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Neuroscience

Confocal Macroscopy का प्रयोग प्रसव के बाद अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल प्रवास के पूर्व vivo इमेजिंग

Published: May 12, 2015 doi: 10.3791/52810
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1PRIMACEN, Cell Imaging Platform of Normandy, Inserm, IRIB, University of Rouen, 2Department of Neurobiology, School of Medicine, Yale University

Abstract

प्रसव के बाद विकास के दौरान, अपरिपक्व दाना कोशिकाओं (उत्तेजक interneurons) अनुमस्तिष्क कॉर्टेक्स के आंतरिक बारीक परत तक पहुँचने के लिए आणविक परत और Purkinje सेल परत में बाहरी बारीक परत में स्पर्शरेखा प्रवास, और फिर रेडियल प्रवास दिखा रहे हैं। प्रवासी प्रक्रियाओं में डिफ़ॉल्ट विविध अनुमस्तिष्क कार्यों में घाटे के लिए अग्रणी, कोशिका मृत्यु या न्यूरॉन्स के गुम या तो लाती है। केन्द्राभिमुख दाना सेल प्रवास उनकी अंतिम स्थिति की ओर कोशिकाओं मार्गदर्शन करने के लिए इस तरह के कीमोटैक्सिस और बाह्य मैट्रिक्स गिरावट के रूप में कई तंत्र, शामिल है, लेकिन प्रत्येक cortical परत में सेल प्रवास नियंत्रित करने वाले कारकों केवल आंशिक रूप से जाना जाता है। हमारे विधि में, तीव्र अनुमस्तिष्क स्लाइस P10 चूहों से तैयार किया जाता है, दाना कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट cytoplasmic मार्कर के साथ चिह्नित कर रहे हैं और ऊतकों सी 37 डिग्री पर कोंफोकल macroscopy द्वारा सेल प्रवास के वास्तविक समय की निगरानी शुरू करने से पहले 4 से 10 घंटे के लिए झिल्ली आवेषण पर संवर्धित कर रहे हैं मेंसीओ 2 की उपस्थिति। सेरिबैलम के विभिन्न cortical परतों में अपने प्रवास के दौरान, छोटा दाना कोशिकाओं neuronal प्रवास के नियमन में उनके संभावित भूमिका की जांच के लिए न्यूरोपेप्टाइड एगोनिस्ट या विरोधी, प्रोटीज निरोधक, इंट्रासेल्युलर प्रभावोत्पादक या इस तरह के शराब या methylmercury के रूप में भी जहरीले पदार्थ का ब्लॉकर्स उजागर करने के लिए किया जा सकता है ।

Introduction

विकासशील सेरिबैलम में, न्यूरॉन्स के आठ विभिन्न प्रकार दूसरा भ्रूण सप्ताह और कृन्तकों 1 में दूसरा प्रसव के बाद सप्ताह के बीच क्रमिक रूप से उत्पादित कर रहे हैं। शुरू में एक प्राथमिक कीटाणु क्षेत्र, से होने वाले, अपरिपक्व दाना कोशिकाओं (जीसी) बाहरी बारीक परत (EGL), एक माध्यमिक कीटाणु जोन 2 से उत्पादित करने के लिए पिछले न्यूरॉन्स होते हैं। पहले तीन प्रसव के बाद सप्ताह के दौरान, अनुमस्तिष्क कॉर्टेक्स EGL, आणविक परत (माले) सहित चार परतों में आयोजित एक foliated संरचना है, Purkinje सेल परत (पीसीएल) और आंतरिक बारीक परत (आईजीएल) (चित्रा 1)। केन्द्राभिमुख प्रवास, अपरिपक्व जेन्टलमैन कैडटों, glutamatergic interneurons के माध्यम से, लगभग 2 दिनों के भीतर आईजीएल तक पहुँचने। तीसरे प्रसव के बाद सप्ताह तक EGL गायब हो जाता है और आईजीएल वयस्क सेरिबैलम में बारीक परत (जीएल) कहा जाता है का गठन किया। जीएल में, जेन्टलमैन कैडटों काई से भरा फाइबर और एकध्रुवीय ब्रश कोशिकाओं से उत्तेजक अन्तर्ग्रथनी आदानों प्राप्त करते हैं, औरगॉल्जी सेल एक्सोन से निरोधात्मक अन्तर्ग्रथनी आदानों। एमएल में, जीसी एक्सोन Purkinje कोशिकाओं, टोकरी कोशिकाओं, तारामय कोशिकाओं, और गॉल्जी कोशिकाओं 2 सहित GABAergic न्यूरॉन्स के साथ उत्तेजक synapses बनाते हैं।

जल्दी प्रसव के बाद कृन्तकों से प्राप्त तीव्र अनुमस्तिष्क स्लाइस में सेल आंदोलन की वास्तविक समय अवलोकन जेन्टलमैन कैडटों अनुमस्तिष्क कॉर्टेक्स 3 में उनके मार्ग दौरान प्रवास के साधन और गति में परिवर्तन के साथ समन्वित रूप से उनके आकार को संशोधित यह दर्शाता है कि। पहले दो प्रसव के बाद सप्ताह के दौरान, जीसी व्यापारियों को सक्रिय रूप से EGL के शीर्ष पर पैदा करना। EGL के मध्य भाग में, postmitotic जेन्टलमैन कैडटों उनके बड़े प्रक्रिया की दिशा में tangentially पलायन। EGL-माले की सीमा पर, जेन्टलमैन कैडटों उनके आंदोलन को धीमा कर, कोशिकाओं एमएल में एक छोटी खड़ी उतरते प्रक्रिया में प्रवेश करने के लिए शुरू करते हैं। एमएल में, जेन्टलमैन कैडटों एक खड़ी लम्बी सेल शरीर, एक पतली पीछे आने वाली प्रक्रिया है और एक अधिक मोटा अग्रणी प्रक्रिया है, और Bergmann glial फाइबर साथ त्रिज्यात ओर पलायन। मेंपीसीएल, जेन्टलमैन कैडटों उनके आंदोलन को रोकने लेकिन एक लंबे समय तक स्थिर चरण (2 घंटा) के बाद, वे पीसीएल-आईजीएल सीमा पार। आईजीएल में, जेन्टलमैन कैडटों glial फाइबर समर्थन के अभाव में परत के नीचे की ओर पलायन। अग्रणी प्रक्रिया के सुझावों के बाद आईजीएल-सफेद पदार्थ (WM) की सीमा, जेन्टलमैन कैडटों धीमी दृष्टिकोण और उनके आंदोलन को बंद करो। बाण के समान स्लाइस एमएल, PCL और आईजीएल में प्रवास रेडियल करने के लिए समर्पित कर रहे हैं, जबकि सेरिबैलम की अनुप्रस्थ वर्गों EGL में स्पर्शरेखा प्रवास के अध्ययन के लिए पसंद कर रहे हैं। (जैसे, सोमेटोस्टैटिन, PACAP) अब तक पहचान की गई है neuropeptides लेकिन प्रत्येक cortical परत में जीसी प्रवास के spatio- अस्थायी नियंत्रण में शामिल पूरा तंत्र सहित जीसी आंदोलनों के कुछ नियामक कारक अभी भी बड़े पैमाने पर अज्ञात 1,4,5,6 हैं।

जीसी प्रवास एसीयू के लिए पृथक संवर्धित कोशिकाओं या प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए या तो प्रेषित प्रकाश रोशनी का उपयोग वीडियो और confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से पिछले 20 वर्षों के दौरान अध्ययन किया गया हैते अनुमस्तिष्क स्लाइस। प्रारंभ में lipophilic DiI, और अधिक हाल ही में "सेल ट्रैकर" रंगों और सेल व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी 7,8 के लिए इस्तेमाल किया गया। सफल प्रयोगों प्रोटोकॉल सरल लेकिन आसान नहीं करना है कि विशिष्ट प्रक्रियाओं की एक संख्या पर निर्भर करती है। विशेष रूप से, तीव्र स्लाइस एक घर का बना नायलॉन जाल नेटवर्क 9 के साथ आम तौर पर टिप्पणियों के दौरान स्थिर हो जाना है। प्रकाश रोशनी की तीव्रता बहु confocal खुर्दबीन स्कैनिंग दृष्टिकोण द्वारा प्रस्तावित phototoxicity और photobleaching से बचने के लिए संभव के रूप में के रूप में कम हो गया है। इसके अलावा, तापमान और सीओ 2 neuronal प्रवास को प्रभावित कर सकता अस्थिरता के बाद से प्रमुख पर्यावरण मानकों हैं। को सुविधाजनक बनाने और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को परिष्कृत करने के लिए, हम, टुकड़ा आंदोलनों की सीमा निरंतर पर्यावरणीय मानकों को सुनिश्चित करता है, photobleaching को कम कर देता है, और consequ (milimeters के आदेश पर) देखने के क्षेत्र बढ़ जाती है कि एक confocal macroscopy प्रोटोकॉल विकसित किया हैछवि विश्लेषण के माध्यम से पता लगाया जा सकता है कि कोशिकाओं (दर्जनों) की संख्या ently। इस प्रकार, 180 माइक्रोन मोटी स्लाइस झिल्ली आवेषण पर संवर्धित कर रहे हैं, और 6 अच्छी तरह प्लेटें सीधे एक बड़े ऊष्मायन कक्ष, तापमान और सीओ 2 नियंत्रकों और एक कंपन नियंत्रण प्रणाली से लैस एक वाणिज्यिक कोंफोकल macroscope के 2X मोटर चालित उद्देश्य के तहत स्थानांतरित कर रहे हैं। समय-चूकों और जेड ढेर तो कई घंटे और औषधीय उपकरणों पर प्रदर्शन कर रहे हैं या बायोएक्टिव अणुओं जोड़ा या ऊष्मायन माध्यम में दिया जा सकता है। इस विधि को भी विभिन्न विकास के चरणों में सेरिबैलम या मस्तिष्क में न्यूरॉन्स के अन्य प्रकार के प्रवास का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

पशु (पुरुष या महिला Wistar चूहों) की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए फ्रेंच गाइड के अनुसार, जन्म हुआ था और एक मान्यता प्राप्त जानवरों की सुविधा (अनुमोदन B.76-451-04) में पैदा किया गया। प्रयोगों यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक (22 सितंबर की 2010/63 / UE, 2010) और कृषि के फ्रेंच मंत्रालय के अनुसार अधिकृत जांचकर्ता (एमबी, डीवी और एलजी) की देखरेख में आयोजित की गई।

मीडिया और उपकरण के 1. तैयारी

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, 2 MgCl बिना 2 CaCl (1.85 ग्राम / एल) / MgSO 4 (0.9767 ग्राम / एल) युक्त 10x शेयर समाधान से बाँझ पानी में 1x हांक बीएसएस (HbSS) तैयार करते हैं। HBSS के समाधान 1x करने के लिए 3 NaHCO (350 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें।
  2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, एन 2 (एक 100x शेयर समाधान से) पूरक और पेनिसिलिन (100 इकाइयों / एमएल) -streptomycin (0.1 मिलीग्राम / एमएल) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) पोषक तत्व मिश्रण करने के लिए समाधान जोड़नेसंरचना एफ 12 (1: 1)।
  3. बाँझ परिस्थितियों में, DMSO में cytoplasmic फ्लोरोसेंट रंजक बुलाया सेल ट्रैकर ग्रीन के एक विभाज्य (25 μl, 2 मिमी) (1 मिलीग्राम के लिए 1.075 मिलीग्राम) तैयार करते हैं। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में DMEM के 5 मिलीलीटर में एक विभाज्य पतला।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया रखने के लिए भरे बर्फ बाल्टी तैयार करें।
  5. 70% इथेनॉल के साथ प्रयोगशाला बेंच में सबसे ऊपर है और उपकरणों शुद्ध करना।

P10 के चूहों से सेरिबैलम के 2. विच्छेदन

  1. तेजी से रीढ़ की हड्डी की शुरुआत पाने के लिए कान के पीछे मुड़े ऑपरेटिंग कैंची से चूहा पिल्ले (P10) सिर काटना।
  2. Decapitated सिर के पीछे साइड पर, ठीक आईरिस कैंची से नाक को गर्दन से त्वचा के midline चीरा बनाने और ठीक आईरिस कैंची और ड्यूमॉन्ट # 3 संदंश के साथ खोपड़ी से त्वचा को अलग।
  3. नाजुक खोपड़ी के व्याख्यान चबूतरे क्षेत्र के आधार से दो पार्श्व चीरों बनाने के लिए ठीक परितारिका कैंची का प्रयोग करें। दो # 3 संदंश के साथ विच्छेदित खोपड़ी निकालें। ब्रा को अलग करेंएक ही संदंश का उपयोग खोपड़ी के साथ किसी भी पालन से में।
  4. बर्फ ठंड HBSS के माध्यम से 2 मिलीग्राम से युक्त पेट्री डिश के लिए एक रंग (ओ 35 मिमी) की चम्मच अंत के साथ मस्तिष्क स्थानांतरण।
  5. Stereomicroscope के चरण के लिए बर्फ और हस्तांतरण से भरा एक बड़ा पेट्री डिश में मस्तिष्क युक्त पेट्री डिश (ओ 100 मिमी) रखो।
  6. एक stereomicroscope के तहत दोनों # 3 संदंश का उपयोग विदरण द्वारा मस्तिष्क से सेरिबैलम अलग। इसी तरह, अवशिष्ट रीढ़ की हड्डी और pial-झिल्ली को हटा दें।
  7. एक रंग का चम्मच अंत के साथ एक नया HBSS-भरा पेट्री डिश में सेरिबैलम (ओ 35 मिमी, 2 मिलीलीटर) स्थानांतरण और बर्फ पर रहते हैं।

एक्यूट अनुमस्तिष्क स्लाइस की 3. तैयारी

  1. दो सिर से संकेत के रूप stereomicroscope के तहत, vermis और दाएँ गोलार्द्ध के बीच सेरिबैलम में कटौती के लिए एक मानक स्केलपेल संभाल # 3 ठोस और एक # 15 सर्जिकल ब्लेड के साथ 2A चित्रा में तीर।
  2. सियान में से एक बूंद रखोoacrylate vibratome का नमूना डिस्क पर गोंद और विषाक्त विलायक वाष्प खत्म करने के लिए 15-25 मिनट रुको।
  3. एक रंग का चम्मच अंत के साथ कटौती सेरिबैलम लीजिए और स्वच्छ कागज तौलिये के साथ अतिरिक्त HBSS हटा दें।
  4. नमूना डिस्क के करीब सेरिबैलम लाओ। नमूना डिस्क के लिए कटौती बढ़त फिक्स और 10 सेकंड प्रतीक्षा करें।
  5. जोड़तोड़ के साथ बफर ट्रे में नमूना डिस्क डालें, और यह इतना सेरिबैलम की अनुप्रस्थ अक्ष चाकू धारक को सीधा है बारी बारी से। एक एलन कुंजी के साथ नमूना डिस्क को ठीक करें और सेरिबैलम कवर किया जाता है जब तक धीरे HBSS के माध्यम के साथ बफर ट्रे भरें।
  6. लोड ठंडा स्नान में बर्फ कुचल दिया।
  7. किसी भी तेल को खत्म करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ ब्लेड तीन बार साफ करें।
  8. चाकू धारक में ब्लेड डालें और पेंच clamping के साथ सुरक्षित है।
  9. नमूना (उपयोगकर्ता की दृष्टि से) रियर बढ़त के पीछे ब्लेड धार सही जगह और एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में परिभाषित करते हैं। आगे का प्रयोग करें टी को परिभाषित करने के लिए आदेशवह नमूना के सामने बढ़त के बाद अंत बिंदु को।
  10. 2.5 गति से सेक्शनिंग और 180 माइक्रोन पर 8. का चयन trimming मोटाई में आवृत्ति सेक्शनिंग का चयन करें। ऊतक सेक्शनिंग प्रारंभ करें।
  11. बर्फ पर रखा पेट्री डिश (ओ 35 मिमी) HBSS युक्त करने के लिए पाश्चर विंदुक और हस्तांतरण छोटा कर दिया एक विस्तृत बोर ग्लास का उपयोग कर प्रत्येक अनुभाग उठाओ।
  12. ब्लेड के साथ दखल जब दो # 5 संदंश का प्रयोग, सेरिबैलम से ध्यान से तानिका हटा दें। सेरिबैलम प्रति 5 स्लाइस (चित्रा 2 बी, सी) की एक अधिकतम ले लीजिए।
  13. ध्यान से stereomicroscope के तहत दो # 5 संदंश के साथ अनुमस्तिष्क स्लाइस से तानिका निकालें और बेहतर जांच लोड करने के लिए धीरे lobules अलग।

लिविंग interneurons 4. फ्लोरोसेंट धुंधला

  1. 6 अच्छी तरह से थाली (प्रति अच्छी तरह से अधिकतम 3 स्लाइस /) के लिए एक विस्तृत बोर कांच छोटा कर दिया पाश्चर विंदुक के साथ अनुमस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरण। HBSS के मध्यम aspirate।
  2. एल के 5 मिलीलीटर में स्लाइस (3 अधिकतम) सेतेफ्लोरोसेंट रंजक के oading समाधान (10 माइक्रोन)।
  3. प्रकाश से बचाने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ microplate को कवर किया। सेल लेबलिंग की सुविधा के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए 35 rpm पर एक gyro से चलती है मेज पर रखो।
  4. एक विस्तृत बोर कांच छोटा कर दिया पाश्चर विंदुक के साथ, एक Transwell की झिल्ली पर स्थानांतरण स्लाइस (चित्रा 2 डी 3.0 माइक्रोन रोमकूप आकार) डालें। विंदुक के साथ लोड हो रहा है मध्यम aspirate।
  5. डालने निकालें और DMEM के 1.9 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से भरें। डालने बदलें और ऊतक को कवर करने के लिए टुकड़ा के शीर्ष पर DMEM के 100 μl जोड़ें।
  6. इनक्यूबेटर कक्ष में संस्कृति आवेषण एमएल में जेन्टलमैन कैडटों का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त है, जो 2 घंटे के लिए (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) युक्त प्लेट रखें। डालने झिल्ली (चित्रा 2 ई) पर कुर्की की अनुमति देने के फ्लैट ऊतकों जाओ। स्लाइस सुखाने नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करें।

Confocal Macroscopy के माध्यम से 5. पूर्व vivo इमेजिंग

  1. बिना थाली स्थानांतरणएक मशीन में प्लास्टिक के ढक्कन के एक confocal macroscope के स्टैंड से जुड़ी। Macroscope की थाली डालने पर एक गिलास को कवर रखें। 37.0 डिग्री सेल्सियस पर चैम्बर के तापमान रखें 0.5 डिग्री सेल्सियस ±, और लगातार गैस का प्रवाह (95% ओ 2, 5% सीओ 2) थाली डालने के माध्यम से पीएच निरंतर बनाए रखने के लिए के साथ स्लाइस की आपूर्ति। समय चूक प्रयोग से पहले 2 अतिरिक्त घंटे के लिए प्रतीक्षा करें।
  2. , ऊतक स्लाइस में जीसी प्रवास कल्पना एक X2 के शुष्क उद्देश्य से लैस एक confocal लेजर स्कैनिंग macroscope के माध्यम से एक लेजर डायोड के माध्यम से एक 488 एनएम तरंगदैर्ध्य के प्रकाश के साथ तैयारी रोशन करने के लिए (काम करने दूरी: 39 मिमी, व्यास: 58 मिमी, एनए = .234), और 500 से 530 एनएम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन का पता लगाने।
    1. सूक्ष्मता जेन्टलमैन कैडटों के आंदोलन को हल करने के लिए, 2.0 1.5 से एक अतिरिक्त ऑप्टिकल जूम कारक के साथ छवियों को प्राप्त। एक ही फोकल हवाई जहाज़ में या z अक्ष के साथ 10 विभिन्न फोकल विमानों के लिए 12 घंटे के लिए हर 30 मिनट के लिए ऊपर GNS की छवियों को ले लीजिए।
    आवश्यक होने पर, कांच के कवर को हटाने और जीसी प्रवास पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक 10 μl विंदुक के साथ DMEM में जैविक activators या अवरोधकों की छोटी मात्रा (1-10 μl) जोड़ें।

6. सेल ट्रैकिंग

  1. फिल्म के लिए हर बार, ImageJ में ecart प्रकार मोड के माध्यम से z ढेर प्रक्षेपण प्रदर्शन करते हैं। इसके विपरीत मिलाना और लगातार छवियों की चमक स्तर पर पहचान और लेबल जेन्टलमैन कैडटों की ट्रैकिंग की सुविधा के लिए। मानचित्र (टी में = 0) संदर्भ स्नैपशॉट पर स्वयं प्रत्येक स्थिति।
    1. विश्लेषण कण मेनू में "मैनुअल ट्रैकिंग" प्लगइन का प्रयोग करें और समय चूक के दौरान प्रत्येक कोशिका के शरीर का गुरुत्व बिंदु पर क्लिक करके निर्धारित करते हैं। एक स्प्रेडशीट में कच्चे ट्रैकिंग डेटा निर्यात करें।
  2. प्रत्येक कोशिका और जुड़े पदों की पहचान करने वाली (PHP कोड में लिखा http://primacen.fr,) एक स्मार्ट घर का बना कार्यक्रम के साथ ImageJ से निर्यात कच्चे ट्रैकिंग डेटा को पुनर्संगठित करें। कार्यक्रम का उपयोग करना, calculatकुल यात्रा की दूरी और प्रत्येक कक्ष के लिए प्रवास की औसत गति ई। वर्गीकृत है और एक ही प्रोग्राम का उपयोग कर उपयुक्त फिल्टर के तहत नियंत्रण और उपचार की स्थिति में सेल प्रवास की विशेषताओं की तुलना करें।

Representative Results

वे अलग अलग cortical परतों 1 (चित्रा 1) क्रॉस के रूप में जल्दी प्रसव के बाद सेरिबैलम में, जेन्टलमैन कैडटों अपने मोड और पलायन की गति में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखा रहे हैं। इस अनुभाग में उनके प्राकृतिक सेलुलर परिवेश में जीसी प्रवास का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है कि परिणामों के उदाहरण दिखाता है। एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल P10 चूहे अनुमस्तिष्क ऊतक स्लाइस एक confocal macroscope (चित्रा 3) के तहत जांच कर रहे हैं और हम जेन्टलमैन कैडटों 18 माइक्रोन / घंटा की औसत गति (चित्रा 3 बी, सी) के साथ एमएल में त्रिज्यात विस्थापित कि दिखाते हैं। तिथि करने के लिए बातचीत की भूमिका / विनियामक कारकों और प्रत्येक cortical परत में सेल प्रवास के नियंत्रण में शामिल आणविक तंत्र सहित neuronal और glial कोशिकाओं के बीच संचार को काफी हद तक अज्ञात है। नतीजतन, मुख्य मुद्दा इन cortical परत-तकनीक और नवीनता में एक भूमिका निभा सकता है कि neuropeptides, न्यूरोट्रांसमीटर, Neurotrophins और बाह्य मैट्रिक्स घटकों की पहचान करने के लिए हैउनके स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान गति के FIC बदल जाता है। पिट्यूटरी adenylate साइक्लेज सक्रिय पॉलीपेप्टाइड (PACAP) पर भी एमएल और आईजीएल में कृन्तकों 7,10,11 में पहले दो प्रसव के बाद सप्ताह के दौरान, पीसीएल में मुख्य रूप से पता चला है। संस्कृति के माध्यम से PACAP38 (10 -6 एम) के आवेदन एमएल में जी सी के एक 79% की गति में कमी के परिणामस्वरूप। उदाहरण के लिए, एमएल में जेन्टलमैन कैडटों का पलायन वेग PACAP38 (चित्रा -4 ए) के प्रशासन के बाद 2.5 माइक्रोन / घंटा करने के लिए नियंत्रण की स्थिति में 11.9 माइक्रोन / घंटा से गिरा दिया। ऊतक प्रकार plasminogen उत्प्रेरक (टीपीए) ऐसी कोशिका आसंजन अणुओं या laminin के 12,13 के रूप में बाह्य मैट्रिक्स (ईएम) घटकों की गिरावट की ओर जाता है कि प्रोटियोलिटिक झरना का एक सदस्य है। टीपीए और plasminogen, टीपीए का एक सब्सट्रेट, प्रसव के बाद सेरिबैलम 14,15,16 के विकास के दौरान cortical परतों में पता चला रहे हैं। पै -1 (10 -7 एम), अंतर्जात टीपीए के एक अवरोध करनेवाला के प्रशासन, 78% जीसी द्वारा कमएमएल में माइग्रेशन। उदाहरण के लिए, जेन्टलमैन कैडटों पै -1 (चित्रा 4 बी) के अलावा के बाद 4.2 माइक्रोन / घंटा करने के लिए नियंत्रण की स्थिति में 19.2 माइक्रोन / घंटा से मिलीलीटर में माइग्रेशन गति कम हो। इन परिणामों के PACAP जीसी आंदोलनों पर और सेरीन प्रोटीज टीपीए के विकास चूहा सेरिबैलम के एमएल में जेन्टलमैन कैडटों के प्रवास की सुविधा है कि एक सीधा निरोधात्मक प्रभाव डाल रही है कि संकेत मिलता है।

चित्र 1
चित्रा 1: प्रसव के बाद अनुमस्तिष्क कॉर्टेक्स में जीसी प्रवास के 3 डी प्रतिनिधित्व। आईजीएल में 1-4, EGL में जीसी प्रक्रियाओं और स्पर्शरेखा प्रवास का विस्तार। 5, Bergmann glial फाइबर साथ एमएल में रेडियल माइग्रेशन। 6, पीसीएल में क्षणिक स्थिर चरण। 7, glial स्वतंत्र रेडियल माइग्रेशन। 8, समापन । लाल रंग में आईजीएल जीसी में जीसी प्रवास, छोटा दाना सेल, की, EGL, बाहरी बारीक परत, गहरे बैंगनी में बी, Bergmann glia; जी, गॉल्जी सेल, पीले रंग में, CF, चढ़ाई फाइबर, नीले रंग में, जी, postmigratory दाना कोशिकाओं, हल्के हरे रंग में, आईजीएल, आंतरिक बारीक परत, MFT, काई से भरा फाइबर टर्मिनल, गहरे हरे रंग में, पीसीएल, Purkinje सेल परत, प्रकाश बैंगनी में पी, Purkinje सेल,, एमएल, आणविक परत। यह आंकड़ा 5 से संशोधित किया गया है।

चित्र 2
चित्रा 2: P10 के अनुमस्तिष्क स्लाइस की पूर्व vivo संस्कृति (ए) P10 चूहे से विच्छेदित सेरिबैलम।। स्केल बार = 6 मिमी। Stereomicroscopy के माध्यम से 180 माइक्रोन मोटी अनुमस्तिष्क टुकड़ा रहने का (बी) सूक्ष्मछवि। स्केल बार = 3 मिमी। (सी)एक उच्च बढ़ाई, सेरिबैलम के चार cortical परतों (EGL, एमएल, पीसीएल, आईजीएल) को पहले ही साफ़ कर रहे हैं। स्केल बार = 1 मिमी। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बाद (डी), ऊतक स्लाइस 6 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति सम्मिलित करता है (24 मिमी व्यास) पर रखा जाता है। (ई) टिशू कल्चर इलाज किया पॉलिएस्टर झिल्ली के साथ एक संस्कृति डालने की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: चूहे P10 के सेरिबैलम के cortical परतों में जेन्टलमैन कैडटों के गतिशील प्रवास जेन्टलमैन कैडटों एक हरे रंग की cytoplasmic फ्लोरोसेंट डाई के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें एक P10 चूहे अनुमस्तिष्क टुकड़ा (ए) Macroconfocal दृश्य (XYZ, 2 डी प्रोजेक्शन)।। स्केल बार 75 माइक्रोन =। (बी) जीसी दिखा समय चूक इमेजिंगनियंत्रण परिस्थितियों में 4 घंटे के लिए confocal macroscopy द्वारा एमएल में आंदोलनों। तारांकित (*) प्रतीक जीसी सोमा के निशान। बीतासमय (मिनट में) प्रत्येक सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ के तल पर संकेत दिया है। स्केल बार 10 माइक्रोन =। (सी) जीसी सोमा द्वारा तय की गई दूरी में अनुक्रमिक बदल जाता है।

चित्रा 4
चित्रा 4:। जीसी प्रवास के न्यूरोपेप्टाइड और protease अवरोध करनेवाला का प्रभाव (ए) जीसी 2 नियंत्रण की स्थिति में मानव संसाधन और के लिए confocal macroscopy द्वारा एमएल में लगाया गया था तो पिट्यूटरी adenylate साइक्लेज सक्रिय पॉलीपेप्टाइड (PACAP) की उपस्थिति में 2 घंटे के लिए। (बी) जीसी नियंत्रण की स्थिति में 2 घंटे के लिए confocal macroscopy द्वारा एमएल में पता लगाया गया था और फिर plasminogen उत्प्रेरक अवरोध करनेवाला -1 (पै -1) की उपस्थिति में 2 घंटे के लिए।

Discussion

इस प्रोटोकॉल Transwell प्रणाली और confocal macroscopy के माध्यम से प्रसव के बाद विकास के दौरान सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट डाई के साथ जी सी के फ्लोरोसेंट लेबलिंग में तीव्र P10 चूहे अनुमस्तिष्क स्लाइस की संस्कृति का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल के 12 घंटा और प्रयोग के दौरान एगोनिस्ट या neuropeptides के विरोधी, एंजाइम inhibitors, सेल संकेत modulators या जहरीले पदार्थ सहित प्रवास में कारकों को विनियमित करने के संभावित भूमिकाओं का परीक्षण करने के लिए एक अवधि के लिए सेल प्रवास की टिप्पणियों की अनुमति देता है। एक विंदुक टिप के साथ झिल्ली डालने में एक छोटा सा छेद ऊष्मायन माध्यम में यौगिकों के प्रशासन की सुविधा के लिए आवश्यक है। एक घर का बना घुमावदार टिप पिपेट समाधान की डिलीवरी की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

ऊतक स्लाइस रहने पर सेल प्रवास के अध्ययन की एक मुद्दा ऊतक ही के आंदोलनों सेल मुश्किल ट्रैकिंग कर सकते हैं। पिछले दृष्टिकोण धीरे SLI को स्थिर करने का प्रस्ताव किया है जबकिएक नायलॉन के साथ CES जाल या चूहे की पूंछ कोलेजन 7,17 की एक पतली परत, इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ उद्देश्य के तहत सीओ 2 इनक्यूबेटर से झिल्ली आवेषण पर अनुमस्तिष्क स्लाइस युक्त 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली का सरल और सीधा हस्तांतरण है एक confocal macroscope की। एकीकृत तापमान और सीओ 2 नियंत्रकों को भी सेल प्रवास 9 के लिए आवश्यक उचित और निरंतर पर्यावरणीय मानकों को प्रदान करते हैं। इसलिए, संस्कृति की स्थिति स्लाइस अच्छी तरह से झिल्ली डालने से जुड़े होते हैं के बाद से कम से कम कर रहे हैं टिप्पणियों और ऊतक आंदोलनों के दौरान रखा जाता है। ऊतक के स्थिरीकरण अधिग्रहण के दौरान सन्दर्भ तय की जानी चाहिए कि टुकड़ा किनारों या Purkinje कोशिकाओं की स्थिति का पालन करके सत्यापित है। इसके अलावा, थाली के 6 कुओं में वितरित अनुमस्तिष्क स्लाइस (12 के बीच और 18) जल्दी से एक मोटर चालित मंच और एक ऑप्टिकल ज़ूम के साथ विस्तार से देखा जा सकता है। कारण ड्राई उद्देश्य, महामारी की बड़ी काम दूरी (x2, 39 मिमी)संस्कृति के माध्यम से ज्यादा आसान होता है में -observation यौगिकों के विसर्जन और प्रशासन के लिए स्वतंत्र है। इसलिए, सीओ 2 इनक्यूबेटर और confocal में पर्यावरण मानकों और संस्कृति समर्थन समानताएं जैविक नमूने की अधिकतम संरक्षण के लिए नेतृत्व macroscopy।

प्रोटोकॉल का एक और लाभ को देखने के बड़े क्षेत्र और एक साथ देखा जा सकता है कि कोशिकाओं के फलस्वरूप बड़ी संख्या है। उदाहरण के लिए, हम पहले एमएल में रेडियल प्रवास के साथ फ्लोरोसेंट जेन्टलमैन कैडटों का घनत्व 1124 ± 138 सेल / 2 मिमी 18 थी कि निर्धारित किया है। Confocal macroscopy (x2, एनए 0.234 =) confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना में एक कम पार्श्व संकल्प किया है (40x, एनए = 1.25), लेकिन दो तकनीकी 7,18 दृष्टिकोणों के बीच सेल जेन्टलमैन कैडटों के शव को आसानी से लगाया जा सकता है और प्रवास की औसत गति तुलनीय है ।

छवि अधिग्रहण ऊतक स्लाइस और वीं की गुणवत्ता के लिए तकनीकी सुधार के अलावालेबलिंग के ई गुणवत्ता सफल प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण बातें हैं। हमेशा विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर मीडिया और ऊतकों रखने के लिए, vibratome ब्लेड पर तेल खत्म करने और गोंद के साथ संपर्क में ऊतक के स्लाइस का उपयोग नहीं करते। बाण के समान और अनुप्रस्थ वर्गों क्रमश रेडियल और स्पर्शरेखा प्रवास करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। सेरिबैलम के विभिन्न cortical परतों में उपयुक्त पता लगाने के लिए ऊष्मायन के विभिन्न लंबाई का उपयोग करें। (8 घण्टे तक) लांग ऊष्मायन बार PCL और आईजीएल में कई जेन्टलमैन कैडटों के पलायन का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं। जीसी प्रवास विशिष्ट spatio- अस्थायी खिड़कियों के दौरान एक शारीरिक प्रक्रिया है, सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं को ठीक विस्थापित करने के लिए किया है। विशेष रूप से, एमएल में कई धुरी जीसी बाण के समान अनुमस्तिष्क स्लाइस के लिए मुख्य स्वास्थ्य सूचक से एक है। प्रयोगों के शुरू करने के लिए, एमएल में जीसी आंदोलनों का अवलोकन सुझाव दिया है। दरअसल, खड़ी लम्बी सेल शरीर के साथ जी सी के आकार एसी शुरू करने के लिए एक संदर्भ बिंदु के रूप में माना जाना चाहिएलगातार नियंत्रण (2 घंटा) और उपचार (2 घंटा) आसानी एमएल में प्रदर्शन किया जा सकता है कि समय के साथ quisition।

सेल ट्रैकर परिवार या आनुवंशिक निर्माणों के माध्यम से व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे फ्लोरोसेंट रंजक सेल प्रवास के अध्ययन के लिए ट्रेसर रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। कारण जीसी माइग्रेशन (1 स्टैक हर 30 मिनट) की धीमी गति से कैनेटीक्स के लिए, बहुरंगा प्रयोगों भी सिस्टम पर 4 लेज़रों बीम (405, 488, 532 और 633 एनएम) के बाद से अनुक्रमिक मोड में उपलब्ध हैं प्रदर्शन किया जा सकता है। अन्य interneurons की ट्रैकिंग, केन्द्राभिमुख और केन्द्रापसारक रेडियल प्रवास को ध्यान में रखते भी 18 से महसूस किया जा सकता है। विशेष रूप से, कम कई प्रकार की कोशिकाओं और अधिक आसानी से देखने के एक बड़े क्षेत्र के साथ स्थानीयकृत किया जा सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल अनुमस्तिष्क विकास के अन्य चरणों बल्कि अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

- (PeReNE, Interreg -4 ए ERDF) इस काम बायोमेडिसिन में अनुसंधान और नवाचार के लिए संस्थान (IRIB), नॉरमैंडी की सेल इमेजिंग मंच (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, रूऑन के विश्वविद्यालय, यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि द्वारा समर्थित किया गया LARC-न्यूरोसाइंसेस नेटवर्क और क्षेत्र Haute-Normandie।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 Sigma-Aldrich D8437
Hank's balanced salt solution 10x Sigma-Aldrich H1641
PACAP38 INRS, Canada Bourgault et al., 200919
PAI-1 Calbiochem 528208
N-2 supplement Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen O973
Cyanoacrylate glue Loctite
Cell Tracker Green CMFDA Invitrogen C2925
Polyester Transwell-Clear inserts Corning 3452
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
6-well cell culture cluster Corning 3516
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Tissue culture dish 35 mm diameter BD Falcon 353004
Tissue culture dish 100 mm diameter Thermo SCIENTIFIC 130182
Polypropylen tube (15 ml) BD Falcon 352096
Ethanol 70% Fisher Chemical E/0800DF/21
Biological safety cabinet fume hood Thermo Scientific MSC9 Class II A2
Adjustable-volume pipette (0.5-10 µL) Eppendorf 4910 000.018
Gyro-rocker, SSL3 Stuart
CO2 incubator, Hera Cell 150 Thermo Scientific
Vibrating blade microtome, VT1000S Leica Microsystems
Confocal macroscope, TCS LSI Leica Microsystems
Temperature controller PeCon
CO2-controller PeCon
Stereomicroscope, M205 C Leica Microsystems
Operating scissors, curved, blunt/blunt Medicon 03.03.17
Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp FST 149090-11
Dumont #3 and #5 forceps FST 11293-00 and 11252-20
Vibratome injector blades/single edge Leica Microsystems 39053250
Standard scalpel handle #3 solid FST 10003-12
Surgical blade #15 Swann-Morton 205

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References

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Bénard, M., Lebon, A., Komuro, H., Vaudry, D., Galas, L. Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy. J. Vis. Exp. (99), e52810, doi:10.3791/52810 (2015).

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