Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
Bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) inneholder et delsett av utelukkende tumorigene kreft stamceller (cscs) som har vist seg å kjøre startfasen, metastaser og motstand mot radio- og kjemoterapi. Her beskriver vi en bestemt metodikk for dyrking primære humane bukspyttkjertelen cscs som kreftkuler i forankringsuavhengig forhold. Celler dyrkes i serum-fri, ikke-heftende forhold for å berike for cscs mens deres mer differensierte progenies ikke overlever og sprer i den innledende fasen etter såing av enkeltceller. Denne analysen kan brukes til å anslå andelen av cscs er tilstede i en populasjon av tumorceller. Både størrelsen (som kan variere 35-250 mikrometer) og antallet tumor sfærer dannes representerer CSC aktivitet holdes i enten bulk populasjoner av dyrkede cancerceller eller nyhøstede og spaltet tumorer 1,2. Ved hjelp av denne analysen, vi nylig funnet ut at metformin selektivt ablates pancreatic cscs; et funn som senere ble ytterligere bekreftet ved å demonstrere redusert uttrykk for pluripotency assosierte gener / overflatemarkører og redusert in vivo tumorigenicity av metformin-behandlede celler. Som det siste trinnet for preklinisk utvikling vi behandlet mus med etablerte svulster med metformin og fant signifikant forlenget overlevelse. Kliniske studier teste bruk av metformin hos pasienter med PDAC er for tiden i gang (f.eks NCT01210911, NCT01167738, og NCT01488552). Mekanistisk, fant vi at metformin induserer en fatal energikrise i cscs ved å styrke reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon og redusere mitokondrie transmembrane potensial. I motsetning til dette, var ikke-cscs ikke elimineres ved behandling metformin, men snarere gikk reversible cellesyklus-stans. Derfor serverer vår studie som et vellykket eksempel på potensialet for in vitro sfære formasjon som et screeningverktøy for å identifisere stoffer som potensielt er rettet mot CSCs, men denne teknikken vil kreve ytterligere in vitro og in vivo validering for å eliminere falske funn.
Bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) er en av de mest aggressive solide tumorer. Det er i dag den 4. vanligste kreftrelaterte dødsfall i vestlige samfunn, og er spådd å stige til 2 nd hyppigste årsaken løpet av det neste tiåret (~ 400.000 dødsfall per år på verdensbasis) 3 .På diagnosetidspunktet 90% av pasientene til stede med langt fremskreden sykdom, som har en 5 års overlevelse på mindre enn 5%. Denne overlevelsesraten har skuff uendret de siste 50 årene til tross for stadig mer intensive forskningsvirksomhet 4. Av de resterende 10% av pasienter som har potensielt 'herdbare' sykdom gjennom kirurgisk reseksjon, vil 80% dø av tilbakefall i løpet av 5 år. For mange år standard vare for avansert sykdom har vært gemcitabin monoterapi, men dette bare ensidige marginal overlevelse fordel 5. Små forbedringer i kortsiktig overlevelse er oppnådd ved tilsettingav erlotinib 6 eller kapecitabin 7, men overlevelsesgevinst er i størrelsesorden uker med median total overlevelse still ~ 6 måneder. Nylig har flere oppmuntrende resultater dukket opp for gemcitabin / nab -paclitaxel 8 og FOLFIRINOX kombinasjon regime 9,10. Disse behandlingene forbedre median overlevelse ved en beskjeden 2 og 4 måneder henholdsvis, men er svært giftige og langsiktige overlevende er fortsatt et sjeldent unntak. Selv om behandling tilbyr muligheter for forbedring, disse er giftige regimer som mange pasienter ikke responderer eller bare viser trinnvis forbedring i total overlevelse. Som en konsekvens av dette, er det et sterkt behov for å supplere dagens behandlingsformer og for å utvikle nye, mest sannsynlig multimodale terapeutiske tilnærminger.
Tumor Heterogenitet
Det blir stadig tydeligere at kreft heterogenitet er ikke bare begrenset til distinkte evolusjonære subkloner within hver tumor 11, men også drevet av fenotypiske og funksjonell heterogenitet og plastisitet i hver subklon 12. Såkalte kreft stamceller (cscs) eller tumor fremme cellene er ansvarlige for intraclonal heterogenitet 13-16. Nærmere bestemt cscs representerer en undergruppe av kreftcelle, som vi og andre har gitt bevis, ned til én celle, at de representerer roten av sykdommen ved å gi opphav til alle differensierte progenies innenfor hver kreft subklon 17. Enda viktigere, disse cellene er viktig for metastatisk atferd og også representerer en viktig kilde til sykdom tilbakefall etter behandling, selv med relativt effektive legemidler som kan indusere initial tumor regresjon (f.eks nab -paclitaxel) 15,18-20. Det er viktig å merke seg at cscs ikke nødvendigvis representerer bona fide stamceller, heller ikke de oppstår fra vev stamceller i mange tilfeller, men heller de har ACQuired visse funksjoner på stamceller. De fleste av disse er funksjonelt definert, for eksempel cscs er utstyrt med ubestemt selvfornyelse kapasitet som gjør dem motstandsdyktige mot konvensjonell kjemoterapi, og viser økt invasivitet som fremmer metastatisk aktivitet.
Funksjonelle Cancer Stem Cell fenotyper
Den funksjonelle fenotypen cscs er basert på deres evne til å fornye seg selv, som kan testes in vitro ved å bruke serielle kuledannelse og kolonidannelse assays respektivt. Enda viktigere er cscs stand til selvfornyelse bear in vivo tumordannelse som kan testes ved begrensende fortynning in vivo, som det endelige funksjonelle avlesning, fortrinnsvis i løpet av serietransplantasjon indikativt for eks langvarig tumorgenisitet. Videre er det heterogenitet innenfor CSC rommet, med en distinkt undergruppe cscs bærer den eksklusive evne til å gi opphav til metastaser som ikke bare er endirekte konsekvens av deres eksklusive in vivo tumorgenisitet. Faktisk metastastitic cscs få muligheten til å unndra den primære svulsten, overlever anoikis og til slutt translocate og frø sekundære områder. Disse avanserte funksjonsevne kan testes in vitro ved bruk av modifiserte invasjon analyser og in vivo ved hjelp av metastase analyser.
Målretting kreftstamceller
Vi og andre har gitt overbevisende bevis for at behandlinger med fokus på bulk svulst differensierte PDAC celler, også i kombinasjon med stromaceller målretting midler, ikke har en stor innvirkning på tumorprogresjon og påfølgende utfall med mindre kombinert med en CSC-målrettingsstrategien 21, 22. Således, basert på den avgjørende funksjoner av cscs i sykdomsprogresjon og motstand mot behandling, bør disse cellene betegne en essensiell komponent for en hvilken som helst ny behandling tilnærming 18,20, men vil kreve en mye mer grundig forståelse of regulatoriske maskineri av cscs. Selv cscs og deres mer differensierte progenies bære identiske genetiske grunntilstander med hensyn til genetiske endringer, cscs utviser tydelig og dermed epigenetiske bestemt genuttrykk profiler som deler moduler med pluripotente stamceller. De fleste av de gener som er involvert i å generere induserte pluripotente stamceller (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) har ikke bare vært knyttet til kreft, men deres uttrykk er stort sett begrenset til cscs rommet. Dessuten har den funksjonelle relevansen av cscs ved tap-av-funksjon eksperimenter ved hjelp av genetiske verktøy for målretting cscs nå godt etablert CSC konsept for flere krefttyper 23-25. Mens de fleste av disse metodene er basert på musemodeller og dermed ikke er lett overførbar til klinikken, gir de proof-of-concept for den potensielle kliniske relevansen av målretting cscs i kombinasjon med bulk tumorceller.
Studere kreftstamceller i Vitro å identifisere sine akilleshæl
For å identifisere nye og klinisk relevante metoder for målretting cscs, er deres egenskaper regelmessig undersøkt in vitro, og sfære dannelse er mye brukt i denne sammenheng. Opprinnelig utviklet for å studere normal stilk cellebiologi, inkludert selvfornyelse og differensiering kapasitet, ble dette assay senere tilpasset for å studere cscs in vitro, og har vært brukt for å undersøke cscs isolert fra PDAC 20. Vi har funnet ut at kreftkuler dannet fra primære humane PDAC celler bære alle de forskjellige funksjonene i cscs, derfor angir de inneholder bona fide bukspyttkjertelen cscs 21. Dermed representerer svulsten sfære analysen et kraftig verktøy for å skjerm for mer effektive behandlinger in vitro, men resultatene må vurderes nærmere i strengere in vivo. Faktisk, bør data generert med denne in vitro analysen behandles med stor forsiktighet som the assay kan bli utsatt for betydelige feil. Standardiserte protokoller, inkludert automatisert telling av dannet kuler, bør etableres for å sikre reproduserbare og prediktive data.
I denne sammenheng har vi nylig brukte denne analysen for å screene pancreatic cscs avledet fra et variert sett av primære humane PDACs og viste at disse cellene er svært sårbare for metabolsk omprogrammering av antidiabetisk forbindelse metformin. Tidligere metformin blitt demonstrert å hemme kreftcelle ekspansjon ved indirekte aktivering av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) signalering og påfølgende inhibisjon av mTOR 26, noe som resulterer i redusert proteinsyntese og 27 celleproliferasjon. I tillegg til disse effekter på tumordelen populasjonen, har vi og andre funnet at metformin er i stand til å målrette og faktisk eliminere cscs subpopulasjon i en rekke faste tumorer så som bryst, spiserørskreft, glioblastom og kreft i bukspyttkjertelen 28-31 </ Sup>. Dermed representerer metformin en lovende og trygg ny terapeutisk strategi for flere kreftformer med tiden udekket medisinsk behov. Videre bruker sfære formasjon som en måte å berike for cscs, vi viste at metformin primære effekt på bukspyttkjertel cscs var uavhengig av AMPK aktivering og stolte for det meste på sin beskjedne mitokondrietoksisitet (via hemming av komplekse I), som tilsynelatende var dødelig for den delen av cscs bare. For sistnevnte kunne vi vurdere sin cellulær oksygenforbruk og mitokondrielle ROS produksjon som indikatorer på stoffets giftighet på cellenivå. Deretter kan disse in vitro data valideres i prekliniske musemodeller og faktisk resulterte i signifikant forlenget overlevelse 31. Metodikken som presenteres her gir mulighet for rask generasjon av narkotika følsomhets profiler for cscs, inkludert studier på deres virkninger på CSC metabolisme. Vi tilbyr nå utvidet eksperimentelle detaljer om den benyttede comleggs in vitro og in vivo fremgangsmåter.
Med fremveksten og påfølgende validering av CSC konsept for mange svulster, har feltet narkotika utvikling fått ny giv, med potensial for å utvikle mer effektive kreft behandlinger og deretter redusere risiko for sykdom tilbakefall. Imidlertid er CSC-feltet fortsatt i en tidlig stat og mer må gjøres i form av forståelse CSC opprinnelse og utbredelse, og deres rolle i utformingen av svulsten arkitektur og fremme metastaser.
I denne sammenheng er bruken av reproduserbare og meningsfylte CSC assays samt informert tolkningen av oppnådde data er en viktig komponent for å fremme forståelsen av CSC biologi. Fra mange biologiske perspektiver, har sfære formasjon dukket opp som en svært verdifull analyse; likevel brukere bør være klar over sine begrensninger for å tolke sine eksperimentelle resultater. Et viktig aspekt å vurdere selv før evaluering av sfæren formasjon data er opprinnelsen til den undersøkte prøven, siden resultatene som oppnås fra ferske pasientavledet prøver kan bli betydelig forskjellig fra de som oppnås fra etablerte kreftcellelinjer.
Klassiske sfære formasjons analyser involverer såing celler ved klonal tetthet i ultralav-festeplater og evaluering av kuledannelse i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og / eller basisk fibroblast vekstfaktor (b-FGF) anriket, men serumfritt medium 21, 34. Dyrkingsmediumet sammensetning er også en viktig sak å vurdere. Etter vår erfaring har vi funnet at DMEM / F12 supplert med B27, bFGF og glutamin i fravær av serum var en optimal medium til å vokse, utvide og opprettholde CSC i udifferensierte forhold. Vi fant ut at i denne kulturen tilstand (medium og suspensjon) cellene uttrykker store mengder kreftstamcellemarkører (inkludert CD133 +, CD44 + og CD24 +) og uttrykker ikke differensieringsassosierte proteiner (CK-20 Og CK-19).
En av de grunnleggende forutsetningene for disse analysene er at hver sfære er klonal, dvs. resulterer en sfære fra utvidelsen av en enkelt stamcelle. Men kulene er egentlig dynamiske strukturer som er tilbøyelige til å smelte selv ved lav seeding tetthet 35. Plating celler er et kritisk trinn i protokollen og tettheten av en celle / brønn kan sikkert omgå problemet aggregering. Men selv for prospektivt sortert stamfedre, dette regelmessig resulterer i svært lav sfære dannelse på grunn av lav indre sfære dannelse aktivitet og kan også tilskrives begrenset autocrine stimulering på grunn av utvanningseffekter. Etter vår erfaring er observert at bare 30% av cellene sådd er i stand til å danne kuler. Vi anbefaler å bruke minst 100 celler / brønn for å oppnå konsistente og reproduserbare resultater.
Andre metoder for vekst dyrknings CSC er basert på fast eller halvfast 3D kulturer (f.eks, basert på matrigel, kollagen eller metylcellulose). Disse metoder er blitt brukt for å begrense cellemobilitet og påfølgende celle 36 aggregering. Imidlertid bærer hver av disse matriser sine egne begrensninger. For eksempel, er en oppløselig matrigel basalmembran isolert fra Engelbreth-Holm-Swan (HMS) tumor, og selv om ekstraktet ligner den komplekse ekstracellulære tumor miljø som finnes i mange vev, kan det inneholde flere mer eller mindre definerte vekstfaktorer som ofte gjengir mekanistisk studier for spesifikke regulatoriske elementer meget vanskelig. En annen vurdering er at sfære dannende kapasitet og stamcelle funksjoner er ikke utskiftbare termer 34. Mens visse stamceller og forløperceller har vist seg å oppvise sfære-dannende evne 37, manglende evne til å generere sfærene in vitro utelukker ikke in vivo stammen / progenitor funksjon. For eksempel kan stille stamceller rett og slett ikke svare på de ekstracellulære signaler gitt avselektert in vitro dyrkningsbetingelser. Dermed langsiktig in vitro og in vivo selvfornyelse kapasitet på rensede cellepopulasjoner, fortrinnsvis i løpet av serieaging, bør vurderes for å bevise eller motbevise stamcellefunksjon. I denne sammenheng, er evnen til å prospektivt og samtidig forplante forskjellige populasjoner av stamceller og forløperceller et viktig aspekt av sfæren dannende analyse og gjør denne analysen svært verdifull for CSC felt; så lenge dens begrensninger holdes i tankene for tolkningen av de oppnådde data.
Sphere dannende analyser har blitt mye brukt til å retrospektivt identifisere stamceller basert på deres evne til selvfornyelse og differensiering på celle-nivå in vitro. Oppdagelsen av markører som tillater den potensielle isolering av stamceller og deres avkom fra deres in vivo nisje kan de funksjonelle egenskapene til rensede populasjoner som skal defineres. Combination av sfære formasjon analysen og FACS er en vellykket strategi for å isolere celler fra solid vev eller berike spesifikke subpopulasjoner av PDAC i kultur. For eksempel, samtidig ekspresjon av EpCAM, CD24 og CD44 definerer en subpopulasjon av cscs kunne: selvfornyelse, differensiere og initiere en tumor, som reflekterer heterogeniteten av den opprinnelige tumor. Hermann et al. viste at CD133 + celler besatt augmented proliferativ kapasitet og CSC har 15. Andre markører har også vært anvendt for karakterisering av cscs: ALDH- 1 (aldehyd dehydrogenase-1) ekspresjon er assosiert med høyt tumorigene celler i bukspyttkjertelen 38; cellene i stand til å utelukke DNA dye Hoechst 33342, oppkalt side befolkningen (SP) celler, har bevist kapasitet til å initiere svulster 39. Nylig viste vi at en subcellulære autofluorescence rommet karakteriserer en distinkt populasjon av humane celler med eksklusive CSC trekk på tvers av ulike krefttyper40. Selv om ingen av disse markørene virker til selektivt å karakterisere en ren populasjon av cscs, mer og mer komplekse kombinasjoner av markører må brukes for å rense FACS mer raffinerte populasjoner av celler.
Mange spørsmål gjenstår om den nøyaktige rollen cscs i opprinnelse, progresjon, og stoffet motstand av svulster. For eksempel, en måte å løse spørsmålet om klonal evolusjon definere om og hvordan en enkelt CSC initierer en svulst, kan være å analysere pasientprøver ved forskjellige stadier av sykdommen, og spesielt å følge antallet cscs under og etter behandling. Ved å svare på disse spørsmålene, kan vi gjøre menings fremdriften av vår kunnskap om cscs i solide svulster og utvikle medisinsk behandling til slutt hindre tumorprogresjon og tilbakefall.
The authors have nothing to disclose.
Den nåværende forskningen ble støttet av en ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233 460), Det europeiske fellesskap syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskuddsavtalen No 256974 (EPC-TM-NET) og No 602783 (CAM-PAC ), den Subdirección General de Evaluación y Fomento de la INVESTIGACION, Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (PS09 / 02129 og PI12 / 02643), og Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de economía y Competitividad, Spania). E. Lonardo ble støttet av Roche Fellowship. M. Cioffi ble støttet av La Caixa Predoctoral Fellowship Programme.
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |