdagelsen af markører, der tillader den potentielle isolering af stamceller, og deres afkom fra deres in vivo niche tillader de funktionelle egenskaber af oprensede populationer skal defineres. Combination af kugle dannelse assay og FACS er en vellykket strategi for at isolere celler fra fast væv eller berige specifikke subpopulationer af PDAC i kultur. For eksempel, samtidig udtryk for EpCAM, CD24 og CD44 definerer en subpopulation af CSCS kunne: selvfornyelse, differentiere og initiere en tumor, der afspejler heterogenitet af den oprindelige tumor. Hermann et al. viste, at CD133 + celler besad augmented proliferativ kapacitet og CSC har 15. Andre markører er også blevet anvendt til karakterisering af CSCS: ALDH- 1 (aldehyddehydrogenase-1) ekspression er forbundet med yderst tumorigene celler i pancreascancer 38; celler i stand til at udelukke DNA farvestof Hoechst 33342, opkaldt side befolkning (SP) celler, har bevist evne til at initiere tumorer 39. For nylig viste vi, at en subcellulære autofluorescens rum kendetegner et særskilt population af humane celler med eksklusive CSC træk på tværs af forskellige tumortyper40. Selv om ingen af disse markører tilsyneladende selektivt karakterisere en ren population af CSCS, mere og mere komplekse kombinationer af markører skal bruges til FACS oprense mere raffinerede populationer af celler.
Mange spørgsmål er stadig om den præcise rolle CSCS i oprindelse, progression, og lægemiddelresistens af tumorer. For eksempel er en måde at behandle spørgsmålet om klonal evolution at definere, om og hvordan en enkelt CSC indleder en tumor, kunne være at analysere patientprøver på forskellige stadier af sygdommen, og specifikt at følge antallet af CSCS under og efter behandling. Ved at besvare disse spørgsmål, kan vi gøre meningsfulde fremskridt i vores viden om CSCS i solide tumorer og udvikle lægemiddelterapier til i sidste ende forhindre tumor progression og tilbagefald.
The authors have nothing to disclose.
Den nuværende forskning blev støttet af et ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskudsaftale nr 256974 (EPC-TM-NET) og nr 602783 (CAM-PAC ), Den Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 & PI12 / 02643), og Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien). E. Lonardo blev støttet af Roche Fellowship. M. Cioffi blev støttet af La Caixa Predoctoral Fellowship Programme.
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |