Abstract
Durante lo sviluppo postnatale, granuli immaturi (interneuroni eccitatori) mostrano migrazione tangenziale strato granulare esterno, e poi la migrazione radiale nello strato molecolare e lo strato di cellule di Purkinje per raggiungere lo strato granulare interna della corteccia cerebellare. Predefinito in processi migratori induce o morte cellulare o smarrimento dei neuroni, portando a deficit in diverse funzioni cerebellari. Migrazione cellulare granule centripeta coinvolge diversi meccanismi, come chemiotassi e degradazione della matrice extracellulare, per guidare le cellule verso la loro posizione finale, ma i fattori che regolano la migrazione delle cellule in ogni strato corticale sono solo parzialmente noti. Nel nostro metodo, fettine cerebellari acute sono preparati da P10 ratti, cellule granulari sono etichettati con un marcatore fluorescente e citoplasmatica tessuti sono coltivate su inserti membrana da 4 a 10 ore prima di iniziare il monitoraggio in tempo reale della migrazione cellulare da macroscopia confocale a 37 ° C nelpresenza di CO 2. Durante la loro migrazione nei diversi strati corticali del cervelletto, i granuli possono essere esposti agli agonisti o antagonisti neuropeptidi, gli inibitori della proteasi, antagonisti di effettori intracellulari o sostanze addirittura tossiche come alcol o metilmercurio per indagare il loro possibile ruolo nella regolazione della migrazione neuronale .
Introduction
Nel cervelletto in via di sviluppo, otto diversi tipi di neuroni sono prodotti in sequenza tra la seconda settimana embrionale e la seconda settimana postnatale nei roditori 1. Provenienti inizialmente da una zona germinale primaria, granuli immaturi (GC) sono gli ultimi neuroni da produrre dallo strato esterno granulare (EGL), una zona germinale secondario 2. Durante le prime tre settimane postnatali, la corteccia cerebellare è una struttura lamellare organizzata in quattro strati tra cui la EGL, lo strato molecolare (ML), lo strato di Purkinje cella (PCL) e lo strato granulare interno (IGL) (Figura 1). Attraverso la migrazione centripeta, immaturo GC, interneuroni glutamatergiche, raggiungere la IGL entro circa 2 giorni. Con la terza settimana post-natale, la EGL scompare e l'IGL costituisce il cosiddetto strato granulare (GL) nel cervelletto adulto. Nella GL, GC ricevere ingressi sinaptici eccitatori da fibre muschio e le cellule pennello unipolari, eingressi sinaptici inibitori di assoni delle cellule Golgi. Nel ML, assoni GC fanno sinapsi eccitatorie con i neuroni GABAergici, comprese le cellule di Purkinje, cellule cestino, cellule stellate e cellule Golgi 2.
Osservazione in tempo reale di movimento delle cellule in fettine cerebellari acute ottenuti dai primi roditori postnatali dimostra che GCs modificano la loro forma in concomitanza con i cambiamenti nella modalità e la velocità di migrazione durante il loro percorso nella corteccia cerebellare 3. Nelle prime due settimane postnatali, precursori GC proliferano attivamente nella parte superiore della EGL. Nella parte centrale della EGL, postmitotici GC migrare tangenzialmente nella direzione del loro processo più ampio. Al confine EGL-ML, GC rallentare il loro movimento, le cellule iniziano a entrare in un processo breve discesa verticale nella ML. Nel ML, GC ha un corpo cellulare allungato in verticale, un processo finale sottile e un processo che porti più voluminoso, e migrano radialmente lungo le fibre gliali Bergmann. NelPCL, GC fermare il loro movimento, ma dopo una fase stazionaria prolungata (2 ore), che attraversano la frontiera PCL-IGL. Nel IGL, GC migrano verso il fondo dello strato in assenza di supporto in fibra gliale. Una volta che le punte del processo che conduce avvicinarsi al confine sostanza IGL-bianca (WM), GC lento e l'arresto del movimento. Sezioni trasversali del cervelletto sono preferiti per studi sulle migrazioni tangenziali nel EGL mentre fette sagittali sono dedicati alla migrazione radiale nel ML, PCL e IGL. Alcuni fattori di regolamentazione dei movimenti GC compreso neuropeptidi (ad esempio, la somatostatina, PACAP) sono stati individuati finora, ma i meccanismi completi coinvolti nel controllo spazio-temporale delle migrazioni GC in ogni strato corticale sono ancora in gran parte sconosciute 1,4,5,6.
Migrazione GC è stato studiato nel corso degli ultimi 20 anni attraverso video e microscopia confocale in illuminazione luce sia trasmessa per colture cellulari isolate o rivelazione a fluorescenza per acufettine cerebellari te. DII Inizialmente lipofile e, più recentemente "Tracker cellulare" coloranti e proteine fluorescenti di cellule espresso sono stati utilizzati per confocale o microscopia a due fotoni 7,8. Esperimenti di successo dipendono da una serie di procedure specifiche che rendono il protocollo semplice ma non facile. In particolare, fette acuta devono essere stabilizzati durante le osservazioni generalmente con una fatta in casa di nylon della maglia della rete 9. L'intensità di illuminazione luce deve essere la più bassa possibile per evitare fototossicità e photobleaching come proposto dalla scansione multipoint approccio microscopio confocale. Inoltre, la temperatura e CO 2 sono parametri ambientali da instabilità possono influire migrazione neuronale. Per facilitare e perfezionare le procedure sperimentali, abbiamo sviluppato un protocollo macroscopia confocale che limita i movimenti fetta, assicura parametri ambientali costanti, riduce photobleaching, aumenta il campo visivo (dell'ordine di millimetri) e consequdipendentemente dal numero di cellule (decine) che possono essere monitorati mediante analisi dell'immagine. Così, 180 micron fette spesse sono coltivate su inserti di membrana, e 6 pozzetti vengono trasferiti direttamente sotto un obiettivo motorizzato 2X di un macroscope confocale commerciale dotata di una grande camera di incubazione, la temperatura e CO 2 controller e un sistema di controllo delle vibrazioni. Time-decade e z-stack vengono poi effettuate per diverse ore e strumenti farmacologici o molecole bioattive possono essere aggiunti o consegnati nel mezzo di incubazione. Questo metodo potrebbe anche essere adattato per studiare la migrazione degli altri tipi di neuroni nel cervelletto o cerebrum a diversi stadi di sviluppo.
Protocol
Animali (maschi o ratti Wistar femmine) sono nati e allevati in una struttura accreditata animali (approvazione B.76-451-04), secondo la guida francese per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli esperimenti sono stati condotti sotto la supervisione di ricercatori autorizzati (MB, DV e LG), in conformità con la Direttiva Europea del Consiglio della Comunità (2010/63 / UE del 22 settembre 2010) e del Ministero dell'Agricoltura francese.
1. Preparazione di mezzi e strumenti
- In un armadio di sicurezza biologica, preparare BSS di 1x Hank (HBSS) in acqua sterile da 10x soluzione madre contenente CaCl 2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l), senza MgCl 2. Aggiungere NaHCO3 (350 mcg / ml) a 1x soluzione di HBSS.
- In un armadio di sicurezza biologica, aggiungere N2 supplemento (da una soluzione madre 100x) e la penicillina (100 unità / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) soluzione per mezzo aquila modificato (DMEM) mix nutriente Dulbeccoture F-12 (1: 1).
- In condizioni sterili, preparare una aliquota (25 microlitri, 2 mM) del citoplasmatico colorante fluorescente cosiddetto Cell Tracker verde in DMSO (1.075 ml di 1 mg). Diluire un'aliquota in 5 ml di DMEM in un tubo da 15 ml.
- Preparare riempito portaghiaccio per mantenere i media a 4 ° C.
- Decontaminare parti superiori del banco di laboratorio e gli strumenti con il 70% di etanolo.
2. La dissezione di cervelletto di ratti P10
- Rapidamente decapitare cuccioli di ratto (P10) con le forbici curve di funzionamento dietro le orecchie, al fine di ottenere l'inizio del midollo spinale.
- Al lato posteriore della testa decapitata, fare mediana incisione della pelle dal collo al naso con iris belle forbici e separare la pelle dal cranio con iris belle forbici e Dumont # 3 pinze.
- Usare bene le forbici iris per fare delicatamente due incisioni laterali dalla base alla regione rostrale del cranio. Rimuovere il teschio sezionato con due # 3 pinze. Staccare il reggisenoin qualsiasi aderenza con il cranio con le stesse pinze.
- Trasferire il cervello con l'estremità di un cucchiaio spatola per capsula di Petri (Ø 35 mm) contenente 2 ml di ghiacciata HBSS medio.
- Mettere la piastra di Petri contenente il cervello in una capsula di Petri grande (Ø 100 mm) pieno di ghiaccio e trasferimento alla fase dello stereomicroscopio.
- Sotto uno stereomicroscopio, isolare il cervelletto dal cervello da dilacerazione utilizzando due # 3 pinze. Analogamente, rimuovere il midollo spinale residuo e la piale-membrana.
- Trasferire il cervelletto in un nuovo piatto di Petri HBSS-riempita (Ø 35 mm, 2 ml) con la fine cucchiaino di una spatola e tenere in ghiaccio.
3. Preparazione di acuta cerebellari fette
- Sotto lo stereomicroscopio, tagliare il cervelletto tra verme e l'emisfero destro come indicato dalle due teste freccia in figura 2A con uno standard manico bisturi # 3 solido e una lama chirurgica # 15.
- Mettere una goccia di cianocolla oacrylate sul disco dei campioni vibratome e aspettare 15-25 secondi per eliminare vapori di solventi tossici.
- Raccogliere il cervelletto taglio con l'estremità cucchiaino di una spatola e rimuovere l'eccesso HBSS con tovaglioli di carta puliti.
- Portare il cervelletto vicino al disco di preparato. Fissare il bordo tagliato al disco campione e attendere 10 secondi.
- Inserire il disco di preparato nel vassoio buffer con il manipolatore, e ruotarla in modo all'asse trasversale del cervelletto è perpendicolare al portalama. Fissare il disco di preparato con una chiave a brugola e riempire con delicatezza il vassoio buffer con HBSS medio fino a quando il cervelletto è coperto.
- Carico ghiaccio tritato nel bagno di raffreddamento.
- Pulire i tre volte lama con il 70% di etanolo per eliminare l'olio.
- Inserire la lama nel porta-lama e fissarlo con la vite di fissaggio.
- Posizionare il bordo destro della lama dietro il bordo posteriore (dal punto di vista dell'utente) del campione e definire come punto di partenza. Utilizzare avanti comando per definire tegli punto finale dopo il bordo anteriore del campione.
- Selezionare sezionamento velocità a 2,5 e sezionamento frequenza 8. Selezionare lo spessore di taglio a 180 micron. Avviare sezionamento dei tessuti.
- Pick up ogni sezione con un bicchiere ampio tunnel troncato pipetta Pasteur e trasferimento in HBSS contenenti capsula di Petri (Ø 35 mm) tenuti in ghiaccio.
- Utilizzando due # 5 pinze, rimuovere le meningi accuratamente dal cervelletto quando interferire con la lama. Raccogliere un massimo di 5 fette al cervelletto (Figura 2B, C).
- Rimuovere le meningi dalle fettine cerebellari accuratamente con due # 5 pinze allo stereomicroscopio e separare i lobuli dolcemente per meglio sonda carico.
4. fluorescente colorazione delle condizioni di vita Interneuroni
- Trasferimento fette cerebellare con una pipetta Pasteur di vetro ampio tunnel troncato a un 6-pozzetti (max 3 fette / per pozzetto). Aspirare il mezzo HBSS.
- Incubare fette (3 max) in 5 ml di lsoluzione oading del colorante fluorescente (10 mM).
- Per proteggere dalla luce, coprire la micropiastra con un foglio di alluminio. Mettere su un tavolo giroscopio-mobile a 35 rpm per 10 minuti a RT per facilitare marcatura delle cellule.
- Fette di trasferimento sulla membrana di un Transwell inserto (3,0 micron dimensione dei pori; Figura 2D) con una pipetta Pasteur di vetro wide-bore troncato. Aspirare il mezzo carico con pipetta.
- Togliere l'inserto e riempire il pozzo con 1,9 ml di DMEM. Sostituire l'inserto e aggiungere 100 ml di DMEM sulla parte superiore della fetta per coprire il tessuto.
- Posizionare la piastra contenente gli inserti culturali nella camera incubatrice (37 ° C, 5% di CO 2) per 2 ore, che è sufficiente osservare GC in ML. Lie tessuti piane per consentire attacco sulla membrana inserto (figura 2E). Assicurarsi che le fette non stanno asciugando.
5. ex vivo Imaging Attraverso confocale macroscopia
- Trasferire il piatto senzail coperchio di plastica in un incubatore fissare al supporto di un macroscope confocale. Mettere un coperchio di vetro sull'inserto piatto del macroscopio. Mantenere la temperatura della camera a 37,0 ° C ± 0,5 ° C, e forniscono le fette con flusso di gas costante (95% O 2, 2 5% CO) attraverso i portapiatti per mantenere costante il pH. Attendere per 2 ore supplementari prima dell'esperimento time-lapse.
- Per visualizzare la distanza di migrazione GC nelle fettine di tessuto, illuminare la preparazione con una luce di lunghezza d'onda 488 nm per mezzo di un diodo laser attraverso un macroscopio confocale a scansione laser dotata di un obiettivo a secco X2 (lavoro: 39 mm, diametro 58 mm, NA = 0,234), e rilevare emissione di fluorescenza 500-530 nm.
- Per risolvere finemente il movimento di GC, acquisire immagini con un ulteriore fattore di zoom ottico di 1,5-2,0. Raccogliere immagini di GN in un singolo piano focale o fino a 10 differenti piani focali lungo l'asse z ogni 30 min fino a 12 ore.
Monitoraggio 6. cellulare
- Per ogni volta del film, effettuare z-stack proiezione attraverso la modalità Ecart-tipo in ImageJ. Modulare il contrasto ei livelli di luminosità delle immagini successive per facilitare l'identificazione e la tracciabilità di GC etichettati. Mappa manualmente ogni posizione dell'istantanea riferimento (t = 0).
- Utilizzare il plugin "traccia manuale" nel menu di particelle Analizzare e determinare cliccando sul punto di gravità di ogni cellula del corpo durante time-lapse. Esportare i dati di tracciamento grezzi in un foglio di calcolo.
- Riorganizzare i dati di tracciamento prime esportate da ImageJ con un programma intelligente fatta in casa (http://primacen.fr, scritto in codice PHP) che identifica ogni cellula e le posizioni associate. Utilizzando il programma, calculatall'e la distanza totale percorsa e la velocità media di migrazione per ogni cella. Classificare e confrontare le caratteristiche della migrazione delle cellule in condizioni di controllo e di trattamento sotto opportuni filtri che utilizzano lo stesso programma.
Representative Results
Nei primi anni del cervelletto postnatale, GC mostrano cambiamenti significativi nella loro modalità e la velocità di migrazione che attraversano diversi strati corticali 1 (Figura 1). Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere attraverso lo studio della migrazione GC nel loro ambiente cellulare naturale. P10 ratto fette di tessuto cerebellare etichettati con un colorante fluorescente verde sono esaminati al macroscopio confocale (Figura 3A) e ci dimostrano che GC migrano radialmente in ML con una velocità media di 18 micron / ora (Figura 3B, C). Ad oggi, il ruolo delle interazioni / comunicazioni tra le cellule neuronali e gliali compresi i fattori normativi e meccanismi molecolari coinvolti nel controllo della migrazione delle cellule in ogni strato corticale sono in gran parte sconosciuti. Di conseguenza, il problema principale è quello di identificare neuropeptidi, neurotrasmettitori, neurotrofine e componenti della matrice extracellulare che potrebbero giocare un ruolo in questi corticale layer-specicambiamenti FIC della velocità durante il loro processo di migrazione. Ipofisi adenilato-ciclasi attivando polipeptide (PACAP) viene rilevata principalmente nel PCL, ma anche nella ML e l'IGL durante le prime due settimane postnatali nel roditori 7,10,11. Applicazione PACAP38 (10 -6 M) al mezzo di coltura ha comportato una riduzione della velocità 79% della GC nella ML. Ad esempio, la velocità di migrazione di GC del ML sceso da 11,9 micron / hr in condizioni di controllo a 2,5 micron / hr dopo somministrazione di PACAP38 (Figura 4A). Tissue-tipo attivatore del plasminogeno (tPA) è un membro della cascata proteolitica che porta alla degradazione dei componenti della matrice extracellulare (EM), come ad esempio molecole di adesione cellulare o laminina 12,13. tPA e plasminogeno, un substrato di tPA, vengono rilevati in strati corticali durante lo sviluppo del cervelletto 14,15,16 postnatale. La somministrazione di PAI-1 (10 -7 M), un inibitore di tPA endogena, ridotto del 78% GCmigrazioni nella ML. Ad esempio, GC ridotta velocità di migrazione nel ML da 19,2 micron / hr in condizioni di controllo a 4,2 micron / hr dopo l'aggiunta del PAI-1 (Figura 4B). Questi risultati indicano che PACAP esercita un effetto inibitorio diretta sui movimenti GC e che la serina proteasi tPA facilita la migrazione di GC nella ML del ratto sviluppo del cervelletto.
Figura 1: rappresentazione 3D della migrazione GC nella corteccia cerebellare postnatale. 1-4, estensione dei processi di GC e la migrazione tangenziale in EGL. 5, la migrazione radiale nella ML lungo Bergmann fibre gliali. 6, transitoria fase stazionaria nel PCL. 7, migrazione Glial indipendente radiale nel IGL. 8, completamento della migrazione GC nel IGL GC, cellule dei granuli, in rosso;. EGL, Strato granulare esterno; B, Bergmann glia, in viola scuro, G, cellule Golgi, in giallo, cf, fibre rampicanti, in azzurro, g, granuli postmigratory, in verde chiaro, IGL, strato granulare interno; mft, fibra di muschio terminale, in verde scuro, ML, strato molecolare, P, cellula di Purkinje, in viola chiaro, strato PCL, Purkinje cellule. Questo dato è stato modificato da 5.
Figura 2: ex vivo cultura del P10 fettine cerebellari (A) cervelletto Dissected dal P10 di ratto.. Barra di scala = 6 mm. (B) Micrografia di vivere a 180 micron di spessore fetta cerebellare attraverso stereomicroscopia. Barra di scala = 3 mm. (C) Aun ingrandimento maggiore, i quattro strati corticali (EGL, ML, PCL, IGL) del cervelletto sono già distinguibili. Barra di scala = 1 mm. (D) Dopo la marcatura fluorescente, fette di tessuto sono collocati su inserti cultura (diametro 24 mm) in un 6-pozzetti. (E) Rappresentazione schematica di un inserto culturale con membrana in poliestere coltura di tessuti trattati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: la migrazione dinamica dei CV negli strati corticali di ratto P10 cervelletto (A) Vista Macroconfocal (xyz, proiezione 2D) di una fetta cerebellare P10 ratto in cui GC sono etichettati con un colorante fluorescente verde citoplasmatica.. Barra di scala = 75 micron. (B) Time-lapse imaging mostra GCmovimenti nella ML di macroscopia confocale per 4 ore in condizioni di controllo. Asterisco (*) indica il simbolo soma GC. Tempo (in minuti) è indicato nella parte inferiore di ciascuna microfotografia. Barra di scala = 10 micron. (C) le modifiche sequenziali nella distanza percorsa dal GC soma.
Figura 4:. Effetto del neuropeptide e proteasi inibitore della migrazione GC (A) GC è stata monitorata in ML da macroscopia confocale per 2 ore in condizioni di controllo e poi per 2 ore in presenza di Pituitary adenilato-ciclasi attivando polipeptide (PACAP). (B) GC è stata monitorata in ML da macroscopia confocale per 2 ore in condizioni di controllo e poi per 2 ore in presenza di inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1).
Discussion
Questo protocollo descrive la cultura del P10 ratto fettine di cervelletto acute nel sistema Transwell e la marcatura fluorescente di GC con un colorante verde fluorescente per studiare la migrazione delle cellule durante lo sviluppo postnatale attraverso macroscopia confocale. Questo protocollo permette osservazioni della migrazione delle cellule per un periodo fino a 12 ore e le prove di possibili ruoli di fattori, tra cui la migrazione agonisti o antagonisti di neuropeptidi, inibitori dell'enzima, segnalazione cellulare modulatori o sostanze tossiche durante l'esperimento di regolazione. Un piccolo foro nell'inserto membrana con un puntale è necessario per facilitare la somministrazione di composti nel mezzo di incubazione. Una curva puntale fatta in casa può essere utilizzato per facilitare la fornitura di soluzione.
Una questione di studi di migrazione cellulare in viva fette di tessuto è che i movimenti del tessuto stesso può fare il monitoraggio difficili cellulare. Mentre gli approcci precedenti hanno proposto per stabilizzare dolcemente slices con una rete di nylon, o di un sottile strato di coda di ratto collagene 7,17, un importante vantaggio di questa tecnologia è la semplice e diretto trasferimento di una piastra di coltura a 6 pozzetti contenenti cerebellare fette su inserti membrana dal CO 2 incubatore all'obiettivo di un macroscope confocale. Temperatura integrato e di CO 2 controller forniscono anche parametri ambientali adeguate e costanti essenziali per la migrazione delle cellule 9. Pertanto, condizioni di coltura sono mantenuti durante le osservazioni ed i movimenti dei tessuti sono ridotte al minimo in quanto le fette sono ben attaccati alla membrana inserto. Stabilizzazione del tessuto viene verificata seguendo la posizione dei bordi fetta o cellule di Purkinje che devono essere corretti riferimenti durante l'acquisizione. Inoltre, fettine cerebellari (da 12 a 18) distribuiti nelle 6 pozzetti della piastra possono essere rapidamente osservati in dettaglio con un tavolino motorizzato ed uno zoom ottico. A causa della grande distanza di lavoro (X2, 39 mm) dell'obiettivo secca, epi-osservazione è libera di immersione e somministrazione di composti nel mezzo di coltura è molto più facile. Pertanto, i parametri ambientali e le similitudini di sostegno della cultura di CO 2 incubatore e confocale macroscopia portano ad un massimo di conservazione del campione biologico.
Un altro vantaggio del protocollo è il grande campo visivo e di conseguenza il numero di celle che possono essere osservati simultaneamente. Ad esempio, abbiamo precedentemente determinato che la densità di GC fluorescenti con migrazione radiale nella ML era 1124 ± 138 cellule / mm 2 18. Macroscopia confocale (X2, NA = 0,234) ha una risoluzione laterale inferiore rispetto alla microscopia confocale (40X, NA = 1.25), ma cellule corpi di GC possono essere facilmente monitorati e la velocità media delle migrazioni è comparabile tra i due approcci tecnologici 7,18 .
Oltre miglioramento tecnico per le acquisizioni di immagini, la qualità di fette di tessuto e the la qualità dell'etichettatura sono punti chiave per esperienze di successo. Tenere sempre i supporti e tessuti su ghiaccio durante i processi di dissezione, eliminare olio su vibratome lame e non utilizzare le fette di tessuto a contatto con la colla. Sezioni sagittali e trasversali sono adattati a radiali e tangenziali migrazione rispettivamente. Utilizzare diverse lunghezze di incubazione per il rilevamento appropriata nei diversi strati corticali del cervelletto. Tempi di incubazione lunghi (fino a 8 ore) sono necessari per rilevare la migrazione di numerosi GC nel PCL e il IGL. Dal momento che la migrazione GC è un processo fisiologico durante le finestre spazio-temporali specifici, il controllo positivo è che le cellule devono migrare correttamente. In particolare, numerosi GC mandrino nel ML è uno degli indici di salute principale per cerebellare fette sagittali. Per gli esperimenti di partenza, l'osservazione dei movimenti GC nella ML è suggerito. Infatti, la forma di GC con corpo cellulare allungato verticalmente dovrebbe essere considerato come un punto di riferimento per avviare acquisizione con successivo controllo (2 ore) e trattamento (2 ore) periodi che possono essere facilmente eseguite nella ML.
Coloranti fluorescenti, come la famiglia Tracker cellulare o proteine fluorescenti espresse attraverso costrutti genetici possono essere utilizzati come traccianti per gli studi di migrazione cellulare. A causa delle cinetiche lente delle migrazioni GC (1 pila ogni 30 min), esperimenti multicolore possono essere eseguite in modo sequenziale dal 4 laser travi (405, 488, 532 e 633 nm) sono disponibili sul sistema. Considerando la migrazione radiale centripeta e centrifuga, il monitoraggio di altri interneuroni possono anche essere realizzati 18. In particolare, meno numerosi tipi di cellule possono essere facilmente localizzati con un ampio campo di vista. Infine, questo protocollo può essere usato per studiare la migrazione delle cellule in altri stadi di sviluppo cerebellare ma anche altre aree del cervello.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto per la Ricerca e l'Innovazione in Biomedicina (IRIB), la piattaforma di imaging cellulare della Normandia (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, l'Università di Rouen, il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR - PERENE, Interreg 4A), il LARC-Neuroscienze di rete e la regione Alta Normandia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) nutrient mixture F-12 | Sigma-Aldrich | D8437 | |
| Hank's balanced salt solution 10x | Sigma-Aldrich | H1641 | |
| PACAP38 | INRS, Canada | Bourgault et al., 200919 | |
| PAI-1 | Calbiochem | 528208 | |
| N-2 supplement | Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen | O973 | |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | ||
| Cell Tracker Green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Polyester Transwell-Clear inserts | Corning | 3452 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 6-well cell culture cluster | Corning | 3516 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Tissue culture dish 35 mm diameter | BD Falcon | 353004 | |
| Tissue culture dish 100 mm diameter | Thermo SCIENTIFIC | 130182 | |
| Polypropylen tube (15 ml) | BD Falcon | 352096 | |
| Ethanol 70% | Fisher Chemical | E/0800DF/21 | |
| Biological safety cabinet fume hood | Thermo Scientific | MSC9 Class II A2 | |
| Adjustable-volume pipette (0.5-10 µL) | Eppendorf | 4910 000.018 | |
| Gyro-rocker, SSL3 | Stuart | ||
| CO2 incubator, Hera Cell 150 | Thermo Scientific | ||
| Vibrating blade microtome, VT1000S | Leica Microsystems | ||
| Confocal macroscope, TCS LSI | Leica Microsystems | ||
| Temperature controller | PeCon | ||
| CO2-controller | PeCon | ||
| Stereomicroscope, M205 C | Leica Microsystems | ||
| Operating scissors, curved, blunt/blunt | Medicon | 03.03.17 | |
| Hardened fine iris scissors, straight, sharp/sharp | FST | 149090-11 | |
| Dumont #3 and #5 forceps | FST | 11293-00 and 11252-20 | |
| Vibratome injector blades/single edge | Leica Microsystems | 39053250 | |
| Standard scalpel handle #3 solid | FST | 10003-12 | |
| Surgical blade #15 | Swann-Morton | 205 |
References
- Komuro, Y., Kumada, T., Ohno, N., Foote, K. D., Komuro, H. Migration in the Cerebellum. Cellular Migration and Formation of Neuronal Connections: Comprehensive Developmental Neuroscience. 2, 281-297 (2013).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton, FL. (1997).
- Komuro, H., Rakic, P. Distinct modes of neuronal migration in different domains of developing cerebellar cortex. Journal of Neuroscience. 18 (4), 1478-1490 (1998).
- Komuro, H., Yacubova, E. Recent advances in cerebellar granule cell migration. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (6), 1084-1098 (2003).
- Fahrion, J. K., et al. Rescue of neuronal migration deficits in a mouse model of fetal Minamata disease by increasing neuronal Ca2+ spike frequency. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 109 (13), 5057-5062 (2012).
- Raoult, E., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) stimulates the expression and the release of tissue plasminogen activator (tPA) in neuronal cells: involvement of tPA in the neuroprotective effect of PACAP. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 10-1111 (2011).
- Cameron, D. B., et al. Cerebellar cortical-layer-specific control of neuronal migration by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. Neuroscience. 146 (2), 697-712 (2007).
- Renaud, J., et al. Plexin-A2 and its ligand, Sema6A, control nucleus-centrosome coupling in migrating granule cells. Nature Neuroscience. 4, 440-449 (2008).
- Komuro, H., Rakic, P. Dynamics of granule cell migration: a confocal microscopic study in acute cerebellar slice preparations. Journal of Neuroscience. 15 (2), 1110-1120 (1995).
- Nielsen, H. S., Hannibal, J., Fahrenkrug, J. Expression of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in the postnatal and adult rat cerebellar cortex. Neuroreport. 9 (11), 2639-2642 (1998).
- Hannibal, J. Pituitary adenylate cyclase-activating peptide in the rat central nervous system: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Journal of Comparative Neurology. 453 (4), 389-417 (2002).
- Garcia-Rocha, M., Avila, J., Armas-Portela, R. Tissue-type plasminogen activator (tPA) is the main plasminogen activator associated with isolated rat nerve growth cones. Neuroscience Letters. 180 (2), 123-126 (1994).
- Ware, J. H., DiBenedetto, A. J., Pittman, R. N. Localization of tissue plasminogen activator mRNA in the developing rat cerebellum and effects of inhibiting tissue plasminogen activator on granule cell migration. Journal of Neurobiology. 28 (1), 9-22 (1995).
- Friedman, G. C., Seeds, N. W. Tissue plasminogen activator mRNA expression in granule neurons coincides with their migration in the developing cerebellum. Journal of Comparative Neurology. 360 (4), 658-670 (1995).
- Seeds, N. W., Siconolfi, L. B., Haffke, S. P. Neuronal extracellular proteases facilitate cell migration, axonal growth, and pathfinding. Cell and Tissue Research. 290 (2), 367-370 (1997).
- Basham, M. E., Seeds, N. W. Plasminogen expression in the neonatal and adult mouse brain. Journal of Neurochemistry. 77 (1), 318-325 (2001).
- Bourgault, S., et al. Molecular and conformational determinants of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) for activation of the PAC1 receptor. Journal of Medical Chemistry. 52 (10), 3308-3316 (2009).
