Abstract
Förmågan att differentiera mus embryonala stamceller (ESC) för att neurala stamceller tillåter studiet av de mekanismer som styr neurala specifikation samt generering av mogna neurala celltyper för vidare studier. I detta protokoll beskriver vi en metod för differentiering av ESC neurala stamceller med hjälp av serumfritt, monokultur. Metoden är skalbar, effektiv och resulterar i produktion av ~ 70% neurala stamceller inom 4 - 6 dagar. Det kan appliceras på ESC från olika stammar som odlats under olika förhållanden. Neurala stamceller kan tillåtas att differentiera vidare till funktionella neuroner och glia eller analyseras av mikroskopi, flödescytometri eller molekylära tekniker. Differentieringsprocessen är mottaglig för tidsförlopp mikroskopi och kan kombineras med användning av reporterlinjer för att övervaka den neurala specifikationsprocessen. Vi ger detaljerade anvisningar om förberedelse medier och celltäthet optimering för att låta processen be tillämpas på de flesta ESC linjer och en mängd olika cellkulturkärl.
Introduction
Embryonala stamceller är pluripotenta celler som härrör från det tidiga embryot med förmågan att föröka sig i oändlighet in vitro med bibehållen förmåga att differentiera till alla typer vuxen cell efter återinförande i ett lämpligt skede embryo (genom att bilda en chimär), injektion i syngena eller nedsatt immunförsvar värdar (genom att bilda en teratom) eller in vitro omfattas av lämpliga signaler 1. In vitro-differentiering av Mouse embryonala stamceller i neurala linjer beskrevs första gången 1995 och innebar bildandet av flercelliga upphängningsaggregat (embryoidkroppar, EBS) i seruminnehållande medium kompletterat med morfogenen retinsyra 2-4. Sedan dess har en mängd olika protokoll har utvecklats för att möjliggöra neural differentiering 5. Många fortfarande utnyttja aggregering, andra co-kultur med inducerande celltyper och flera involverar användningen av serumfritt medium. Alla protokoll har fördelar ennd nackdelar och den exakta arten av neurala eller nervceller produceras också varierar beroende på vilket protokoll som används.
Den ideala protokollet skulle vara robust, skalbar och använda sig av helt definierade medier och substrat, vara mottaglig för icke-invasiv övervakning av differentieringsprocessen och resulterar i genereringen av rena populationer av neurala stamceller kan vara mönstrad genom yttre signaler och differentiera i all neuronala och gliaceller subtyper med hög effektivitet och utbyte på relativt kort tid. Under de senaste tiotal åren har vi använt en metod för att generera neurala stamceller och nervceller från mus ESC i en låg densitet, serumfritt vidhäftande monolager kultur 6-10. Detta protokoll uppfyller många av de kriterier som anges ovan: i våra händer effektivitet differentiering har varit ganska konsekvent under många år och en mängd olika cellinjer, kan den skalas upp eller ner (vi framgångsrikt använder fartyg från 96-brunnsplattor till 15 cm diametern dishes) och media som används är väldefinierade. Processen är mottaglig för Timelapse mikroskopi för övervakning av differentieringen och en variation av mönstrings ledtrådar kan tillsättas för att inducera generering av distinkta typer av neuronala subtyper (t.ex., Shh och FGF8 för dopaminerga neuroner 6).
Det finns dock vissa utmaningar för framgångsrik tillämpning av detta protokoll. En av de viktigaste aspekterna är noggranna förberedelser av medierna. Vi förbereder alltid media i egen regi, trots att det finns kommersiella alternativ. En av de tillägg som används (N2, se protokollet) har ändringar över standarden kommersiellt tillgängliga versioner. Slutligen är en av de viktigaste stegen för framgångsrik tillämpning av denna metod den optimala celldensiteten vid plätering. Detta beror främst på medan den autokrina karaktär en av de inducerade signalerna (FGF4 11) kräver att tillräckligt många celler är närvarande för att tillåta optimal viabilhet och differentiering, vid för höga densiteter differentiering är nedsatt (möjligen delvis på grund av autokrin produktion av LIF 12). Det är därför viktigt att förberedelserna både media och cell plätering utförs noggrant och konsekvent för att garantera optimala resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av media
OBS: protokoll bygger på användningen av en blandning av två separata medier: DMEM / F12 kompletterat med modifierad N2 komplettera och Neurobasal kompletterat med B27-komplement, typiskt i ett 1: 1-förhållande.
- Framställa det modifierade N2 komplement genom blandning av komponenterna i en 15 ml tub. Inte virvel eller filtrera detta; Blanda genom att vända röret tills lösningen är klar.
- Börja genom att pipettera 7,2 ml DMEM / F12, tillsätt sedan 1 ml av 25 mg / ml insulin (beredes i 0,01 M HCl) och blanda väl genom att vända röret. Det tar ett par minuter tills lösningen är klar.
- Tillsätt 1 ml av 100 mg / ml apo-transferrin (som består i vatten), 33 pl 0,6 mg / ml progesternone (består i etanol), 100 pl 160 mg / ml (1 M) putrescin (består i vatten ), 10 | il av 3 mM natriumselenit (som består i vatten) och 666 | il av 7,5% bovint serumalbumin och blanda röret väl. Alikvotera i 2,5 ml och lagra vid -20 °C i upp till 2 månader.
- Förbered media.
- Till 250 ml av DMEM / F12 till 2,5 ml N2. Blanda väl men inte skaka eller filter.
- Till 250 ml Neurobasal medium tillsätt 5 ml B27 tillägg. Blanda väl men inte skaka eller filter.
- Blanda media från steg 1.2.1 och 1.2.2 i en 1: 1-förhållande. I vissa fall kan en 1: 3 blandning kan krävas (kompletteras som 1: 1 blandning i steg 1.2.4).
- Till blandningen till 0,5 ml L-glutamin (slutlig koncentration 0,2 mM) och 3,5 ^ il av 2-merkaptoetanol (slutlig koncentration 0,1 mM) och blanda väl utan skakning. Förvara medier vid 4 ° C i upp till 3 veckor och undvika exponering för ljus. Denna slutliga blandning kallas N2B27.
- Bered gelatinlösningen.
- Bered en 1% gelatinlösning i ultrarent vatten och autoklavera vid 121 ° C, 15 psi, under 15 min. Det är viktigt att flaskan används för detta är helt rena från rengöringsmedel eller desinfektionsmedel, så det rekommenderas att en ny flaska äranvänds för detta och är alltid bara sköljas i ultrarent vatten mellan olika användningsområden. Alikvotera 1% lösning i 50 ml alikvoter och hålls vid 4 ° C under månader.
- Värm en alikvot av 1% gelatin i en 37 ° C vattenbad tills det lösts och tillsätt till 500 ml varm fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Blanda väl och pipettera tillräckligt för att täcka botten av varje brunn eller platta. Låt gelatinet att belägga ytan i minst 30 minuter.
2. Plätering av celler
OBS: Detta protokoll gäller även mus ESC odlas i 10% serum med leukemiinhiberande faktor (LIF), serumersättning med LIF eller serumfritt medium med LIF och benmorfogenetiskt protein 4 (BMP4) eller MEK och GSK3-hämmare (2i media) med eller utan LIF. Emellertid kan tidpunkten och effektiviteten av differentiering variera beroende på media och celler (se diskussion). För experiment som visas här använde vi 46C mus ESC linje (som har en EGFP reporter knackade in one av endogena Sox1 alleler), som odlas i GMEM med 10% serum och LIF. För bästa resultat är det viktigt att cellerna dissocieras och återutströks i N2B27 media; enkelt byte av media från GMEM / serum / LIF N2B27 resulterar alltid i en minskad effektivitet differentiering jämfört med omstryka cellerna.
- Odla cellerna i GMEM med 10% serum, 1 mM natriumpyruvat, 1x icke-essentiella aminosyror, 0,1 M 2-merkaptoetanol och 100 enheter / ml LIF 13. För att få en subkonfluent kultur av mus ESC, platta 1 x 10 6 celler i en T25 odlingskolv som kommer att ta 2 - 3 dygn.
- Observera celler under ljusa fält mikroskop. När cellerna är subkonfluenta och redo att passagen, skölj dem två gånger i PBS. Tillsätt 1 ml av cell dissociation reagens och återgå till inkubatorn under 2-5 min. Även trypsin och andra enzymer kan också användas för cell dissociation, kan de ha en negativ inverkan på cellbindning så plätering tätheter måste vara justerbasted.
- När cellerna börjar lyfta från plattan genom att trycka på fartyget för att lossa dem till en enda cell suspension. Samla cellerna i totalt 10 ml av media och cell-dissociation reagens och pipett till ett 15 ml centrifugrör.
- Snurra cellerna vid 300 xg under 3 min vid RT.
- Försiktigt aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 10 ml förvärmd N2B27 genom att pipettera upp och ned 3 - 5 gånger. Vid pipettering av suspensionen ner, för att pipettera mot sidan av röret inte skapa bubblor. Räkna cellerna med en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer och registrera koncentrationen.
- Förbered en cellsuspension innehållande det önskade antalet celler per volymenhet som skall pläteras per brunn i förvärmda N2B27. En densitet av 10.500 celler per cm 2 i en 6-brunnsskål (dvs., 1 x 10 5 celler per brunn i en 6-brunnsskål) är optimal. Se Tabell 1 för föreslagits antal celler per cm 2 och plating mediavolymer för olika cellkulturkärl.
- Aspirera gelatinet från odlingskärlet och plattan cellsuspensionen enligt den föreslagna densitet och volym i tabell 1. Inte snurra plattorna, eftersom detta kommer att koncentrera cellerna till centrum. Placera kulturerna i en fuktig inkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ändra media var 1 - 2 dagar genom att ersätta alla medier med färska N2B27. Pipett försiktigt så att spola cellerna kan påverka densiteten och minska differentiering effektivitet under de följande dagarna. Om inledande lönsamhet efter plätering är dålig, platta cellerna i en 1: 3 blandning av N2 och B27-kompletterat medium och ändra detta till N2B27 efter de två första dagarna. Celler kommer att börja differentiera och bör visa Sox1 uttryck (synliga genom grön fluorescens av reportern i 46C cellinje som används här) inom 4 - 6 dagar.
3. immunofluorescerande färgning
NEJTE: Protokollet kan tillämpas på alla typer fartyg. Volymen av varje reagens beskrivs per brunn av 6-brunnsplatta och kan skalas till någon ytarea. Omstryka rekommenderas inte på grund av den låga lönsamheten efteråt.
- Ta differentieringsmedium och fixera cellerna genom att tillsätta 500 pl 4% (v / v) paraformaldehyd, låt stå i 15 minuter.
- Tvätta och permeabilisera cellerna med 2 ml PBS-T (fosfatbuffrad saltlösning med 0,5% (volym / volym) Tween-20) två gånger. Celler kan förvaras i PBS-T under upp till två månader vid 4 ° C.
- Byt PBS-T med 1 ml PBS-T med 10% (v / v) serum (från samma art som den sekundära antikroppen). Inkubera 1 h på plattan rocker vid RT för att blockera varje icke-specifik bindning.
- Efter 1 timme, tvätta cellerna två gånger med 2 ml PBS-T, och inkubera i 500 | al mus-IgG mot βIII-tubulin (utspädd 1: 1000 i PBS-T med 10% serum). Sätt på plattan rocker, och lämna O / N vid 4 ° C.
- Från detta steg, alltid skydda fartygetfrån ljus. Tvätta cellerna två gånger med PBS-T, tillsätt sedan 500 | il av fluorescens-märkt anti-mus-IgG-antikropp (utspädd till 2 ug / ml i PBS-T med 10% serum). Sätt den på plattan rocker under 1 h vid RT.
- Skölj cellerna två gånger med PBS-T, tillsätt sedan 500 | il DAPI (utspädd till 0,5 ug / ml i PBS-T) och låt stå i 5 minuter.
- Tvätta cellerna igen och hålla dem i PBS-T. Cellerna är redo att bli fotograferad och kan förvaras i upp till 2 veckor vid 4 ° C. Lägg märke till att GFP signalen bleknar med tiden så det är olämpligt att jämföra GFP intensitet fasta och levande celler eller celler fixerade vid olika tidpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta experiment använde vi 46C cellinje 14, mus embryonala stamceller med en endogen Sox1-GFP reporter, att spåra neural differentiering. Genom att använda denna cellinje, uttryck av Sox1, en markör för neurala stamceller, kan detekteras med grön fluorescens. Plätering densitet är en kritisk faktor för att uppnå neuronal differentiering. Mus embryonala stamceller ströks ut i 6-brunnars platta vid olika densiteter varierar från 10.500 till 88.500 celler / cm 2. Figur 1A visar differentierings effektiviteter uppnås genom olika pläterings densiteter i en 6-brunnsplatta. På dag 6 av differentiering fixerades cellerna i 4% paraformaldehyd och färgades för den neuronala markören βIII-tubulin. Vid den optimala densiteten (10.500 celler / cm 2), celler differentieras till neurala stamceller och nervceller. Detta observerades av grönt fluorescerande signal från Sox1-GFP reporter och immunofluorescent mot neuronal markör, βIII-tubulin. A lower plätering täthet ledde till celldöd inom 3 dagar. Emellertid, plätering på en alltför hög densitet (> 36.500 celler / cm 2) resulterade i minskad andel gröna celler och βIII-tubulin positiva celler. Figur 1B visar ett experiment utförs i en 96-brunnsplatta som krävde ca 10 gånger högre celldensitet för att nå den optimala (155.000 celler / cm 2) och för sammanflytande (362.500 celler / cm2) nivå.
Optimal densitet kan vara olika mellan medie preparat, media komponent och cell partier, celltyper, eller tidigare odlingsbetingelser. Det rekommenderas att optimera beläggningstäthet för varje experiment. Tabell 1 ger sortiment av effektiva plätering tätheter i olika plattformar som bör ingå i optimeringen steg. Inom detta område, bör det vara möjligt att få en densitet som ger en god differentiering effektivitet inom 4 - 6 dagar.
Under differentiering ESC gradvis förändra deras morfologi. Figur 2 visar cell och kolonimorfologi från dag 1 till dag 6 efter plätering i 6-brunnar vid 10.500 celler / cm 2. Celler odlades i differentieringsbetingelser och fotograferades varje dag. Det är inte ovanligt att se betydande celldöd på de första dagarna på grund av extrem förändring i odlingsbetingelser. Emellertid, de kvarvarande cellerna är fortfarande i stånd att differentiera. På dag 4, celler börjat bli neurala stamceller som grönt fluorescerande signalen från Sox1-GFP reporter först dök. Men även på dag 6, inte alla cellerna är Sox1-positiva. Förekomsten av vissa icke-nervceller väntas ändå, i rätt förhållanden, kommer majoriteten av celler vara neurala.
Figur 1. Effekten av bordläggningen tätheten på differentiering effektivitet. Två olikatätheter av Sox1-GFP reporter celler (46c) ströks och differentierad utifrån protokollet för 6 dagar. (A) Differentiering i en 6-brunnsplatta. (B) Differentiering i en 96-brunnsplatta. Skala bar:. 100 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cell morfologier under differentieringsprocessen. 46C ESC differentierades vid 10.500 celler per cm 2 i en 6-brunnars odlingsplatta och fotograferades dagligen för att observera förändringar i cellmorfologi. Skala bar:. 300 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Plattform | Området för effektiv densitet (celler / cm 2) | Utbud av mobilnummer till plattan | Föreslagna första medievolymen (il) | Föreslagna medievolymen efter dag 1 (il) |
| 6-brunnar | 10.500 - 36.500 | 99.750 - 346.750 | 1000 | 2000 |
| 24-brunnar | 15,600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1000 |
| 96-brunnar | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |
Tabell 1. Förslag till bordläggning densiteter och mediavolymer för olika fartygsstorlekar. Pläteringsförhållandena tätheten i denna tabell bestämdes med användning av 46C cellinje. För optimalt resultat pläteringen densiteten hos varje enskild linje kan behöva adjUsted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mono neurala differentiering protokollet har varit i bruk i över ett decennium 6. Protokollet är mycket effektiv, sammansatt av definierat medium, och gjort på ett monoskikt-system, som gör systemet mer tillämplig för preklinisk (t.ex., läkemedelsscreening) använder. Det finns dock några kritiska faktorer som avgör differentiering effektivitet. Den här artikeln påpekar dessa faktorer och lösningen för varje hinder.
Densitet av cellerna efter utstrykning i differentieringstillstånd är kanske den mest kritiska faktorn. Utstrykning av celler vid alltför hög densitet minskar differentieringseffektiviteten, medan utstrykning på för låg densitet leder till celldöd. Detta fenomen beror sannolikt på autokrin tillväxtfaktorsignalering. FGF4 är en autokrin tillväxtfaktor som aktiverar MAPK kaskad och driver ESC differentiering 11. LIF är en annan cytokin som produceras av ESC. Det aktiverar STAT3 vägen och främjar självförnyelse <sup> 15. Detta protokoll använder N2B27 att neurala celler. N2B27 innehåller olika faktorer som möjliggör ESC överlevnad och främjar neural celltillväxt, och innehåller inte heller LIF eller BMP4 som hämmar neural differentiering 6. Vid rätt densitet, är en lämplig balans mellan FGF4 och LIF signalering bibehålls som gör ESC för att differentiera. Vid hög densitet, överskott av autokrin LIF och BMP hämmar differentiering. Däremot har cellerna vid för låg densitet nedsatt överlevnad i dessa ganska minimala medier. Således, när ett stort antal celler utan differentiering visas bordläggning numret ska minskas, medan en ökning av bordläggningen mobilnummer krävs om betydande celldöd observeras.
Förutom cellantalet finns det några andra faktorer som indirekt påverkar plätering densitet. Den första faktorn är den lokala cellkoncentrationen, beroende av den teknik som används för att jämnt fördela cellerna över ytanområde. Vi fann att virvling brunnen är inte idealisk, eftersom den koncentrerar cellerna till mitten av brunnen och gör densiteten i centrum för hög, medan vid periferin densiteten blir för låg. Andra blandningstekniker, till exempel, blanda media med cellerna före plätering, eller gunga plattan från sida till sida rekommenderas. Dessutom, när ett kärl placeras i inkubatorn, ojämn uppvärmning av mediet orsakar en konvektion kraft som drar cellerna till mitten av brunnen, vilket resulterar i fördelningen av cellerna i ett koncentriskt ringmönster. En lägre medievolymen på pläteringen dag rekommenderas att minska denna effekt. Att plattan ligger utanför inkubatorn under 30 min för att låta cellerna fästa, samt att värma upp mediet före blandning kan också bidra till att uppnå en homogen plätering densitet.
För det andra kärltypen påverkar också plätering densitet. Figur 1 visar tydligt att antalet celler / brunn inte kan vara linjärt scaledde till ytarean hos olika kärl (med andra ord, kan samma antal celler / ytarea inte tillämpas på varje typ kärl). En mindre kärl (med större volym / areaförhållande) påverkas mer av media ytspänningen som gör en konkav yta hos mediet, den så kallade menisk. Ytspänningen skjuter cellerna till kanten av brunnen och minskar densiteten i centrum. Dessutom, eftersom medievolymen i den lilla kärlet är låg, medium värmas upp snabbt, vilket minskar konvektion kraften. Därför kommer cellerna i ett litet fartyg flytta till kanten av meniskeffekten, och kommer inte att röra sig till centrum med konvektion krafter. Sålunda, ju mindre kärlet, desto högre pläteringen täthet som krävs för att få den optimala densiteten i centrum.
För det tredje villkoret av cellerna före plätering också indirekt påverkar plätering densitet och differentiering effektivitet. Vi fann en variant av den optimala densiteten i vissa experiment. Experimenten medhögre dödlighet på den första dagen krävs högre densitet för effektiv differentiering. ESC kulturer i serum och LIF är sammansatta av en heterogen population av naiva pluripotenta celler, primade pluripotenta celler, och till och med ett litet antal av differentierade celler 16. Celler av dessa typer har olika förmåga att överleva och differentiera enligt differentieringsförhållanden. Sedan protokollet dikterar på antalet, men inte tillstånd av cellerna, kan vissa experiment börja med mer differentierade celler som kommer att dö på de första dagarna, vilket leder till en lägre densitet än förväntat. För att undvika denna variation, krävs konsekvent kultur ESC för att se till att konstant andel mellan varje stat upprätthålls.
Bortsett från densitet, är timing annan faktor för att uppnå en effektiv differentiering. I denna publikation, beskriver vi generering av neurala stamceller inom 6 dagar. Däremot kan den tiden vara olika beroende på läget avutgångs ESC kulturen. Såsom beskrivits ovan, ESK kulturer är blandade populationer som kan svara olika på differentieringstillstånd. Inte bara cellöverlevnad, utan också tidpunkten för differentiering kommer att påverkas av odlingskompositionen. Detta protokoll kan tillämpas på de flesta ESC odlingsbetingelser t.ex. i N2B27 media innehållande LIF och BMP4, eller 2i och LIF. Men om det finns mer naiva celler i odling, kan det krävas en längre period för effektiv differentiering. Detta beror på att naiva celler kommer att behöva mer tid för att byta till en primas tillstånd och därefter differentiera till neurala stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01 M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti βIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25 cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 |
References
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
- Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
- Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
- Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
- Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
- Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
- Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
- Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
- Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
- Silva, J., Smith, A.
