Abstract
Incapsulamento delle cellule è stato sviluppato per intrappolare cellule vitali all'interno delle membrane semi-permeabili. Le cellule incapsulate trapiantate possono scambiare metaboliti a basso peso molecolare in tessuti dell'ospite trattato per conseguire sopravvivenza a lungo termine. La membrana semipermeabile permette innestato cellule incapsulate per evitare il rigetto da parte del sistema immunitario. La procedura di incapsulamento è stato progettato per consentire un rilascio controllato di composti bioattivi, come l'insulina, altri ormoni e citochine. Qui si descrive un metodo per l'incapsulamento di cellule catabolici, che consumano lipidi per la produzione di calore e la dissipazione di energia (termogenesi) nel tessuto adiposo intra-addominale di topi obesi. L'incapsulamento di cellule catabolici termogenica potrebbe essere potenzialmente applicabili alla prevenzione e il trattamento dell'obesità e il diabete di tipo 2. Un'altra potenziale applicazione di cellule catabolici può includere la disintossicazione da alcool o altri metaboliti tossici e inquinanti ambientali.
Introduction
L'aumento dell'incidenza delle malattie croniche 1 ha stimolato studi sul trapianto di popolazioni di cellule terapeutiche 2. Le cellule staminali singenici o allogeniche sono i tipi di cellule più comunemente usati per queste applicazioni 2. Tuttavia, questi trattamenti non consentono il controllo della differenziazione e migrazione delle cellule staminali dopo l'impianto e non sono convenienti. Il trapianto di cellule geneticamente modificate con funzioni benefiche anticipa migliorare il trattamento di molte malattie. Tuttavia, le modifiche genetiche di cellule vengono riconosciuti dal sistema immunitario dell'ospite, quindi, questi trattamenti richiedono immunosoppressione 3. L'incapsulamento di cellule che producono l'insulina è stato sviluppato dal Dr. Chang 4. La tecnica si basa sulla incapsulamento delle cellule in goccioline alginato che vengono immerse in una soluzione di cloruro di calcio. Molecole alginato consistono di acido mannuronico (M) e guluronico (G) e possono essere collegati da Ca 2+. Dopo gelificazione, le perle sono sospese una soluzione di poli-L-lisina (PLL). Durante questa fase, PLL lega al G e M nelle molecole alginato che stabilisce membrana della capsula. La porosità della membrana della capsula può essere modulata variando le concentrazioni M e PLL, il tempo di incubazione, e la temperatura. Il legame del PLL dipende anche dal tipo e dalla concentrazione di alginato. Matrici alginato reticolato con ioni Ca 2+, sono instabili in ambiente fisiologico o in soluzioni tampone comuni con alta concentrazione di fosfato e ioni citrato. Questi buffer possono estrarre Ca 2+ dal alginato e liquefare il nucleo. Liquefazione del nucleo alginato fornisce spazio all'interno delle capsule per il movimento e la crescita cellulare. Cellule incapsulate in alginato polyanionic con policationico poli-L-lisina (APL) sono impermeabili per immunoglobuline ma hanno afflusso di nutrienti e l'efflusso di tossine. Queste proprietà consentono APL lungo termine survival di cellule incapsulate dopo il trapianto in host geneticamente diverse. Elliott et al. Riportato la sopravvivenza di funzionamento delle cellule pancreatiche suina incapsulati in un paziente umano nove anni dopo l'impianto 5.
Tecniche di incapsulamento possono essere classificati in microincapsulazione (3-800 micron) e macroincapsulazione (maggiore di 1000 micron). Le microcapsule sono più durevoli macrocapsules 6. Fin dalla sua scoperta dal Dr. Chang e colleghi nel 1964, microincapsulazione è stato ampiamente utilizzato per l'incapsulamento delle cellule anabolizzanti che producono insulina, altri ormoni e molecole bioattive 7. Questi trattamenti hanno affrontato diverse sfide nel tessuto ospite tra cui la fibrosi e la risposta immunitaria 8. Inizialmente, gli effetti collaterali legati alla qualità dei biopolimeri sono stati risolti. Tuttavia, il trapianto di cellule anabolizzanti avvia ancora effetti collaterali, quali la fibrosi, come risultato di ormone overproduzione di fuori di una ghiandola specializzata.
Negli ultimi decenni, l'obesità e il diabete di tipo 2 ha raggiunto proporzioni epidemiche 9. Più del 30% delle persone adulte in tutto il mondo sono in sovrappeso e obesi 10. Aumento intra-addominale (IAB) la formazione di grasso aumenta l'incidenza di infiammazione cronica e promuove diabete di tipo 2, le malattie cardiovascolari, alcuni tipi di cancro, e di altre patologie 11-13. Molte evidenze suggeriscono che la patogenesi associato con il grasso IAB può essere evitato dagli adipociti specifici. Recenti studi hanno dimostrato che il trapianto di adipociti sottocutanei in regione IAB può migliorare il metabolismo e ridurre l'obesità e insulino-resistenza nei roditori in vivo 14. Efficace riduzione di obesità e insulino resistenza è stata associata con adipociti termogenica grado di dissipare l'energia sotto forma di calore 15,16. Modifica termogenica adipociti può essere ottenuto mediante trasfezione stabiledi geni che partecipano al disaccoppiamento protonico mitocondriale, come la proteina di disaccoppiamento 1 (Ucp1) o di geni che regolano l'espressione di altri geni Ucp1 e termogenica 15,16. Nostri studi recenti hanno dimostrato che la deficienza in aldeide deidrogenasi 1 a1 (Aldh1a1) porta al rimodellamento termogenico di grasso IAB che riduce l'obesità e insulino-resistenza in questi topi 17,18. In particolare, l'incapsulamento di termogenico Aldh1a1 carente (Aldh1a1 - / -) preadipocytes media stesso effetto terapeutico di grassi IAB in obesi topi wild-type, suggerendo nuove opportunità terapeutiche per il trattamento di IAB grasso 18. Nelle impostazioni sperimentali, le cellule incapsulate permettono ai ricercatori di studiare gli effetti di specifiche popolazioni cellulari in modo economicamente vantaggioso 19. Qui si discute il metodo di incapsulamento di una linea cellulare catabolico termogenica e il suo laboratorio e applicazione terapeutica in un modello murino di obesità. Il protocollo descrive three fasi per la produzione di microcapsule (Figura 1): la formazione delle microsfere di alginato (Figura 1A), la formazione del policationico poli-L-lisina (PLL) membrane sulla superficie di microsfere (Figura 1B), e la rimozione del nuclei di alginato (Figura 1C).
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Protocol
Il protocollo di studio è stato approvato da The Ohio State University comitati etici. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal protocollo IACUC. Tutte le procedure sono state eseguite sotto l'armadio di livello 2 di biosicurezza con flusso laminare. Abbiamo seguito tutti i requisiti e le procedure di sicurezza standard. La tecnica di microincapsulazione per la preparazione di microcapsule è stata eseguita come descritto 17, 18.
1. Preparativi di materiali
- Preparare 10 ml di 2% di soluzione di alginato di sodio in soluzione salina fisiologica autoclavato (0,9% NaCl in acqua). Preparare 0,05% soluzione PLL in salina fisiologica. Preparare queste soluzioni il giorno prima e mescolare durante la notte. Filtrare le soluzioni con 0,22 micron filtro prima dell'uso.
- Preparare citrato di sodio 50 mM e 100 mM CaCl 2 0.9% soluzioni di NaCl e sterilizzare in autoclave.
- Autoclavare tutti soluzioni, aghi, elettrodi, e bicchieri. Pulire accuratamente aghi puliti con fili per evitare intasamenti.
- Determinare la quantità appropriata di cellule da utilizzare per le capsule (102 microcapsule sono necessari per ogni cm 2 di pozzo e ci sono circa 500 cellule per capsula 18). Usare 1 ml di alginato di sodio per due milioni di cellule.
- Preparare una 'crescita dei fibroblasti Medium' di siero di vitello contenente il 10%, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina in un alto livello di glucosio (4.500 mg / l di glucosio) a medio Modified Eagle Dulbecco (DMEM).
- Preparare una 'Differenziazione medio I' contenente 10% di siero fetale bovino, 10 ug / ml di insulina, 1 mM dexametasone, 0,5 mM xantina 3-isobutil-1-metil, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina DMEM.
- Preparare contenente siero un 'Differenziazione medio II' 10% fetale bovino, 10 ug / ml di insulina, e 100 U / ml di penicillina / streptomicina DMEM.
- Preparare buffer di lisi contenente tablet inibitore della proteasi uno per 10 ml di Radio-Immunoprecipitazione tampone (RITampone PA).
2. alginato Microbeads Preparazione (Figura 1A)
- Rimuovere il vecchio mezzo da pallone di coltura cellulare. Lavare le cellule con 10 ml di PBS. Portare le cellule in sospensione con 0,25% tripsina-EDTA (2 ml per un pallone T175 confluenti).
- Contare le cellule in sospensione di cellule utilizzando un emocitometro. Utilizzare 10 ml un'aliquota dalla sospensione cellulare e contare le cellule secondo le istruzioni del produttore. Centrifugare le restanti cellule in terreno centrifugazione a 480 xg a temperatura ambiente per 5 min.
- Sospendere il pellet cellulare in alginato di sodio, come descritto al punto 1.4. Trasferire la soluzione di sodio alginato-cella a una siringa da 5 ml.
- Rimuovere le bolle d'aria nella soluzione, aggiungere un ago 23-gauge e capovolgere la siringa per creare una tasca 1 ml di aria.
- Mettere un piccolo bicchiere (180 ml) contenente 144 ml di CaCl mM soluzione 100 2 sotto il beccuccio ago della encapsulator. Collegare l'elettrodo al encapsulator con la punta approximdiatamente 2,5 centimetri sopra la superficie della soluzione di CaCl 2 100 mM.
- Inserire saldamente la siringa contenente la soluzione di alginato di sodio-cellule nella pompa a siringa. Attaccare il tubo di gomma per l'apertura della siringa. Spingere lo stantuffo fino a quando la soluzione di alginato di sodio a cellule entra a metà del tubo. Regolare la tensione di 5,4 kV. Impostare il diametro 12,06 millimetri sulla pompa a siringa. Regolare la velocità di 3 ml / h. Avviare la pompa. Accendere encapsulator e mantenere la tensione a 5,4 kV.
- Chiudere la finestra della cappa ed evitare inutili vibrazioni fino alla fine della formazione delle microsfere di alginato. Dopo tutta la soluzione passa attraverso l'ago, solidificare microsfere sferiche alginato nella soluzione di CaCl 2 100 mM per ulteriori 20 minuti prima del rivestimento con PLL.
3. Microbeads rivestimento con PLL (Figura 1B)
- Rimuovere il bicchiere contenente le microsfere a forma di palla di sodio alginato-cellula e trasferire questi microbeads in una provetta da centrifuga da 50 ml. Rimuovere CaCl soluzione 2 dal pellet microperla.
- Lavare le microsfere a forma di palla alginato di cellule aggiungendo 30 ml di NaCl allo 0,9%. Agitare il tubo a mano delicatamente. Rimuovere 0,9% NaCl con 25 ml pipetta dopo le microsfere sono precipitati per gravità. Ripetere altre due volte per un totale di 3 lavaggi.
- Utilizzare 10 ml di soluzione PLL 0,05% per ogni 1 ml di soluzione di alginato di sodio. Aggiungere il PLL 0,05% e agitare a 1000 giri al minuto per 10 min.
Nota: Di solito, 10 min è sufficiente per il rivestimento PLL. - Dopo si forma PLL cappotto, rimuovere la soluzione PLL e lavare le capsule 3 volte come descritto al punto 3.2.
4. Rimozione di alginato core (Figura 1C)
- Aggiungere 30 ml di 50 mM soluzione di citrato di sodio. Attendere 5 minuti o fino a quando tutta l'alginato di sodio è disciolto. Lavare capsule tre volte come descritto al punto 3.1.1.
- Rimuovere il 0,9% NaCl, aggiungere 20 ml di mezzo di coltura al tubo 50 mle trasferire tutte le capsule contenenti le cellule in un pallone di coltura cellulare. Maneggiare cellule incapsulate in condizioni standard di coltura cellulare 18.
5. Le domande vitro per lo studio xenotrapianto e Host cellulari interazioni o Cinetica di Metabolita Afflusso / Efflux tra cellule (Figura 2)
- Cellule ospiti Cultura il 24 pozzetti fino confluenti per co-culture. Utilizzare il 'fibroblasti crescita medio' per preadipocytes coltura.
- Trasferire microcapsule in 24 piastra contenente cellule ospiti confluenti bene. Aggiungere microcapsule per ottenere un monostrato (102 microcapsule / cm 2 di pozzo).
- Indurre la differenziazione pre-adipociti con Differenziazione Media I. Ogni 48 ore, cambio media differenziazione Media II per sei giorni. Lisare le cellule in tampone RIPA. Utilizzare 50 proteine g per condizione di analizzare l'espressione proteica con Western Blot.
6. In Vivo Domanda di Trattento di obesità (figura 3)
- Mescolare 4% isoflurano con l'ossigeno per l'induzione di anestesia e 2% isoflurano con ossigeno per il mantenimento dell'anestesia. Confermare adeguata profondità dell'anestesia per pizzico piedi.
- Applicare una pomata anti-prurito sugli occhi per proteggere le cornee si secchi.
- Utilizzare cellule incapsulate che sono etichettati in modo permanente con proteina fluorescente artificiale, come la proteina fluorescente verde (GFP).
- Utilizzare una siringa da 3 ml e un ago calibro 20 per iniettare cellule incapsulate.
- Iniettare 0,5 x 10 6 cellule sospese in 0,2 ml di soluzione in ciascuno depot grasso catetere che si trova nella zona intraperitoneale tra un gonadi e reni come mostrato in figura 3. Utilizzare questo volume di PBS e il numero di cellule per topo con un peso medio di 40 g. Regolare numero di cellule e volume in topi che hanno peso diverso o per la determinazione degli effetti dose-dipendente.
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Representative Results
La Figura 1 mostra che ogni fase della produzione microsfere può essere controllato al microscopio. La Figura 2A mostra come co-coltura adipociti con un monostrato di cellule incapsulate. Figura 2B è un esempio rappresentativo di uno studio quantitativa utilizzando adipociti / microcapsule co-culture sono stati descritti nella sezione 5. Lisati degli adipociti sono stati analizzati usando Western Blot. Cellule incapsulate non sono state analizzate in questo esperimento. ATGL primario e anticorpi β-actina sono stati usati ad una diluizione 1: 1000. Il rapporto tra ATGL a β-actina sono mostrati SD come media di tre esperimenti indipendenti. Approcci simili co-coltura potrebbero essere utilizzati per analizzare mRNA e studiare gli effetti di interazioni cellulari e degli adipociti incapsulati in co-culture. Mostra i dati che incapsulato Aldh1a1 termogenico - / - adipociti induca livelli significativamente più elevati di ATGL lipasi e la lipolisi 18 in adipociti rispetto al incapsulazioneadipociti ted WT.
La Figura 3 mostra che GFP indica la posizione e l'integrità delle capsule nel tessuto adiposo host. L'espressione di GFP è anche un indicatore di vitalità cellulare.
Valutazione qualitativa
La qualità di incapsulamento o l'impianto di cellule incapsulate potrebbe essere valutata mediante microscopia, la risonanza magnetica, e utilizzando l'analisi immunoistochimica di tessuti adiposi trattati 18.
Approccio quantitativo
Data l'espressione unica di GFP a sopravvivere le cellule trapiantate, la misurazione dei livelli di espressione GFP permettono cellule incapsulato per essere quantificati in tessuto come descritto 18 .GFP e altre proteine possono essere rilevati utilizzando anticorpi specifici anti-GFP in un omogenato di un tessuto complesso adiposo depot. I livelli di proteina GFP in questo omogeneizzato forniscono informazioni sul numero di cellule impiantate vitali.
Figura 1: schema del procedimento per la produzione di microcapsule. microsfere (A) alginato al microscopio (20X). (B) lo strato esterno dopo il rivestimento con PLL (20X). (C) microcapsula finale dopo la dissoluzione del nucleo alginato (20X). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: co-culture microcapsule con colture di linee cellulari aderenti (A) Schema (pannello inferiore) di una co-coltura di microcapsule (cerchi galleggianti in media) con adipociti aderenti.. (B) Confronto di espressione di ATGL da3T3-L1 adipociti co-coltura con acellulare, WT, o Aldh1a1 - / - adipociti contenente microcapsule. Valore Significato P è stato determinato utilizzando il test U Mann-Whitney. Inserti superiore mostra un Western Blot rappresentante. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Schema di un intra-addominale (IAB, viscerale) iniezione di grasso con le cellule incapsulate L'immagine fotografica del cuscinetto adiposo IAB iniettato presenta grappoli scolorite di cellule incapsulate 80 giorni dopo il trapianto (triangolo). Questi pad moda IAB sono stati incorporati in paraffina e analizzato. Ematossilina e eosina (H & E) colorazione mostra gruppi di cellule incapsulate (frecce), microcapsule impiantati (C), incapsulaticellule (CC), adipociti host (A). Stessa immagine analizzata sotto una luce fluorescente mostra le cellule trapiantate GFP marcato sulla parte interna delle capsule intatte rotonde. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vari metodi sono stati utilizzati per incapsulare cellule, comprese l'essiccazione, estrusione, ed emulsione 19. In questo metodo, le perline alginato vengono estrusi attraverso un ago, poi rivestito con PLL e il nucleo alginato sarà sciolto per completare l'incapsulamento. Anche se questo metodo è stato usato per anni, formazione delle perline con la dimensione desiderata e la forma sferica è ancora difficile. La dimensione delle capsule è fortemente dipendente dalla viscosità della soluzione di alginato di sodio, il diametro estrusore e la distanza tra la punta dell'ago e la soluzione 20 CaCl 2. Minore è la distanza tra la punta dell'ago e la superficie della soluzione di CaCl 2 è, le perline più piccole sono prodotte. Il protocollo descritto porta alla produzione di APL con pori (<32 kD). La dimensione dei pori potrebbe essere sperimentalmente testato con immunoglobuline fluorescenti (> 32 kD) e fluorescenti piccoli peptidi come descritto in precedenza 18. Questo size del poro è sufficiente a sostenere la sopravvivenza delle cellule in colture in vitro per 2 settimane e dopo l'impianto in vivo nel tessuto adiposo per almeno 80 giorni 18. La forma microperla è un fattore importante che influenza la sopravvivenza delle cellule incapsulate. Perline incrinate con molti microsfere satellitari aumentano protrusione delle cellule 21. Avvenuta formazione Satellite quando la concentrazione più bassa e bassa viscosità soluzioni alginato intermedio-G sono applicati 22, mentre la formazione della coda è dovuta all'elevata-G alginato 23. Come la forza di taglio può anche contribuire a perline incrinate, si consiglia una procedura di lavaggio delicato per microsfere e proporre condizioni ottimizzate per la produzione di capsule robuste adatte vitro co-culture e engrafting nei tessuti in vivo.
Microincapsulazione ha dimostrato di essere un metodo efficace per l'impianto per la protezione di prodotti biologici come le cellule, citochines, enzimi, ormoni, e bioabsorbents dall'ambiente e risposta immunitaria 24. Il rilascio controllato di ormoni o citochine di cellule incapsulate stato testato per i suoi effetti terapeutici in un'ampia varietà di malattie, compreso l'obesità 18, diabete mellito 5, insufficienza epatica 25 e anemia 26. Tuttavia, l'efficacia di cellule incapsulate anabolizzanti trapiantate è spesso diminuita a causa della fibrosi. Qui si descrive la nuova applicazione di cellule catabolici termogenica per il trattamento dell'obesità e insulino resistenza 18. Incapsulamento di Aldh1a1 - / - adipociti, e possibilmente altre cellule catabolici, hanno diversi vantaggi rispetto ai incapsulamento delle cellule anabolizzanti Aldh1a1 -. / - Preadipociti aderiscono spontaneamente alla superficie interna della membrana 18 e APL differenziano nell'ambiente adipogenico di grasso che IAB impedisce loro eccessiva proliferazione in capsule e la rottura veloce di capsule. In addition, queste cellule sono diminuiti risposte infiammatorie e proprietà catabolici 27. Dati immunoistochimica mostrano che l'impianto di APL incapsulato Aldh1a1 - / - adipociti in grasso IAB per 80 giorni, non è stata accompagnata dalla risposta immunitaria pronunciato e la fibrosi nei topi 18; tuttavia, ulteriori studi devono essere eseguite in futuro per valutare gli effetti potenziali infiammatori. In primo luogo, la carenza di Aldh1a1 aumenta l'espressione di termogenico Ucp1 negli adipociti. Carenza Aldh1a1 riduce la produzione autocrina di acido retinoico crescenti livelli di retinaldehyde 28. Questo percorso influenza numerose vie trascrizionali 28,29, che potrebbero essere coinvolti nella produzione di fattori intrinseci termogenica e paracrini. In particolare, incapsulato Aldh1a1 - / - cellule adipociti producono risposta termogenica simile in ospitanti obesi topi WT. Incapsulato Aldh1a1 - / - adipociti sembrano produrre fattore paracrino (s) increasing numero di cellule -positive UCP1 nel WT ospitante tessuto adiposo 18. Insieme, queste risposte termogenica comportato una riduzione preferenziale di grasso iniettato IAB. Un fenotipo di immortalati Aldh1a1 - / - preadipocytes esercita molte proprietà che fanno di questa modificazione genetica un candidato promettente per la tecnologia di incapsulamento ridurre l'obesità indotta dalla dieta.
Recentemente molti altri prodotti biologici tra cui citochine irisin, miR-133a 30, meteorin come ormone 31, la proteina-paratiroideo ormone correlato 32 sono stati segnalati a esercitare rimodellamento termogenico di sottocutaneo tessuto adiposo bianco. Ulteriori studi sono necessari per determinare se questi fattori termogenico sono adatti per le tecnologie di incapsulamento e terapie contro l'obesità nel grasso sottocutaneo e / o di IAB. Microcapsule contenenti cellule catabolici possono essere potenzialmente adatto per rimuovere l'eccesso di metaboliti deleteri in un ambiente tossico. Ad esempio, il pazientes possono beneficiare di catabolismo facilitato di alcol o deoxyglucosone, un primo metabolita reattivo nei pazienti con diabete. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per determinare se queste applicazioni potrebbero avere benefici terapeutici.
In sintesi, questi studi forniscono un proof-of-concept che l'amplificazione della risposta termogenica di grassi IAB potrebbe essere iniziata da un piccolo sottoinsieme di incapsulata Aldh1a1 - / - preadipocytes. Inoltre, questi studi hanno dimostrato la fattibilità di un trattamento specifico per il tessuto con impianti iniettate delle cellule termogenico cataboliche incapsulate.
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Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Jennifer Petrosino e David Disilvestro aiuto editoriale. Questa ricerca è stata sostenuta dal Premio numero 20020728 del consiglio Egg americano e Premio numero 10040042 da Novo Nordisk Farmaceutici, nonché dalla Food Innovation Center, Ufficio per gli Affari Internazionali, Center for Advanced Functional Foods ricerca, e l'imprenditoria a OSU, nonché la National Science Foundation concessione CEE-0914790 (LJL). Il progetto descritto è stato sostenuto dal Premio Numero R21OD017244 (OZ) e UL1RR025755 (OSUCCC) dal Centro Nazionale per la Ricerca Risorse, finanziato dall'Ufficio del Direttore, National Institutes of Health (OD) e sostenuto dal NIH tabella di marcia per la ricerca medica e NSC P30CA16058. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del Centro nazionale per le risorse di ricerca o il National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
| KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
| Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
| Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
| Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
| Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
| Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
| ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
| Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
| Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
| Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
| Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
| Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |
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