Abstract
Cellule encapsulation est développé pour piéger des cellules viables dans des membranes semi-perméables. Les cellules encapsulées greffées peuvent échanger des metabolites de faible poids moléculaire dans les tissus de l'hôte traité pour obtenir une survie à long terme. La membrane semi-perméable permet greffé cellules encapsulées pour éviter le rejet par le système immunitaire. Le procédé d'encapsulation a été conçu pour permettre une libération contrôlée de composés bioactifs, tels que l'insuline, des hormones et d'autres cytokines. Nous décrivons ici un procédé pour l'encapsulation de cellules cataboliques, qui consomment des lipides pour la production de chaleur et de dissipation d'énergie (thermogenèse) dans le tissu adipeux intra-abdominale de souris obèses. Encapsulation de cellules cataboliques thermogénique peut être potentiellement applicable à la prévention et au traitement de l'obésité et le diabète de type 2. Une autre application potentielle de cellules cataboliques peut inclure la désintoxication d'alcools ou d'autres métabolites toxiques et des polluants environnementaux.
Introduction
L'incidence croissante des maladies chroniques 1 a stimulé les études sur la transplantation de populations de cellules thérapeutiques 2. Cellules souches syngéniques ou allogéniques sont les types de cellules les plus couramment utilisés pour ces applications 2. Cependant, ces traitements ne permettent pas le contrôle de la différenciation et la migration de cellules souches après l'implantation et ne sont pas économiques efficace. La transplantation de cellules génétiquement modifiées avec les fonctions bénéfiques prévoit améliorer le traitement de nombreuses maladies. Cependant, les modifications génétiques de cellules sont reconnus par le système immunitaire de l'hôte, par conséquent, ces traitements nécessitent trois immunosuppression. L'encapsulation de cellules produisant de l'insuline a été développé par le Dr Chang 4. La technique est basée sur l'encapsulation des cellules dans des gouttelettes d'alginate qui sont immergés dans une solution de chlorure de calcium. Les molécules d'alginate sont constitués d'acide mannuronique (M) et guluronique (G) et peuvent être connectés par Ca 2+. Après la gélification, les billes sont mises en suspension une poly-L-lysine (PLL) solution. Au cours de cette étape, PLL se lie à G et M dans les molécules d'alginate qui établit la membrane de la capsule. La porosité de la membrane de la capsule peut être modulée en faisant varier les concentrations de S PLL, et le temps d'incubation et de la température. La liaison de PLL dépend aussi du type et de la concentration d'alginate. Des matrices d'alginate réticulé par des ions Ca 2+, sont instables dans le milieu physiologique ou dans des solutions tampons à forte concentration communs de phosphate et les ions citrate. Ces tampons peuvent extraire Ca 2+ de l'alginate et liquéfier le noyau. La liquéfaction du noyau alginate offre un espace à l'intérieur des capsules pour le mouvement cellulaire et la croissance. Les cellules encapsulées dans de l'alginate polyanionique avec polycationique poly-L-lysine (APL) sont imperméables pour des immunoglobulines mais ont afflux d'éléments nutritifs et l'efflux de toxines. Les propriétés de ceux-ci APL permettent long terme survival des cellules encapsulées après transplantation dans génétiquement différents hôtes. Elliott et al. A rapporté la survie de fonctionnement des cellules du pancréas de porc encapsulés dans un patient humain neuf ans après l'implantation 5.
techniques d'encapsulation peuvent être classés en microencapsulation (3-800 um) et macroencapsulation (supérieure à 1000 um). Microcapsules sont plus durables que macrocapsules 6. Depuis sa découverte par le Dr Chang et ses collègues en 1964, microencapsulation a été largement utilisé pour l'encapsulation de cellules produisant l'insuline anabolisants, hormones et autres molécules bioactives 7. Ces traitements confrontés à plusieurs défis dans le tissu hôte, y compris la fibrose et la réponse immunitaire 8. Dans un premier temps, les effets secondaires liés à la qualité de biopolymères ont été résolus. Cependant, la transplantation de cellules anabolisants déclenche toujours des effets secondaires, tels que la fibrose, à la suite de l'hormone overproduction à l'extérieur d'une glande spécialisé.
Au cours des dernières décennies, l'obésité et le diabète de type 2 a atteint des proportions épidémiques 9. Plus de 30% des personnes adultes dans le monde sont en surpoids et obèses 10. Intra-abdominale (IAB) formation accrue de graisse augmente l'incidence de l'inflammation chronique et favorise le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires, de certains cancers et d'autres pathologies 11-13. Plusieurs éléments de preuve suggèrent que la pathogenèse associée avec de la graisse IAB peut être évitée par les adipocytes spécifiques. Des études récentes ont montré que la transplantation d'adipocytes sous-cutanés dans la région IAB peut améliorer le métabolisme et diminuer la résistance de l'obésité et de l'insuline chez les rongeurs in vivo 14. Une réduction efficace de la résistance de l'obésité et de l'insuline a été associé à adipocytes thermogénique capables de dissiper l'énergie sous forme de chaleur de 15,16. Modification thermogénique des adipocytes peut être obtenue par transfection stabledes gènes participant à la désolidarisation de protons mitochondrial, comme la protéine de découplage 1 (Ucp1) ou de gènes régulant l'expression de gènes et d'autres Ucp1 thermogénique 15,16. Nos études récentes ont montré que la déficience en aldéhyde déshydrogénase 1 a1 (aldh1a1) conduit à la rénovation de Iab graisse thermogénique qui réduit l'obésité et la résistance à l'insuline chez ces souris 17,18. Notamment, l'encapsulation des thermogénique aldh1a1 déficient (aldh1a1 - / -) préadipocytes médiatise même effet thérapeutique dans IAB graisse chez les souris de type sauvage obèses, ce qui suggère de nouvelles possibilités thérapeutiques pour le traitement de l'IAB graisses 18. Dans les paramètres expérimentaux, des cellules encapsulées permettent aux chercheurs d'étudier les effets des populations de cellules spécifiques dans une manière rentable 19. Ici, nous discutons du procédé d'encapsulation d'une lignée cellulaire catabolique thermogénique et son laboratoire et l'application thérapeutique dans un modèle de souris de l'obésité. Le protocole décrit tphases ROIS pour la production de microcapsules (figure 1): la formation des microbilles d'alginate (Figure 1A), la formation de la polycationique poly-L-lysine (PLL) de membranes à la surface des microbilles (figure 1B), et l'enlèvement de la alginate noyaux (Figure 1C).
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Protocol
Le protocole d'étude a été approuvé par l'Université Ohio State comités d'éthique. Les expérimentations animales ont été approuvés par le protocole IACUC. Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la biosécurité au niveau du Cabinet 2 avec flux laminaire. Nous avons suivi toutes les exigences et procédures de sécurité standard. La technique de microencapsulation pour la préparation de microcapsules a été effectuée comme décrit 17, 18.
1. Préparatifs de Matériaux
- Préparer 10 ml de solution d'alginate de sodium à 2% dans une solution saline physiologique à l'autoclave (0,9% de NaCl dans l'eau). Préparer une solution à 0,05% PLL dans du sérum physiologique. Préparer ces solutions le jour avant et agiter durant la nuit. Filtrer les solutions avec filtre de 0,22 um avant utilisation.
- Préparation du citrate de sodium 50 mM et 100 mM de CaCl 2 dans 0,9% de NaCl et les autoclaver.
- Autoclaver toutes les solutions, les aiguilles, les électrodes, et gobelets. Laver soigneusement les aiguilles propres avec des fils pour éviter le colmatage.
- Déterminer le montant approprié de cellules à utiliser pour les capsules (102 microcapsules sont nécessaires pour chaque cm 2 de bien et il ya environ 500 cellules par capsule 18). Utiliser 1 ml d'alginate de sodium par deux millions de cellules.
- Préparer un «Fibroblast Growth Medium" contenant du sérum de veau à 10%, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans une haute teneur en glucose (4500 mg / l de glucose) du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM).
- Préparer un «milieu de différenciation I 'contenant 10% de sérum bovin foetal, 10 ug / ml d'insuline, 1 uM de dexaméthasone, la xanthine mM de 3-isobutyl-1-méthyl 0,5, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans du DMEM.
- Préparer contenant 10% de sérum un «milieu de différenciation II 'fœtal bovin, 10 pg / ml d'insuline, et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine dans DMEM.
- Préparer du tampon de lyse contenant une protease comprimé d'inhibiteur par 10 ml de tampon de dosage radio-immunoprécipitation (RITampon PA).
2. Préparation des microbilles d'alginate (figure 1A)
- Retirer ancien milieu de flacon de culture cellulaire. Rincer les cellules avec 10 ml de PBS. Apportez cellules en suspension avec 0,25% de trypsine-EDTA (2 ml par une confluence flacon T175).
- Compter les cellules en suspension de cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Utilisez aliquote de 10 ml de la suspension cellulaire et compter les cellules selon les instructions du fabricant. Centrifuger les cellules restantes dans un milieu de centrifugation à 480 x g à la température ambiante pendant 5 min.
- Suspension du culot cellulaire dans de l'alginate de sodium comme décrit à l'étape 1.4. Transférer la solution d'alginate de sodium-cellule à une seringue de 5 ml.
- Retirer les bulles d'air dans la solution, ajouter une aiguille de calibre 23 et inverser la seringue pour créer un 1 ml poche d'air.
- Placez un petit gobelet (180 ml) contenant 144 ml de solution de CaCl 100 mM 2 sous le bec de l'aiguille de l'encapsulateur. Fixez l'électrode à l'encapsulateur avec la pointe Approximment 2,5 cm au-dessus de la surface de la solution mM CaCl 2 100.
- Passer hermétiquement la seringue contenant la solution d'alginate de sodium-cellule dans la pompe à seringue. Fixer le tube de caoutchouc à l'ouverture de la seringue. Poussez le piston jusqu'à ce que la solution d'alginate de sodium-cellule entre mi-chemin à travers le tube. Régler la tension à 5,4 kV. Régler le diamètre de 12,06 mm sur la pompe à seringue. Réglez la vitesse de 3 ml / h. Démarrer la pompe. Allumez l'encapsulateur et maintenir la tension à 5,4 kV.
- Fermer la fenêtre de la hotte et éviter toute vibration inutile jusqu'à la fin de la formation des microbilles d'alginate. Après tout solution passe à travers l'aiguille, les microbilles se solidifier en forme de billes d'alginate dans la solution mM CaCl 2 pour cent supplémentaire de 20 min avant le revêtement avec PLL.
3. microbilles de revêtement avec PLL (figure 1B)
- Retirer le bécher contenant les microbilles en forme de billes d'alginate de sodium et de cellules transférer ces MicrobEADS dans un tube de centrifugation de 50 ml. Retirer la solution de CaCl2 à partir de la pastille de microbilles.
- Laver les microbilles sphériques d'alginate de cellules par addition de 30 ml de NaCl à 0,9%. Agiter le tube à la main en douceur. Retirer NaCl à 0,9% avec 25 ml pipette après les microbilles ont précipité par la gravitation. Répéter deux fois de plus pour un total de 3 lavages.
- Utiliser 10 ml de solution de PLL à 0,05% pour chaque 1 ml de solution d'alginate de sodium. Ajouter 0,05% PLL et le vortex à 1000 rotations par minute pendant 10 minutes.
Remarque: Habituellement, 10 min est suffisante pour le revêtement PLL. - Une fois la couche PLL est formé, retirez la solution PLL et laver les capsules 3 fois comme décrit au paragraphe 3.2.
4. Suppression de l'alginate de base (figure 1C)
- Ajouter 30 ml de solution de citrate de sodium à 50 mM. Attendre 5 minutes, ou jusqu'à ce que tout l'alginate de sodium soit dissous. Laver capsules trois fois comme décrit à l'étape 3.1.1.
- Enlever le NaCl à 0,9%, ajouter 20 ml de milieu de culture dans le tube de 50 mlet transférer tous les capsules contenant les cellules dans un ballon de culture de cellules. Poignée cellules encapsulées dans des conditions de culture cellulaire standard 18.
5. In Vitro applications à l'étude de xénogreffes et cellule hôte Interactions ou Cinétique de métabolite Afflux / Efflux entre cellules (Figure 2)
- La culture de cellules hôtes sur plaque à 24 puits jusqu'à la confluence des co-cultures. Utilisez le 'moyen de croissance des fibroblastes »pour préadipocytes de culture.
- microcapsules de transfert 24 dans des cellules hôtes confluentes de plaque contenant aussi. Ajouter microcapsules pour parvenir à une monocouche (102 microcapsules / cm 2 de bien).
- Induire la différenciation pré-adipocytes en milieu de différenciation I. Chaque 48 heures, les médias de changement au milieu de différenciation II pendant six jours. Lyse des cellules dans du tampon RIPA. Utilisez 50 pg de protéine par condition pour analyser l'expression de protéines en Western blot.
6. En Vivo Demande de Traitemeent de l'obésité (Figure 3)
- Mélanger 4% d'isoflurane avec de l'oxygène pour l'induction de l'anesthésie et 2% d'isoflurane avec de l'oxygène pour l'entretien de l'anesthésie. Confirmer la profondeur de l'anesthésie adéquate par pincement de l'orteil.
- Appliquer une pommade anti-démangeaison sur les yeux pour protéger les cornées de se dessécher.
- Utilisation des cellules encapsulées qui sont marqués de façon permanente avec la protéine de fluorescence artificiel, tels que la protéine de fluorescence verte (GFP).
- Utiliser une seringue de trois ml et une aiguille de calibre 20 pour injecter des cellules encapsulées.
- Injecter 0,5 x 10 6 cellules en suspension dans 0,2 ml de PBS dans chaque dépôt de graisse IAB qui se trouve dans la zone intrapéritonéale entre une gonade et les reins comme le montre la figure 3. Utilisez ce volume de PBS et le nombre de cellules pour des souris avec un poids moyen de 40 g. Ajuster le nombre de cellules et le volume chez des souris qui ont un poids différent ou pour la détermination des effets dépendants de la dose.
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Representative Results
La figure 1 montre que chaque étape de la production de microbilles peut être contrôlé au microscope. La figure 2A montre comment la co-culture des adipocytes avec une monocouche de cellules encapsulées. La figure 2B est un exemple représentatif d'une étude quantitative utilisant des adipocytes / microcapsules co-cultures que ont été décrits dans la section 5. lysats des adipocytes ont été analysés en Western blot. Des cellules encapsulées sont analysés dans cette expérience. ATGL primaire et des anticorps β-actine ont été utilisés à une dilution de 1: 1000. Le rapport de ATGL de β-actine sont présentées sous forme de moyenne SD de trois expériences indépendantes. Les approches de co-culture similaires pourraient être utilisés pour analyser l'ARNm et étudier les effets des interactions cellulaires et adipocytaires encapsulés dans des co-cultures. Les données montrent que encapsulé aldh1a1 thermogénique - / - adipocytes induire des niveaux significativement plus élevés de ATGL lipase et la lipolyse dans les adipocytes 18 par rapport à encapsulaadipocytes Ted WT.
La figure 3 montre que la GFP indique l'emplacement et l'intégrité des capsules dans le tissu adipeux de l'hôte. L'expression de GFP est un indicateur de la viabilité cellulaire.
L'évaluation qualitative
La qualité de l'encapsulation ou l'implantation de cellules encapsulées peut être évaluée par microscopie, IRM et en utilisant une analyse immunohistochimique de tissus adipeux 18 traités.
Approche quantitative
Compte tenu de l'expression unique de la GFP dans survivant cellules transplantées, la mesure du taux d'expression de GFP permettre aux cellules encapsulées à être quantifié dans le tissu comme décrit 18 .GFP et d'autres protéines peut être détectée en utilisant des anticorps spécifiques anti-GFP dans un homogénat de tout un tissu adipeux dépôt. Les niveaux de protéines GFP dans cette homogénat fournissent des informations sur le nombre de cellules implantées viables.
Figure 1: Un schéma du procédé de production de microcapsules. microbilles (A) d'alginate sous un microscope (20X). (B) la couche externe après le revêtement avec PLL (20X). (C) la microcapsule finale après la dissolution de la base d'alginate (20X). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: co-cultures microcapsules avec cultures de lignées de cellules adhérentes (A) Schéma (panneau inférieur) d'une co-culture de microcapsules (cercles flottants dans les médias) avec adipocytes adhérentes.. (B) comparaison de l'expression de ATGL partir3T3-L1 adipocytes co-cultivées avec acellulaires, WT, ou aldh1a1 - / - adipocytes contenant des microcapsules. valeur de signification de P a été déterminée en utilisant le test de Mann-Whitney U. Inserts supérieur montre un Western blot représentant. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Schéma d'un (, viscérale IAB) injection de graisse intra-abdominale avec des cellules encapsulées L'image photographique du coussinet adipeux IAB injecté montre grappes décolorées de cellules encapsulées 80 jours après la transplantation (triangle). Ce pad à la mode IAB ont été incorporé dans de la paraffine et analysé. Hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration montre des amas de cellules encapsulées (flèches), des microcapsules implantés (C), encapsuléescellules (CC), les adipocytes d'accueil (A). Même image analysée sous une lumière fluorescente GFP montre cellules transplantées marqué à l'intérieur de capsules intactes rondes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Diverses méthodes ont été utilisées pour encapsuler des cellules, y compris le séchage, l'extrusion, et 19 l'émulsion. Dans ce procédé, les billes d'alginate sont extrudes à travers une aiguille, puis revêtue d'PLL et le noyau alginate sera dissoute pour terminer l'encapsulation. Bien que cette méthode a été utilisée pendant des années, la formation des perles avec la taille désirée et forme sphérique est toujours difficile. La taille des capsules est fortement dépendante de la viscosité de la solution d'alginate de sodium, le diamètre de l'extrudeuse et la distance entre la pointe de l'aiguille et la solution de CaCl 2 20. Plus la distance entre la pointe de l'aiguille et la surface de la solution de CaCl 2 est, les petites perles sont produites. Le protocole décrit conduit à la production d'APL avec des pores (<32 kD). La taille des pores peut être testée en utilisant des immunoglobulines expérimentalement fluorescentes (> 32 kD) et de petits peptides fluorescents comme décrit précédemment 18. Ce sIze du pore est suffisante pour soutenir la survie des cellules dans des cultures in vitro pendant 2 semaines et après l'implantation dans le tissu adipeux in vivo pendant au moins 80 jours 18. La forme de microbilles est un facteur important influençant la survie des cellules encapsulées. Perles cassées avec beaucoup de microbilles de satellites augmentent saillie des cellules 21. formation de satellite a eu lieu lorsque la concentration inférieure et intermédiaire-G solutions d'alginate de faible viscosité sont appliquées 22, tandis que la formation de la queue est due à G élevé alginate 23. Comme la force de cisaillement peut aussi contribuer à perles fissurés, nous recommandons une procédure de lavage doux pour microbilles et proposons des conditions optimisées pour la production de capsules robustes adaptés pour les co-cultures in vitro et à greffer dans des tissus in vivo.
Microencapsulation a été prouvé être une méthode efficace pour l'implantation de la protection des produits biologiques tels que des cellules, des cytokiness, des enzymes, des hormones et bioabsorbents de l'environnement et la 24 réponse immunitaire. La libération contrôlée des hormones ou des cytokines à partir de cellules encapsulées a été testée pour ses effets thérapeutiques dans une grande variété de maladies, y compris l'obésité 18, le diabète sucré 5, une insuffisance hépatique 25 et 26 l'anémie. Cependant, l'efficacité des cellules encapsulées anabolisants greffées est souvent diminuée du fait de la fibrose. Nous décrivons ici la nouvelle application de cellules cataboliques thermogénique pour le traitement de l'obésité et de résistance à l'insuline 18. Encapsulation de aldh1a1 - / - adipocytes, et éventuellement d'autres cellules cataboliques, présentent plusieurs avantages par rapport à l'encapsulation de cellules anabolisants aldh1a1 -. / - Préadipocytes adhèrent spontanément à la surface interne de la membrane 18 et se différencient APL dans le milieu adipogénique de graisse que Iab empêche leur prolifération excessive dans des capsules et la rupture rapide de capsules. Dans supplén, ces cellules ont diminué réponses inflammatoires et des propriétés cataboliques 27. Immunohistochimique des données montre que l'implantation de l'APL encapsulé aldh1a1 - / - adipocytes en graisse IAB pendant 80 jours n'a pas été accompagné par la réponse immunitaire prononcé et la fibrose chez les souris 18; Toutefois, d'autres études doivent être effectuées à l'avenir pour évaluer les effets inflammatoires potentiels. Principalement, la carence aldh1a1 augmente l'expression de thermogénique Ucp1 dans les adipocytes. Carence aldh1a1 réduit la production autocrine de l'acide rétinoïque augmentant les niveaux de rétinaldéhyde 28. Cette voie influe sur de nombreuses voies de transcription 28,29, qui pourraient être impliqués dans la production de facteurs intrinsèques et thermogénique paracrines. Notamment, encapsulé aldh1a1 - / - cellules adipocytes produisent la réponse thermogénique similaire chez les souris WT obèses d'accueil. Encapsulé aldh1a1 - / - adipocytes apparaissent à produire le facteur paracrine (s) increasing nombre de cellules -positifs UCP1 dans le tissu adipeux de WT hôte 18. Ensemble, ces réponses thermogénique entraîné une réduction préférentielle de la graisse injectée IAB. Un phénotype de immortalisé aldh1a1 - / - pré-adipocytes exerce de nombreuses propriétés qui font de cette modification génétique d'un candidat prometteur pour la technologie d'encapsulation réduction de l'obésité induite par l'alimentation.
Récemment, de nombreux autres produits biologiques, y compris cytokine irisin, miR-133a 30, meteorin comme l'hormone 31, la protéine apparentée à l'hormone parathyroïdienne-32-ont été signalés à exercer remodelage thermogénique du tissu adipeux blanc sous-cutanée. D'autres études sont nécessaires pour déterminer si ces facteurs thermogénique sont adaptés pour les technologies et les thérapies encapsulation contre l'obésité dans la graisse sous-cutanée et / ou IAB. Microcapsules contenant des cellules cataboliques peuvent être potentiellement approprié pour éliminer un excès de métabolites nuisibles dans un environnement toxique. Par exemple, des patientss peuvent bénéficier de catabolisme facilité d'alcool ou de désoxyglucosone, un premier métabolite réactive chez les patients atteints de diabète. Cependant, des études ultérieures sont nécessaires pour déterminer si ces applications peuvent avoir des avantages thérapeutiques.
En résumé, ces études fournissent une preuve de concept que l'amplification de la réponse thermogénique de la graisse IAB pourrait être initié par un petit sous-ensemble des encapsulé aldh1a1 - / - pré-adipocytes. En outre, ces études ont démontré la faisabilité d'un traitement spécifique des tissus avec des implants de cellules injectées thermogénique cataboliques encapsulés.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier Jennifer Petrosino et David DiSilvestro de l'aide éditoriale. Cette recherche a été soutenue par numéro 20020728 Prix de l'American Egg Board et le numéro 10040042 Prix de Novo Nordisk Pharmaceuticals ainsi que par le Centre Innovation Alimentaire, Bureau des affaires internationales, Centre for Advanced Functional Foods de recherche, et de l'entrepreneuriat à l'OSU ainsi que la National Science Foundation accorde CEE-0914790 (LJL). Le projet décrit a été soutenue par le Prix Nombre R21OD017244 (OZ) et UL1RR025755 (OSUCCC) du National Center for Research Resources, financé par le Bureau du Directeur de la National Institutes of Health (OD) et soutenu par le NIH Roadmap for Medical Research et NCI P30CA16058. Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Center for Research Resources ou de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Encapsulation device (VAR V1) | Nisco | LIN-0042 | None |
| KD scientific syringe pump | KD scientific | 780100Y | None |
| Olympus microscope | Olympus Optical | IX70-S8F2 | None |
| Sodium alginate | Sigma | MKBP8122V | None |
| Poly-L-lysine hydrobromide (PLL) | Sigma | 020M5006V | None |
| Calcium chloride | Sigma | SLBJ2662V | None |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 030M0200 | None |
| Sodium chloride | Sigma | SLBD2595V | None |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | Bio-Rad | 456-1093 | None |
| ATGL primary antibody (from rabbit) | Cell Signaling | 2138S | None |
| Secondary anti body (anti rabbit) | LI-COR | 926-68071 | None |
| Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer | Boston BioProducts | D25Y6Z | None |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | RNBD2893 | None |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | None |
| Cortizone 10 anti-itch ointment | Cortizone 10 | C4029138 | None |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | None |
| Newborn calf serum (CS) | Sigma | N4762 | None |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | None |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I0516 | None |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | None |
| Insulin (bovine) | Sigma | I5879 | None |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693159001 | None |
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