Abstract
Under postnatal utveckling, omogna komceller (excitatoriska interneuroner) uppvisar tangentiell migration inom utrikes granulära skiktet, och sedan radiell migration i molekylskiktet och Purkinje cellagret att nå inre granulära skiktet av lillhjärnan cortex. Standard migrationsprocesser framkallar antingen celldöd eller felplacering av nervceller, vilket leder till underskott i olika cerebellära funktioner. Centripetal granulat cellmigration involverar flera mekanismer, såsom kemotaxi och extracellulära matrixnedbrytning, för att styra cellerna mot sin slutliga ståndpunkt, men de faktorer som reglerar cellmigration i varje kortikala skikt endast delvis kända. I vår metod är akut cerebellär skivor framställs från P10 råttor är komceller märkt med ett fluorescerande cytoplasma markör och vävnader odlas på membraninsatser från 4 till 10 timmar innan realtidsövervakning av cellmigration genom konfokal makroskopi vid 37 ° C inärvaro av CO2. Under sin vandring i de olika kortikala skikt av lillhjärnan, kan granulat celler exponeras för neuropeptid agonister eller antagonister, proteashämmare, blockerare av intracellulära effektorer eller ens giftiga ämnen som alkohol eller metylkvicksilver att undersöka deras eventuella roll i regleringen av neuronala migration .
Introduction
I utvecklings cerebellum är åtta olika typer av neuroner producerade sekventiellt mellan den andra embryonala veckan och den andra postnatal veckan hos gnagare en. Ursprung ursprungligen från en primär germinal zon, omogna komceller (GC) är de senaste nervceller som ska produceras från den externa granulära skiktet (EGL), en sekundär embryon zon 2. Under de tre första postnatala veckor, är den cerebellär cortex en folierade struktur organiserad i fyra skikt, inklusive EGL, molekylskiktet (ML), Purkinje cellskiktet (PCL) och det inre granulära skiktet (IGL) (Figur 1). Genom centripetala migration, omogna GC, glutamaterga interneuroner, når IGL inom ca 2 dagar. Genom den tredje postnatal veckan, försvinner EGL och IGL utgör vad som kallas det granulära skiktet (GL) i den vuxna lillhjärnan. I GL, GC får excitatoriska synaptiska ingångar från mossiga fibrer och unipolära borstceller, ochhämmande synaptiska ingångar från Golgi cell axoner. I ML, GC axoner göra excitatoriska synapser med GABAergic nervceller inklusive Purkinje celler, korg celler, stellate celler, och Golgi celler 2.
Realtids observation av cellrörelse i akut cerebellär skivor som erhållits från tidig postnatal gnagare visar att GC ändra sin form samtidigt med ändringar i modalitet och hastighet migration under sin rutt i lillhjärnan kortex 3. Under de två första postnatal veckor, GC prekursorer aktivt föröka sig på toppen av EGL. I den mellersta delen av EGL, postmitotisk GCs migrera tangentiellt i riktning mot deras större process. Vid gränsen mellan EGL-ML, GC bromsa deras rörelse, cellerna börjar ange en kort vertikal fallande processen i ML. I ML, GC har en vertikalt långsträckt cellkroppen, en tunn bakre process och en mer omfattande ledande process, och migrera radiellt längs Bergmann gliaceller fibrer. IPCL, GC stoppa deras rörelse men efter en långvarig stationär fas (2 timmar), de gränsöverskridande PCL-IGL. I IGL, GC migrera mot botten av skiktet i avsaknad av stöd glial fibern. När spetsarna på ledande processen närmar IGL-vita substansen (WM) gränsen, GC långsamt och stoppa deras rörelse. Tvärgående delar av lillhjärnan är att föredra för tangentiella migrationsstudier i EGL medan sagittalsnitt är avsedda för radiella migration i ML, PCL och IGL. Vissa regleringsfaktorer GC rörelser inklusive neuropeptider (t.ex. somatostatin, PACAP) har identifierats hittills, men de fullständiga mekanismer som är involverade i spatiotemporala kontroll av GC migration i varje kortikala skikt är fortfarande till stor del okända 1,4,5,6.
GC migration har studerats under de senaste 20 åren genom video- och konfokalmikroskopi med antingen sänds ljus belysning för isolerade odlade celler eller fluorescensdetektering för ACUte cerebellär skivor. Inledningsvis lipofila Dil, och på senare tid "Cell Tracker" färgämnen och cell uttryckt fluorescerande proteiner användes för konfokala eller två foton mikroskopi 7,8. Framgångsrika försök beror på ett antal särskilda förfaranden som gör protokollet enkel men inte lätt. Särskilt akuta skivor måste stabiliseras under observationer i allmänhet med en hemmagjord nylon mesh-nätverk 9. Intensiteten av ljus belysning måste vara så låg som möjligt för att undvika fototoxicitet och fotoblekning som föreslagits av multiskanning konfokalmikroskop strategi. Dessutom, temperatur och CO2 är viktiga miljöparametrar eftersom instabilitet kan påverka neuronal migration. För att underlätta och förbättra de experimentella förfaranden, har vi utvecklat ett konfokalt makroskopi protokoll som begränsar skiva rörelser, ger konstant miljöparametrar, minskar fotoblekning, ökar synfältet (i storleksordningen millimetrar) och consequlunda antalet celler (dussintals) som kan spåras genom bildanalys. Således, 180 um tjocka skivor odlas på membraninsatser, och 6-brunnsplattor överförs direkt under 2X motoriserad målet om en kommersiell konfokal makroskop utrustad med en stor inkubationskammare, temperatur och CO 2 controllers och en vibrationsstyrsystem. Tidsbortfaller och z-stackar utförs sedan under flera timmar och farmakologiska verktyg eller bioaktiva molekylerna kan läggas till eller levereras i inkubationsmediet. Denna metod kan också anpassas för att studera migrationen av andra typer av neuroner i cerebellum eller hjärnan vid olika utvecklingsstadier.
Protocol
Djur (manliga eller kvinnliga Wistar råttor) är födda och uppvuxna i ett ackrediterat djuranläggning (godkännande B.76-451-04), enligt den franska guiden för vård och användning av försöksdjur. Experiment genomfördes under överinseende av behörig utredare (MB, DV och LG) i enlighet med Europeiska gemenskapen Rådets direktiv (2010/63 / UE den 22 september 2010) och det franska jordbruksministeriet.
1. Beredning av media och verktyg
- I ett biologiskt säkerhetsskåp, förbereda 1x Hanks BSS (HBSS) i sterilt vatten från 10x stamlösning innehållande CaCl2 (1,85 g / L) / MgSO 4 (0,9767 g / I) utan MgCl2. Lägg NaHCOs 3 (350 mikrogram / ml) till 1x lösning HBSS.
- I ett biologiskt säkerhetsskåp, till N2 tillägg (från en 100 x stamlösning) och penicillin (100 enheter / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) lösning till Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) näringsämne blandningTure F-12 (1: 1).
- I sterila betingelser, förbereda en alikvot (25 ^ il, 2 mM) av den cytoplasmatiska fluorescerande färgämne kallas Cell Tracker Green i DMSO (1,075 ml för 1 mg). Späd en delmängd i 5 ml DMEM i en 15 ml koniska rör.
- Förbered fylld ice hink för att hålla media vid 4 ° C.
- Sanera laboratorie toppar bänk och verktyg med 70% etanol.
2. Dissekering av Cerebellum från P10 råttor
- Snabbt halshugga råttungar (P10) med böjda rörelse sax bakom öronen för att få i början av ryggmärgen.
- Längst bak-sidan av avhuggna huvud, göra mittlinjen snitt i huden från halsen till näsan med fina iris sax och separera huden från skallen med fina iris sax och Dumont # 3 pincett.
- Använd fin iris sax till fint göra två laterala snitt från basen till den rostrala regionen av skallen. Ta dissekerade skallen med två # 3 pincett. Lossa behåin från någon anslutning med skallen använder samma pincett.
- Överför hjärnan med sked i slutet av en spatel till petriskål (Ø 35 mm) innehållande 2 ml iskall HBSS medium.
- Placera petriskål med hjärnan i större petriskål (diameter 100 mm) full av is och överför till det skede av stereomikroskop.
- Enligt ett stereomikroskop, isolera lillhjärnan från hjärnan genom dilaceration med två # 3 pincett. På liknande sätt avlägsna resterande ryggmärgen och pial-membranet.
- Överför lillhjärnan i ett nytt HBSS-fyllda petriskål (diameter 35 mm, 2 ml) med sked änden av en spatel och hålla på is.
3. Framställning av akuta Cerebellar Slices
- Under stereomikroskop, skär lillhjärnan mellan vermis och den högra hjärnhalvan som indikeras av de två huvuden pil i figur 2A med en standard skalpell handtag # 3 fast och en # 15 kirurgiskt blad.
- Placera en droppe av cyanoacrylate lim på vibratome provskivan och vänta 15-25 sekunder för att eliminera giftiga lösningsmedelsångor.
- Samla snittet lillhjärnan med sked i slutet av en spatel och avlägsna överskott HBSS med rena pappershanddukar.
- Ta lillhjärnan nära preparatskivan. Fäst den skurna kanten till preparatskivan och vänta 10 sek.
- Sätt provet skivan i buffertbrickan med manipulatorn, och vrid den så den tvärgående axeln av lillhjärnan är vinkelrät mot knivhållaren. Fäst preparatskivan med en insexnyckel och fyll försiktigt buffertbrickan med HBSS medium tills lillhjärnan är täckt.
- Belastning krossad is i kylbadet.
- Rengör blad tre gånger med 70% etanol för att eliminera varje olja.
- Sätt i bladet i knivhållaren och säkra med spännskruven.
- Placera bladeggen höger bakom den bakre kanten (från användarens vy) av provet och definiera det som en utgångspunkt. Använd framåt kommandot för att definiera than slutpunkten efter den främre kanten av provet.
- Välj snittningshastigheten vid 2,5 och snittning frekvens vid 8. Välj trimnings tjocklek vid 180 um. Börja vävnadssnittning.
- Plocka upp varje avsnitt med hjälp av ett brett hål glas stympad pasteurpipett och överföring till HBSS innehållande petriskål (Ø 35 mm) hålls på is.
- Med hjälp av två # 5 pincett, ta bort hjärnhinnorna försiktigt från lillhjärnan när störa bladet. Samla högst fem skivor per lillhjärnan (Figur 2B, C).
- Ta bort mening från cerebellär skivor försiktigt med två # 5 pincett under stereomikroskop och separera lobules försiktigt för bättre sond lastning.
4. Fluorescerande färgning av levnads- Interneuroner
- Överför cerebellära skivor med ett brett hål glas stympad pasteurpipett till en 6-brunnar (max 3 skivor / per brunn). Aspirera HBSS-medium.
- Inkubera skivor (3 max) i 5 ml loading lösning av det fluorescerande färgämnet (10 | iM).
- För att skydda mot ljus, täcka mikro med aluminiumfolie. Sätt den på en gyro rörliga bordet vid 35 varv per minut under 10 minuter vid rumstemperatur för att underlätta cellmärkning.
- Överför skivor på membranet i en Transwell infoga (3,0 pm porstorlek, Figur 2D) med ett brett hål glas stympad pasteurpipett. Aspirera laddningsmediet med pipett.
- Ta bort insatsen och fyll brunnen med 1,9 ml DMEM. Sätt tillbaka insatsen och tillsätt 100 | il av DMEM ovanpå segmentet för att täcka vävnaden.
- Placera plattan innehåller kulturinsatser i inkubatorn kammaren (37 ° C, 5% CO2) under 2 timmar, vilket är tillräckligt för att konstatera GC i ML. Lie vävnader platta för att möjliggöra fastsättning på insatsen membran (Figur 2E). Se till att skivorna inte torkar.
5. Ex vivo Imaging Genom Confocal makroskopi
- Överför plattan utanplastlocket i en inkubator ansluten till monter ett konfokalt makroskop. Placera en glaskupa på plattan insatsen av makroskop. Hålla temperaturen hos kammaren vid 37,0 ° C ± 0,5 ° C och förse skivorna med konstant gasflöde (95% O2, 5% CO2) genom plattinsatsen för att hålla pH konstant. Vänta 2 extra timmar innan time-lapse experiment.
- Att visualisera GC migrering i vävnadsskivor, belysa beredningen med en 488 nm våglängd ljus med hjälp av en laserdiod genom ett konfokalt laserskanningsmakroskop utrustad med en X2 torr mål (arbetsavstånd: 39 mm, diameter: 58 mm, NA = 0,234), och upptäcka fluorescensemission 500-530 nm.
- Att fint lösa rörelse GC, få bilder med en extra optisk zoomfaktor på 1,5 till 2,0. Samla bilder av GNS i ett enda fokalplan eller upp till 10 olika fokalplan längs z-axeln var 30 min i upp till 12 timmar.
6. Cellspårning
- För varje gång av filmen, utför z-stack projektion genom Ecart typ läge i ImageJ. Modulera kontrast och ljusstyrka nivåerna av de successiva bilderna för att underlätta identifiering och spårning av märkta GC. Karta manuellt varje position på referensbild (vid t = 0).
- Använd "Manuell tracking" plugin i Analyse Partikel Meny och avgöra genom att klicka på allvar punkten för varje cellkroppen under time-lapse. Exportera råspårningsinformation i ett kalkylblad.
- Omorganisera exporterade råspårningsdata från ImageJ med en smart hemgjorda program (http://primacen.fr, skriven i PHP-kod) som identifierar varje cell och tillhörande lägen. Med hjälp av programmet, erhållie totalt ryggalagd körsträcka och medelhastighet på migration för varje cell. Klassificera och jämföra egenskaperna hos cellmigration i kontroll- och behandlingsförhållanden under lämpliga filter som använder samma program.
Representative Results
I början av postnatal lillhjärnan, GC uppvisar betydande förändringar i deras läge och hastighet migration när de passerar olika kortikala skikt 1 (Figur 1). Det här avsnittet visar exempel på resultat som kan erhållas genom att studera GC migration i deras naturliga cellulära miljö. P10 råttcerebellära vävnadsskivor märkta med ett grönt fluorescerande färgämne undersöktes under ett konfokalt makroskop (Figur 3A) och vi visar att GC migrera radiellt i ML med en medelhastighet på 18 um / h (Figur 3B, C). Hittills roll interaktioner / kommunikation mellan neuronala och gliaceller inklusive regulatoriska faktorer och molekylära mekanismer som är involverade i kontrollen av cellmigration i varje kortikala skikt är i stort sett okända. Följaktligen är den viktigaste frågan att identifiera neuropeptider, signalsubstanser, neurotrofiner och extracellulära matrixkomponenter som skulle kunna spela en roll i dessa kortikala skikt specifikaFIC förändringar av hastigheten under sin migrationsprocessen. Pituitary adenylatcyklas-aktiverande polypeptid (PACAP) upptäcks främst i PCL, men också i ML och IGL under de två första postnatal veckor i gnagare 7,10,11. Tillämpning av PACAP38 (10 -6 M) till odlingsmediet resulterade i en 79% hastighetsminskning av GC i ML. Till exempel, migration hastighet GC i ML sjönk från 11,9 um / h under kontrollförhållanden till 2,5 pm / h efter administrering av PACAP38 (Figur 4A). Vävnadstyp (tPA) är en medlem av den proteolytiska kaskaden som leder till nedbrytning av extracellulär matris (EM) komponenter såsom cellvidhäftningsmolekyler eller laminin 12,13. tPA och plasminogen, ett substrat för tPA, detekteras i kortikala skikt under utvecklingen av postnatal cerebellum 14,15,16. Administration av PAI-1 (10 -7 M), en hämmare av endogen tPA, minskat med 78% GCmigration i ML. Exempelvis GC reducerade migrationshastighet i ML från 19,2 ^ m / h i kontrollbetingelser till 4,2 ^ m / h efter tillsats av PAI-1 (Figur 4B). Dessa resultat indikerar att PACAP utövar en direkt inhiberande effekt på GC rörelser och att serinproteaset tPA underlättar migreringen av GC i ML av framkallnings råttcerebellum.
Figur 1: 3D-representation av GC migration i postnatal cerebellar cortex. 1-4, Förlängning av GC processer och tangerar migration i EGL. 5, Radial migration i ML längs Bergmann gliaceller fibrer. 6, Gående stationär fas i PCL. 7, Gliaceller oberoende radiell migration i IGL. 8, Slutförande GC migration i IGL GC, granulat cell, i rött;. EGLExtern granulära skiktet, B, Bergmann glia i mörkt lila, G, Golgi cell, i gult, jfr, klättring fibrer, i blått, g, postmigratory granulceller, i ljusgrönt, IGL, inre granulära skiktet, MFT, mossiga fiber terminal, i mörkgrönt, ML, molekylär skikt; P, Purkinje cell i ljuslila, PCL, Purkinje cellager. Denna siffra har ändrats från 5.
Figur 2: Ex vivo kultur P10 lillhjärnan skivor (A) Dissekerad lillhjärnan från P10 råtta.. Skalstreck = 6 mm. (B) Micrograph av levande 180 um tjock cerebellär skiva genom stereomikroskopi. Skalstreck = 3 mm. (Katten högre förstoring, de fyra kortikala skikt (EGL, ML, PCL, IGL) i lillhjärnan är redan urskiljbara. Skalstreck = 1 mm. (D) Efter fluorescensmärkning, är vävnadsskivor placeras på odlingsinsatser (24 mm diameter) i en 6-brunnsplatta. (E) Schematisk bild av en odlingsinsatsen med vävnadsodling behandlad polyester membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Dynamisk migration av GC i de kortikala skikten av rått-P10 cerebellum (A) Macroconfocal vy (xyz, 2D-projektion) hos en P10 råtta cerebellär skiva där GC är märkta med en grön cytoplasmatisk fluorescerande färgämne.. Skalstreck = 75 | im. (B) Time-lapse avbildning visar GCrörelser i ML från konfokala makroskopi för 4 timmar i kontrollbetingelser. Asterisk (*) symbolen markerar GC soma. Förfluten tid (i min) anges på botten av varje mikrofotografi. Skalstreck = 10 | im. (C) Sekventiella förändringar i den sträcka som GC-soma.
Figur 4:. Effekt av neuropeptid och proteashämmare GC migration (A) GC spåras i ML genom konfokal makroskopi under 2 timmar i kontrollförhållanden och sedan under 2 timmar i närvaro av hypofys adenylatcyklas-aktiverande polypeptid (PACAP). (B) GC spåras i ML genom konfokal makroskopi för 2 h i kontrollbetingelser och sedan under 2 timmar i närvaro av plasminogenaktivator-inhibitor-1 (PAI-1).
Discussion
Detta protokoll beskriver kulturen i akuta P10 råttcerebellära skivor i Transwell-systemet och den fluorescerande märkning av GC med ett grönt fluorescerande färgämne för att studera cell migration under postnatal utveckling genom konfokal makroskopi. Detta protokoll gör observationer av cellmigration under en period upp till 12 timmar och provning av möjliga roller att reglera faktorer i migrations inklusive agonister eller antagonister till neuropeptider, enzymhämmare, cellsignalering modulatorer eller giftiga ämnen under försöket. Ett litet hål i membranet insatsen med en pipettspets är nödvändigt för att underlätta administrering av föreningar i inkubationsmediet. En hemmagjord böjd spets pipett kan användas för att underlätta leverans av lösningen.
En fråga av cellmigrationsstudier på levande vävnadsskivor är att rörelserna hos vävnaden i sig kan göra cellspårnings svårt. Medan tidigare tillvägagångssätt har föreslagits för att försiktigt stabilisera slices med nylonnät eller ett tunt skikt av råttsvanskollagen 7,17, är en stor fördel med denna teknik enkel och direkt överföring av en 6-brunnsodlingsplatta innehållande cerebellär skivor på membraninsatser från CO2 inkubator under målet av ett konfokalt makroskop. Integrerad temperatur och CO 2 controllers ger också lämpliga och konstanta miljöparametrar som är väsentliga för cellmigration 9. Därför odlingsbetingelser hålls under observationer och vävnadsrörelser minimeras eftersom skivor är väl fäst vid membraninsatsen. Stabilisering av vävnaden verifieras genom att följa läget för skiva kanter eller Purkinje celler som bör fastställas referenser under förvärvet. Dessutom kan cerebellär skivor (mellan 12 och 18) fördelade på 6 brunnar i plattan snabbt observeras i detalj med en motoriserad scen och en optisk zoom. På grund av den stora arbetsavstånd (X2, 39 mm) av den torra målet, epi-observation är fri från nedsänkning och administrering av föreningar i odlingsmediet är mycket lättare. Därför makroskopi miljöparametrar och kultur stöd likheter i CO 2 inkubator och konfokal leda till maximal bevarande av det biologiska provet.
En annan fördel med protokollet är det stora synfältet och följaktligen det stora antalet celler som kan observeras samtidigt. Till exempel har vi tidigare bestämts att densiteten för fluorescerande GC med radiell migration i ML var 1124 ± 138 celler / mm 2 18. Confocal makroskopi (X2, NA = 0,234) har en lägre lateral upplösning jämfört med konfokalmikroskopi (40X, NA = 1,25) men cell organ GC kan lätt spåras och den genomsnittliga hastigheten på migration är jämförbara mellan de två tekniska närmar 7,18 .
Förutom teknisk förbättring för bild förvärv, kvaliteten på vävnadssnitt och the kvaliteten på märkningen är viktiga poäng för lyckade experiment. Håll alltid media och vävnader på is under dissekering processer, eliminera olja på vibratome blad och inte använder skivor av vävnad i kontakt med lim. Sagittal och tvärsektioner är anpassade till radiella och tangentiella migration respektive. Använd olika längder av inkubation under lämplig detektion i olika kortikala skikt av lillhjärnan. Långa inkubationstider (upp till 8 timmar) är nödvändiga för att detektera migreringen av många GC i PCL och IGL. Eftersom GC migration är en fysiologisk process under vissa spatio-temporala fönster, är den positiva kontrollen att cellerna måste migrera ordentligt. Framför allt är många spindel GC i ML en av de viktigaste hälsoindikatorer för sagittal cerebellär skivor. För att starta experiment, är observation av GC rörelser i ML föreslog. I själva verket bör formen av GC med vertikalt långsträckt cellkropp betraktas som en referenspunkt för att starta acförvärvs med successiv kontroll (2 timmar) och behandling (2 tim) perioder som lätt kan utföras i ML.
Fluorescerande färgämnen som Cell Tracker familjen eller fluorescerande proteiner uttryckta genom genetiska konstruktioner kan användas som spårämnen för cellmigrationsstudier. På grund av den långsamma kinetiken för GC migration (1 stack var 30 min), kan multi experiment även utföras i sekventiell mod sedan 4 laser balkar (405, 488, 532 och 633 nm) är tillgängliga på systemet. Med tanke på centripetal och centrifugal radiell migration, spårning av andra interneuronen kan också åstadkommas 18. I synnerhet kan mindre talrika celltyper lättare lokaliseras med ett stort synfält. Slutligen kan detta protokoll användas för att studera cell migration i andra led i cerebellär utveckling men även andra områden i hjärnan.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av institutet för forskning och innovation i biomedicin (IRIB), Cell Imaging plattformen för Normandie (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, University of Rouen, Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF - PeReNE, Interreg 4A), den LARC-Neurovetenskap Network och Région Haute-Normandie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10x | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| Biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| Adjustable-volume pipette (0.5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| Gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| Vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| Confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| Temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| Standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| Surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H.
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton, FL. (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
