Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता (PDAC) ट्यूमर दीक्षा, मेटास्टेसिस और प्रतिरोध रेडियो के लिए और कीमोथेरेपी ड्राइव करने के लिए दिखाया गया है, जो विशेष रूप से tumorigenic कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) के सबसेट होते है। यहाँ हम लंगर स्वतंत्र परिस्थितियों में ट्यूमर क्षेत्रों के रूप में प्राथमिक मानव अग्नाशय सीएससी संवर्धन के लिए एक विशिष्ट पद्धति का वर्णन। कोशिकाओं को उनके अधिक विभेदित संततियों और जीवित रहने के एकल कक्षों के बोने निम्नलिखित प्रारंभिक चरण के दौरान पैदा करना नहीं है, जबकि सीएससी के लिए समृद्ध करने के क्रम में सीरम मुक्त, गैर पक्षपाती परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं। यह परख ट्यूमर कोशिकाओं की आबादी में मौजूद सीएससी के प्रतिशत का अनुमान किया जा सकता है। का गठन ट्यूमर क्षेत्रों के दोनों (35 से 250 माइक्रोमीटर से लेकर कर सकते हैं), जो आकार और संख्या सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं के थोक आबादी या हौसले से काटा और पच ट्यूमर 1,2 या तो में शरण सीएससी गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस परख का उपयोग करना, हम हाल ही में मेटफार्मिन चुनिंदा pancreat ablates पाया किआईसी सीएससी; बाद में आगे pluripotency जुड़े जीन / सतह मार्करों के कम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन से मंडित और मेटफार्मिन इलाज कोशिकाओं के vivo tumorigenicity में कम हो गया था कि एक खोज है। पूर्व नैदानिक विकास के लिए अंतिम कदम के रूप में हम मेटफार्मिन के साथ स्थापित ट्यूमर असर चूहों का इलाज किया है और काफी लंबे समय तक जीवित रहने पाए। PDAC के साथ रोगियों में मेटफार्मिन के प्रयोग का परीक्षण नैदानिक अध्ययन वर्तमान में चल रहे हैं (उदाहरण के लिए, NCT01210911, NCT01167738, और NCT01488552)। Mechanistically, हम मेटफार्मिन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को बढ़ाने और mitochondrial transmembrane क्षमता को कम करने से सीएससी में एक घातक ऊर्जा संकट को प्रेरित करता है कि पाया। इसके विपरीत, गैर सीएससी मेटफार्मिन उपचार से सफाया कर दिया, बल्कि प्रतिवर्ती सेल चक्र गिरफ्तारी कराना पड़ा नहीं थे। इसलिए, हमारे अध्ययन संभावित सीएससी कि लक्ष्य यौगिकों की पहचान करने के लिए एक प्रदर्शन उपकरण के रूप में इन विट्रो क्षेत्र के गठन की क्षमता के लिए एक सफल उदाहरण के रूप में कार्य करता हैहै, लेकिन इस तकनीक को झूठे खोजों को खत्म करने के लिए इन विट्रो में और vivo सत्यापन में आगे की आवश्यकता होगी।
अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता (PDAC) सबसे आक्रामक ठोस ट्यूमर में से एक है। यह वर्तमान में पश्चिमी समाज में 4 वें सबसे आम कैंसर से संबंधित मृत्यु है और (~ दुनिया भर में प्रति वर्ष 400,000 लोगों की मृत्यु) अगले एक दशक के भीतर 2 एन डी सबसे लगातार कारण करने के लिए उपस्थित रोगियों के निदान के 90% के 3 .at समय वृद्धि की भविष्यवाणी की है कम से कम 5% की एक 5 साल की उत्तरजीविता है जो उन्नत रोग, के साथ। यह जीवित रहने की दर निराश के साथ तेजी से गहन अनुसंधान गतिविधियों 4 के बावजूद पिछले 50 वर्षों में अपरिवर्तित बनी हुई है। शल्य लकीर के माध्यम से संभावित 'इलाज' की बीमारी है, जो मरीजों की शेष 10% की, 80% 5 साल के भीतर पुनरावृत्ति से मर जाएगा। कई सालों के लिए उन्नत रोग के लिए देखभाल के मानक gemcitabine monotherapy कर दिया गया है, लेकिन यह केवल एक मामूली अस्तित्व लाभ 5 प्रदान करता है। इसके अलावा द्वारा हासिल किया गया है अल्पकालिक अस्तित्व में छोटे सुधारerlotinib 6 या केपेसिटाबाइन 7 की, फिर भी उत्तरजीविता लाभ मंझला समग्र अस्तित्व अभी भी ~ 6 महीनों के साथ सप्ताह के क्रम में है। हाल ही में, अधिक उत्साहजनक परिणाम gemcitabine / NAB -paclitaxel 8 और FOLFIRINOX संयोजन शासन 9,10 के लिए उभरा है। इन उपचारों को क्रमश: एक मामूली 2 और 4 महीने से मंझला अस्तित्व में सुधार है, लेकिन बेहद जहरीला है और लंबे समय तक जीवित बचे लोगों को अभी भी एक दुर्लभ अपवाद नहीं हैं कर रहे हैं। इलाज के सुधार के लिए क्षमता प्रदान करता है, इनमें से कई मरीजों को जवाब या केवल समग्र अस्तित्व में वृद्धिशील सुधार नहीं दिखा है, जो करने के लिए विषाक्त शासनों हैं। एक परिणाम के रूप में, वर्तमान उपचारों के पूरक के लिए और उपन्यास, सबसे अधिक संभावना बहुविध चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक तत्काल आवश्यकता है।
ट्यूमर विविधता
यह कैंसर विविधता ही अलग विकासवादी subclones ढंग से करने के लिए ही सीमित नहीं है कि तेजी से स्पष्ट होता जा रहा हैएन प्रत्येक ट्यूमर 11 है, लेकिन यह भी एक subclone 12 भीतर प्ररूपी और कार्यात्मक विविधता और plasticity द्वारा संचालित। तथाकथित कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) या ट्यूमर को बढ़ावा देने कोशिकाओं intraclonal विविधता 13-16 के लिए जिम्मेदार हैं। विशेष रूप से, सीएससी वे एक कैंसर subclone 17 के भीतर सभी विभेदित संततियों को जन्म देने से रोग की जड़ का प्रतिनिधित्व करते हैं, और हम दूसरों एकल कक्ष के लिए नीचे, निर्णायक सबूत प्रदान की है, जिसके लिए कैंसर सेल के एक सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं को मेटास्टेटिक व्यवहार के लिए आवश्यक हैं और यह भी, यहां तक कि प्रारंभिक ट्यूमर प्रतिगमन (उदाहरण के लिए, एनएबी -paclitaxel) 15,18-20 उत्प्रेरण में सक्षम अपेक्षाकृत प्रभावी दवाओं के साथ, इलाज के बाद रोग पतन के लिए एक महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह सीएससी जरूरी सदाशयी स्टेम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व नहीं करते, न ही वे कई मामलों में ऊतक स्टेम कोशिकाओं से पैदा होती है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि वे ACQ हैस्टेम कोशिकाओं की कुछ विशेषताएं uired। उदाहरण सीएससी अनिश्चितकालीन आत्म नवीकरण क्षमता पारंपरिक कीमोथेरेपी के लिए उन्हें प्रतिरोधी बनाने के साथ लैस कर रहे हैं, और मेटास्टेटिक गतिविधि को बढ़ावा देता है जो invasiveness वृद्धि हुई इस शो के लिए इनमें से अधिकांश कार्यात्मक रूप में परिभाषित कर रहे हैं।
कार्यात्मक कैंसर स्टेम सेल phenotypes
सीएससी के कार्यात्मक फेनोटाइप क्रमशः धारावाहिक क्षेत्र के गठन और कॉलोनी गठन assays का उपयोग इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है, जो स्वयं को नवीनीकृत करने की क्षमता पर आधारित है। इससे भी अधिक महत्वपूर्ण बात, अधिमानतः अनन्य लंबी अवधि के tumorigenicity का संकेत धारावाहिक प्रत्यारोपण के दौरान, परम कार्यात्मक readout के रूप में विवो assays में कमजोर पड़ने सीमित द्वारा परीक्षण किया जा सकता है, जो विवो tumorigenicity में आत्म नवीकरण भालू के लिए सक्षम सीएससी। इसके अलावा, सीएससी डिब्बे के भीतर विविधता सिर्फ एक नहीं है कि मेटास्टेसिस को जन्म देने के लिए विशेष क्षमता असर सीएससी की एक विशिष्ट उप-जनसंख्या के साथ, वहाँ हैविवो tumorigenicity में उनके अनन्य का सीधा परिणाम। दरअसल, metastastitic सीएससी, प्राथमिक ट्यूमर से बचने anoikis जीवित रहते हैं और अंत में सरकाना और माध्यमिक साइटों बीज के लिए क्षमता हासिल। इन उन्नत कार्यात्मक क्षमताओं मेटास्टेसिस assays का उपयोग संशोधित आक्रमण assays और vivo में प्रयोग करने के लिए इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है।
कैंसर स्टेम कोशिकाओं का लक्ष्य निर्धारण
एक सीएससी-लक्ष्य रणनीति 21 के साथ संयुक्त जब तक हम और दूसरों को उपचार भी स्ट्रोमा-लक्ष्य एजेंटों के साथ संयोजन में, विभेदित PDAC कोशिकाओं के थोक ट्यूमर पर ध्यान केंद्रित कर रहा है कि ठोस सबूत उपलब्ध कराई है, ट्यूमर प्रगति और बाद के परिणाम पर एक बड़ा असर नहीं है, 22। इस प्रकार, रोग प्रगति और उपचार के लिए प्रतिरोध में सीएससी के महत्वपूर्ण कार्यों के आधार पर, इन कोशिकाओं को किसी भी उपन्यास उपचार दृष्टिकोण 18,20 के लिए एक आवश्यक घटक दर्शाता चाहिए, लेकिन एक और अधिक पूरी तरह से समझ ओ की आवश्यकता होगीसीएससी के नियामक मशीनरी च। सीएससी और उनके अधिक विभेदित संततियों आनुवंशिक परिवर्तन के संबंध में समान आनुवंशिक जमीन राज्यों सहन हालांकि, सीएससी अलग है और इस तरह epigenetically निर्धारित जीन अभिव्यक्ति स्टेम कोशिकाओं के साथ कि शेयर मॉड्यूल प्रोफाइल दिखा रहे हैं। सृजन प्रेरित स्टेम सेल (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) में शामिल जीनों में से अधिकांश केवल कैंसर से जुड़ा हुआ नहीं किया गया है, लेकिन उनकी अभिव्यक्ति ज्यादातर सीएससी कम्पार्टमेंट के लिए प्रतिबंधित है। इसके अलावा, सीएससी को लक्षित करने के लिए आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर नुकसान के समारोह प्रयोगों द्वारा सीएससी के कार्यात्मक प्रासंगिकता अब मजबूती से कई प्रकार के कैंसर 23-25 के लिए सीएससी अवधारणा की स्थापना की है। इन तरीकों में से ज्यादातर के माउस मॉडल पर आधारित है और इस तरह आसानी से क्लिनिक में हस्तांतरणीय नहीं कर रहे हैं, वे थोक ट्यूमर कोशिकाओं के साथ संयोजन में सीएससी को निशाना बनाने का संभावित नैदानिक प्रासंगिकता के लिए सबूत की अवधारणा प्रदान करते हैं।
छठी में कैंसर स्टेम कोशिकाओं का अध्ययनTRO उनकी दुखती रग को पहचानें
सीएससी को लक्षित करने के लिए नए और चिकित्सकीय लागू तरीकों की पहचान करने के लिए, उनकी सुविधाओं को नियमित रूप से इन विट्रो में अध्ययन कर रहे हैं और क्षेत्र के गठन के लिए व्यापक रूप से इस संदर्भ में प्रयोग किया जाता है। मूल रूप से आत्म नवीकरण और भेदभाव क्षमता सहित सामान्य स्टेम कोशिका जीव विज्ञान, अध्ययन के लिए विकसित की है, इस परख के बाद में इन विट्रो में सीएससी का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया था और PDAC 20 से पृथक सीएससी की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम इसलिए वे सदाशयी अग्नाशय सीएससी 21 होते हैं, यह दर्शाता प्राथमिक मानव PDAC कोशिकाओं से बनाई ट्यूमर क्षेत्रों सीएससी के सभी विशिष्ट सुविधाओं सहन कि मिल गया है। इस प्रकार, ट्यूमर क्षेत्र परख इन विट्रो में और अधिक प्रभावी उपचार के लिए स्क्रीन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन परिणाम आगे विवो assays में और अधिक कठोर में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। दरअसल, इस में इन विट्रो परख के साथ उत्पन्न डेटा वें के रूप में बड़ी सावधानी के साथ व्यवहार किया जाना चाहिएई परख महत्वपूर्ण त्रुटि के अधीन किया जा सकता है। का गठन क्षेत्रों के स्वचालित गिनती सहित अत्यधिक मानकीकृत प्रोटोकॉल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और भविष्य कहनेवाला डेटा सुनिश्चित करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए।
इस संदर्भ में, हम हाल ही में प्राथमिक मानव PDACs की एक विविध सेट से ली गई अग्नाशय सीएससी स्क्रीन करने के लिए इस परख के लिए इस्तेमाल किया और इन कोशिकाओं विरोधी मधुमेह यौगिक मेटफार्मिन द्वारा चयापचय reprogramming के लिए अत्यधिक जोखिम रहता है कि पता चला है। इससे पहले, मेटफार्मिन एएमपी सक्रिय प्रोटीन काइनेज (AMPK) संकेत और कम प्रोटीन संश्लेषण और सेल प्रसार 27 में जिसके परिणामस्वरूप mTOR 26 के बाद के निषेध के अप्रत्यक्ष सक्रियण द्वारा कैंसर सेल के विस्तार को बाधित करने के लिए प्रदर्शन किया गया था। थोक ट्यूमर आबादी पर इन प्रभावों के अलावा, और हम दूसरों मेटफार्मिन लक्ष्य है और वास्तव में इस तरह स्तन, कैंसर, ग्लियोब्लास्टोमा और अग्नाशय के कैंसर 28-31 <रूप में ठोस ट्यूमर की संख्या में सीएससी उप-जनसंख्या को खत्म करने में सक्षम है कि मिल गया है/ Sup>। इस प्रकार, मेटफार्मिन वर्तमान unmet की चिकित्सा की जरूरत के साथ कई तरह के कैंसर के लिए एक होनहार और सुरक्षित नई चिकित्सकीय रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, सीएससी के लिए समृद्ध करने के लिए एक रास्ते के रूप में क्षेत्र के गठन का उपयोग करते हुए, हम अग्नाशय सीएससी पर मेटफार्मिन का प्राथमिक प्रभाव AMPK सक्रियण के स्वतंत्र और ज्यादातर जाहिरा तौर पर सबसेट के लिए घातक था, जो (जटिल मैं के निषेध के माध्यम से) अपनी विनम्र माइटोकॉन्ड्रियल विषाक्तता पर भरोसा था कि पता चला सीएससी की ही। बाद के लिए हम सेलुलर स्तर पर दवा की विषाक्तता के संकेतक के रूप में उनके सेलुलर ऑक्सीजन की खपत और mitochondrial आरओएस उत्पादन का आकलन करने में सक्षम थे। इसके बाद इन में इन विट्रो डेटा क्लिनिक पूर्व माउस मॉडल में मान्य है और वास्तव में काफी अस्तित्व के 31 लंबे समय तक के परिणामस्वरूप किया जा सकता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत कार्यप्रणाली सीएससी चयापचय पर उनके प्रभाव पर अध्ययन सहित सीएससी के लिए दवा संवेदनशीलता प्रोफाइल, के तेजी से उत्पादन के लिए अनुमति देता है। अब हम उपयोग किया कॉम के बारे में प्रयोगात्मक विवरण बढ़ाया प्रदानplementary इन विट्रो में और vivo प्रक्रियाओं में।
कई ट्यूमर के लिए सीएससी अवधारणा के उद्भव और बाद के सत्यापन के साथ, नशीली दवाओं के विकास के क्षेत्र में और अधिक कुशल कैंसर के उपचार विकसित करने और बाद में बीमारी पतन के लिए जोखिम को कम करने के लिए क्षमता के साथ, नई रफ्तार पकड़ ली है। हालांकि, सीएससी क्षेत्र समझ सीएससी मूल और प्रसार, और ट्यूमर वास्तुकला को आकार देने और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने में उनकी भूमिका के संदर्भ में प्राप्त किया जा करने के लिए एक प्रारंभिक राज्य और अधिक करने की जरूरत पर अब भी है।
इस संदर्भ में, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सार्थक सीएससी assays के उपयोग के रूप में अच्छी तरह से प्राप्त आंकड़ों के बारे में सूचित व्याख्या सीएससी जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व करता है। कई जैविक दृष्टिकोण से, गोला गठन एक बहुत ही मूल्यवान परख के रूप में उभरा है; फिर भी उपयोगकर्ताओं को ठीक से उनके प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या करने के क्रम में अपनी सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए। एक महत्वपूर्ण पहलू भी क्षेत्र प्रपत्र के मूल्यांकन से पहले विचार करने के लिएताजा रोगी व्युत्पन्न नमूनों से प्राप्त परिणामों की स्थापना कैंसर कोशिका लाइनों से प्राप्त उन लोगों से काफी अलग हो सकता है के बाद से tion के डेटा की जांच नमूने का मूल है।
क्लासिक क्षेत्र गठन assays के ultralow लगाव प्लेटों में प्रतिरूप घनत्व में कोशिकाओं को बोने और epidermal वृद्धि कारक की उपस्थिति (EGF) और / या समृद्ध बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (ख FGF) में क्षेत्र के गठन का मूल्यांकन, लेकिन सीरम मुक्त माध्यम से 21 शामिल 34। संस्कृति के माध्यम रचना भी विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। हमारे अनुभव में हम सीरम के अभाव में B27, bFGF और glutamine के साथ पूरक DMEM / F12 समान परिस्थितियों में सीएससी, बढ़ने का विस्तार करने और बनाए रखने के लिए एक इष्टतम मध्यम था पाया। हम इस संस्कृति हालत (मध्यम और निलंबन) में कोशिकाओं (CD133 + CD44 + और CD24 + सहित) कैंसर स्टेम सेल मार्कर की उच्च मात्रा में व्यक्त करते हैं और (सी के भेदभाव से जुड़े प्रोटीन व्यक्त नहीं कर पाया-20 और सी -19)।
इन assays के लिए मौलिक मान्यताओं में से एक प्रत्येक क्षेत्र यानी, एक क्षेत्र में एक ही स्टेम सेल के विस्तार का परिणाम है, प्रतिरूप है। हालांकि, क्षेत्रों कम बोने घनत्व 35 की उम्र में भी फ्यूज होने का खतरा है कि गतिशील संरचनाओं आंतरिक रूप से कर रहे हैं। चढ़ाना कोशिकाओं प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है और निश्चित रूप से एकत्रीकरण मुद्दे को दरकिनार कर सकते हैं अच्छी तरह से एक सेल / का घनत्व है। लेकिन फिर भी भावी छाँटे गए पूर्वज के लिए, यह नियमित रूप से कम होने के कारण आंतरिक क्षेत्र गठन गतिविधि के लिए बहुत कम क्षेत्र के गठन में परिणाम और भी कारण कमजोर पड़ने के प्रभाव को सीमित autocrine उत्तेजना के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हमारे अनुभव में हम चढ़ाया कोशिकाओं का केवल 30% क्षेत्रों के रूप में सक्षम हैं कि मनाया। हम लगातार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से कम से कम 100 कोशिकाओं / का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
विकास सीएससी के लिए दूसरे की संस्कृति के तरीकों मीटर पर आधारित है, जैसे ठोस या अर्द्ध ठोस 3 डी संस्कृतियों (के आधार पर कर रहे हैंatrigel, मज्जा या methylcellulose)। इन विधियों सेल गतिशीलता और बाद में सेल एकत्रीकरण 36 सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन matrices के प्रत्येक अपनी सीमाओं भालू। उदाहरण के लिए, Matrigel एक घुलनशील तहखाने Engelbreth-होल्म-हंस (EHS) से अलग झिल्ली ट्यूमर है और निकालने के कई ऊतकों में पाया जटिल कोशिकी ट्यूमर वातावरण जैसा दिखता है, हालांकि, यह अक्सर यंत्रवत renders जो कई और अधिक या कम परिभाषित वृद्धि कारकों को नियंत्रित करता है बहुत मुश्किल विशिष्ट नियामक तत्वों के लिए अध्ययन करता है। विचार का एक और मुद्दा क्षेत्र बनाने की क्षमता और स्टेम सेल कार्यों विनिमेय शर्तों 34 नहीं हो रहा है। कुछ स्टेम और मूल कोशिकाओं में vivo स्टेम / पूर्वज समारोह बाहर नहीं है इन विट्रो में क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए क्षेत्र के गठन की क्षमता 37, विफलता प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है जबकि। उदाहरण के लिए, मौन स्टेम कोशिकाओं बस द्वारा प्रदान की कोशिकी संकेतों का जवाब नहीं हो सकता हैइन विट्रो संस्कृति की स्थिति में नहीं चुना गया। इस प्रकार, इन विट्रो में और अधिमान्यतया धारावाहिक passaging के दौरान शुद्ध सेल आबादी के विवो आत्म नवीकरण क्षमता में लंबे समय तक, साबित या स्टेम सेल समारोह का खंडन करने के क्रम में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। इस संदर्भ में, भावी और साथ ही स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के विविध आबादी का प्रचार करने की क्षमता क्षेत्र के गठन परख का एक महत्वपूर्ण पहलू है और सीएससी क्षेत्र के लिए अत्यधिक मूल्यवान इस परख renders; के रूप में लंबे समय से अपनी सीमाओं को प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या के लिए ध्यान में रखा जाता है।
क्षेत्र के गठन assays के लिए व्यापक रूप से पूर्वव्यापी इन विट्रो में एकल कोशिका के स्तर पर आत्म नवीकरण और भेदभाव के लिए अपनी क्षमता के आधार पर स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उनके इन विवो आला से भावी स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और उनकी संतान की अनुमति है कि मार्कर की खोज के शुद्ध आबादी के कार्यात्मक संपत्तियों परिभाषित करने की अनुमति देता है। सीक्षेत्र के गठन की परख की ombination और FACS ठोस ऊतकों से कोशिकाओं को अलग या संस्कृति में PDAC के विशिष्ट उप-जनसंख्या को समृद्ध करने के लिए एक सफल रणनीति है। मूल ट्यूमर की विविधता को दर्शाती है, आत्म नवीकरण, अंतर और एक ट्यूमर आरंभ: उदाहरण के लिए, EpCAM, CD24 और CD44 के एक साथ अभिव्यक्ति करने में सक्षम सीएससी की एक उप-जनसंख्या को परिभाषित करता है। हरमन एट अल। CD133 + कोशिकाओं संवर्धित proliferative क्षमता के पास थी और सीएससी 15 कि सुविधाओं दिखाया। अन्य मार्करों भी सीएससी के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है: ALDH- 1 (एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज-1) अभिव्यक्ति अग्नाशय के कैंसर के 38 में अत्यधिक tumorigenic कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है; डीएनए डाई Hoechst 33342 बाहर करने के लिए सक्षम कोशिकाओं, नामित पक्ष आबादी (सपा) की कोशिकाओं, ट्यूमर 39 आरंभ साबित हुई क्षमता है। हाल ही में हम एक subcellular autofluorescence डिब्बे अलग ट्यूमर प्रकार भर में विशेष सीएससी लक्षण के साथ मानव कोशिकाओं की एक विशिष्ट जनसंख्या की विशेषता है कि पता चलाइन मार्करों में से कोई भी चुनिंदा सीएससी की एक शुद्ध आबादी चिह्नित करने के लिए प्रकट होता है हालांकि कोशिकाओं के और अधिक परिष्कृत आबादी को शुद्ध 40।, मार्कर का अधिक से अधिक जटिल संयोजन FACS के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है।
कई सवाल अभी भी ट्यूमर की उत्पत्ति, प्रगति, और नशीली दवाओं के प्रतिरोध में सीएससी की सटीक भूमिका के बारे में रहते हैं। उदाहरण के लिए, एक सीएससी एक ट्यूमर शुरू की अगर और कैसे परिभाषित करने के लिए क्लोनल विकास के सवाल को संबोधित करने के लिए एक ही रास्ता है, रोग के विभिन्न चरणों में रोगी के नमूने का विश्लेषण है, और विशेष रूप से के दौरान और बाद में इलाज सीएससी की संख्या का पालन करने के लिए हो सकता है। इन सवालों का जवाब देने के द्वारा, हम ठोस ट्यूमर में सीएससी के हमारे ज्ञान का सार्थक प्रगति बनाने के लिए और अंततः ट्यूमर प्रगति और पतन को रोकने के लिए दवा के उपचारों का विकास कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
वर्तमान अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया एक ईआरसी उन्नत अन्वेषक अनुदान (पा-सीएससी 233,460), अनुदान समझौता नहीं 256,974 (ईपीसी टीएम-नेट) और कोई 602,783 (सीएएम-पीएसी के तहत यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) ), Subdirección जनरल डी Evaluación Y FOMENTO डे ला Investigación, Fondo डे Investigación SANITARIA (PS09 / 02,129 और PI12 / 02,643), और Programa नैशनल डे Internacionalización डे ला मैं + डी, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio डे अर्थशास्त्र Y Competitividad, स्पेन)। ई Lonardo रॉश फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। एम Cioffi ला Caixa predoctoral फैलोशिप कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया।
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |