Summary
الاتجار مستقبلات الإشارات وينظم الخلايا على الاستجابة للجين وهو، في حد ذاته، استجابة لظروف الخلية، بما في ذلك الناجم عن يجند الإشارات. هنا، نحن تصف تقنية قوية ومرنة لتقييم كمي الاتجار مستقبلات المخدرات التي يسببها استخدام immunolabeling وتحليل colocalizational.
Introduction
المستقبلات، خصوصا G البروتين إلى جانب مستقبلات (GPCRs)، يتم تهريب روتينية داخل الخلية، من وإلى سطح الخلية 1. هذه العمليات المدبرة التعقيد وتفرض رقابة مشددة يكمل مستقبلات المتاحة الخلايا وتنظيم النشاط مستقبلات الزمني، الحساسية، وresensitization 2-4. الأهم من ذلك، هذه العمليات التي تستجيب لبيئات الخلوية بما في ذلك نشاط مستقبلات المخدرات التي يسببها أو الخمول. وهذا هو، لا يمكن للأعمال بروابط في مستقبلات يغير الاتجار داخل الخلايا من تلك المستقبلات، وبالتالي تغيير استجابة الخلية. على هذا النحو، تمارس بروابط خارجية حتى الآن أكثر الآثار على وظيفة الخلية، وحتى أبعد الكلاسيكية رسول إلى المستجيب شلالات 5،6.
دراسة مثل هذه التغييرات في الاتجار مستقبلات يسببها أمر صعب. تتضمن كل التقنيات المتاحة القيود. وقد استخدمت المقايسات حماية البيوتين إلى مونيتور مستقبلات سطح السكان. والبيروكسيديز هذه المستقبلات ويتم تنفيذ timecourse من immunoprecipitations لقياس انخفاض مستقبلات المعقدة البيروكسيديز مع مرور الوقت. هذه التقنية ترصد أساسا تدهور تدريجي من الأولي، وصفت والسكان مستقبلات 7، ومفيد جدا في بناء دورات الزمني لهذه العملية. للأسف، هذا الاختبار غير قادر على رصد أي عملية أخرى من تدهور تجمع الأصلي من المستقبلات، مثل استيعاب وإعادة التدوير، أو مستقبلات جديدة. أيضا، إضافة إلى الأجسام المضادة في نطاق 150kDa إلى مستقبلات في نطاق 50kDa يمكن أن يغير الاتجار مستقبلات في 8،9، ويمكن أن يكون من الصعب استخدام مع مستقبلات منخفضة على مستوى التعبير هذه التقنية.
استخدام الإجراءات غيرها من وسائل مختلفة لتحديد الأجزاء الاتجار داخل الخلايا (على سبيل المثال، الإندوسومات، الخ)، وتقييم colocalization مع مستقبلات الفائدة. وهذا يشمل الولايات المتحدة(ه) من أنظمة مغاير معربا عن الفلورسنت البروتين الموسومة يبني خيالية من المستقبلات وعلامات مقصورة (GTPases على سبيل المثال، رب الأسرة). هذا يحتمل أن يتيح استخدام التصوير الخلية الحية، وإزالة القضايا المتعلقة تثبيت وpermeabilization. في حين قوية، تعاني هذه الاستراتيجية من نفس القيود المفروضة على أنظمة مغاير بشكل عام: العلامة ومستوى التعبير الآثار المترتبة على الاتجار السلوك وعدم التوافق مع أنواع الخلايا أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية. أكثر شعبيا، وتستخدم الأصباغ لتسمية بسهولة حجرات داخل الخلايا (مثل الجسيمات الحالة، ظاهريا) 10. الأصباغ، ومع ذلك، يمكن تفتقر إلى الدقة (جميع العضيات الحمضية في حالة من الأصباغ لالجسيمات الحالة) وليس لتقييم الاتجار بالبشر من خلال المقصورات الأخرى. ومع ذلك، هذه التقنيات تتيح سيطرة كبيرة على النظام والظروف التجريبية، ويمكن الاستفادة من طرق التحليل colocalization المقدمة هنا أدناه.
طريقة ثالبريد الحاضرين هنا تهذب تتبع الاتجار مستقبلات التي كتبها colocalization. باستخدام مناعية (ICC) لتسمية علامات المناسبة، فمن الممكن تحديد عدة حجرات داخل الخلايا متميزة. هذا أيضا يسمح باستخدام زراعة الخلايا الأولية من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة في مكان نظم مغاير. ويشمل هذا البروتوكول ICC تحديد خلايا الفائدة قبل وضع العلامات. هذا يسمح وضع العلامات في timepoint المحددة التالية العلاج من تعاطي المخدرات (ق). وهذا ينتج عنه 'لقطة' من الجمعيات مستقبلات مقصورة العالمية في ذلك timepoint. مع timepoints متعددة، timecourse التغيرات الاتجار يمكن أيضا أن يتم بناؤها.
لفترة وجيزة، والخلايا هي المخدرات المعالجة، وصفت لمستقبلات وحجرة داخل الخلايا من الفائدة، تصوير confocally، ويتم تحليل photomicrographs لتحديد رياضيا colocalization من مستقبلات والمقصورة 11. في استخدامنا، درسنا colocalization من مستقبلات مع رعB5، Rab11، والليزوزومية المرتبطة بروتين الغشاء 1 (LAMP1). هذه علامات تحديد الإندوسومات في وقت مبكر، الإندوسومات إعادة التدوير، والجسيمات الحالة، على التوالي. تعمل هذه التدابير colocalization كوكلاء للعمليات الشاملة للاستيعاب، وإعادة التدوير، وتدهور 12.
كما هو الحال مع جميع التقنيات، وينبغي النظر في بعض القيود. نظرا للحاجة إلى صورة حللت كل الخلايا العصبية الفردية، ويمكن هذا الأسلوب أصبح جدا كثيفة العمالة وفقا لعدد من الشروط وtimepoints المعنية. يجب على جميع immunolabeling أيضا يتعامل مع الآثار المترتبة على التركيب الدقيق الخلوية، وبروتين التعريب، وحاتمة الوصول الناجمة عن التثبيت وpermeabilization 13.
على الرغم الأمثل أصلا للاستخدام مع الثقافات الأولية من الخلايا العصبية الحسية الأولية، وهذا الأسلوب هو متوافق على نطاق واسع مع غيرها من نماذج الثقافة مطلي أحادي الطبقة.
استخدام قياس آثافة كميا رياضيا(ه) من colocalization هو، ولا سيما، أكثر بكثير منهجيا دقيقا من التقنيات السابقة المستخدمة لتقييم التغيرات الاتجار مستقبلات، والتي غالبا ما تعتمد على وتدابير غامضة غير موضوعية مثل تفقد البصر تراكب متعدد القنوات (14).
هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتوافق واسع مع التدخلات في الجسم الحي (قبل جيل ثقافة الأساسي)، في المختبر التدخلات (خلال نمو ثقافة)، ومختلف العلامات تستهدف 15. على هذا النحو، فإنه يمكن تكييفها للعديد من الأسئلة البحثية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: هذا البروتوكول هو متوافق على نطاق واسع مع مختلف النماذج مطلي أحادي الطبقة خلية / زراعة الأنسجة، نظم العلاج من تعاطي المخدرات، وأهداف وصفها. وهكذا في الاستخدام الفعلي، سوف تختلف بناء العديد من المعالم المحددة على التصميم التجريبي. هنا، يشير إلى هذه المعايير المعرفة هي عامة. شروط سبيل المثال، كما تستخدم للحصول على النتائج التمثيلية، وترد بخط مائل.
1. حلول
- يعد غسل العازلة عن طريق خلط 0.1M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) المالحة و 0.05٪ بوليسوربات 20؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 في RT.
- إعداد عازلة تمنع. إلى 0.05 M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) المالحة إضافة 0.05٪ بوليسوربات 20، 3٪ مصل بقري الزلال (BSA) و 0.1٪ الأسماك الباردة الجيلاتين الجلد وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 في RT.
- إعداد الأجسام المضادة مخفف بإضافة 0.05٪ بوليسوربات 20، 1٪ BSA، 0.1٪ الأسماك الباردة الجيلاتين الجلد إلى 0.05 M تريس مخزنة مفرط التوتر (300 ملم) الملحية وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: الرقم الهيدروجيني للمخازن تريس هي التي تعتمد على درجة الحرارة. هذا هو، وتغير في درجة الحرارة تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول. من أجل التناسق، وينبغي أن تكون هذه المخازن دائما تعديل درجة الحموضة، في درجة الحرارة التي سيتم استخدامها.
2. خلية ثقافة
ملاحظة: تختلف البروتوكولات ثقافة الخلية المناسبة استنادا إلى نوع من الخلايا (ق) المستخدمة. يجب أن يكون الأمثل هذه الإجراءات بشكل منفصل. ومنهجيات زراعة الخلايا مفصلة متاحة بسهولة، بما في ذلك 16. تم استخدام إجراء مماثل للحصول على النتائج التمثيلية، مع اختلافات ملحوظة:
- ثقافة الظهرية الخلايا العصبية العقد الجذرية من الحيوانات الكبار كما وصفها 12. استخدام الكبار الخلايا العصبية المتوسطة النمو للثقافة الخلايا. تقليل كثافة الخلايا الدبقية التي كتبها preplating، بدلا من الغلوتامات. هذه النتائج في ثقافة العصبية الدبقية مختلطة نمت على coverslips الزجاج 12 جولة مع لا يقل عن 30-60 الخلايا العصبية في لوحة والمرافق الخلايا الدبقية نمت لapproximatاعل 40٪ confluency. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية في ثقافة الأولية لن تكرر وسيتم دفع الخروج من لوحة كل مثقف شارك الدبقية إذا سمح الدبقية أن تنمو بشكل مفرط. من أجل تجنب التأثير على الخلايا العصبية، والحد المادي للأرقام الدبقية أفضل من الطرق الدوائية الكيميائية /.
ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول، ونحن نفترض أن خلايا الفائدة تزرع لالمرجوة منها تجريبيا للدولة ومطلي أحادي الطبقة. نجد أن الطلاء على coverslips الزجاج 12 جولة في 24 لوحات جيدا ليكون الأكثر ملاءمة. كافة وحدات التخزين والإجراءات الموضحة مناسبة للساترة واحد في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا.
3. العلاج من تعاطي المخدرات من الخلايا المستزرعة
ملاحظة: متتابعة متعددة، أو تداخل، العلاج بالعقاقير ممكنة. العقاقير، جرعات / تركيزات، وفترات التعرض المستخدمة سيعتمد على تجربة محددة.
- إزالة المتوسطة النمو الأصلي 16 ملاحظة: من المهم أن كل تكرار المستقلة (عموما ثقافة وحة 24 بئر واحدة) تحتوي على نفس حالة سيطرة مشتركة. هذا سوف يسمح تطبيع البيانات عبر مكررات، الذي يصحح للتقلب بين المحاكمة.
- احتضان الخلايا في ظروف النمو الأصلية 16 لمدة 48 ساعة.
- لعلاج المخدرات اللاحقة، كرر الخطوات من 3.1 و 3.2 مع Deltorphin 1 ميكرومتر، SNC80 1 ميكرومتر، أو مركبة واحتضان لمدة 60 دقيقة 12. إذابة deltorphin II في الماء وإذابة SNC80 في 10 ملي في 40 ميكرومتر حمض الهيدروكلوريك ويصوتن، المخفف إلى 1 مم في الماء.
ملاحظة: هذا البروتوكول يفترض المخدرات (ق) قد تم solubilized بحيث أنها يمكن حله في تركيز المطلوب (ق) في وسط النمو الذي تم اختياره. الإجراءات المناسبة لوتختلف هذه الإذابة اعتمادا على المخدرات في مسألة ويجب أن يكون الأمثل على حدة. - غسل الخلايا بلطف، ثلاث مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل. تنفيذ كل غسل بلطف بواسطة الشفط السائل من البئر، ثم على الفور، وبلطف، وإعادة تعبئة بشكل جيد مع حل جديد، كما هو مطلوب (في هذه الحالة مع غسل العازلة).
4. التثبيت وسيتولوجية مناعية
ملاحظة: سوف يستهدف وضع العلامات المحددة تختلف من التجربة. في الاستخدام لدينا، وصفت دلتا مستقبلات المواد الأفيونية (DOR) وRab5، راب 11، وLAMP1، كما تمت مناقشته. الأجسام المضادة المحددة المستخدمة سيعتمد على تجربة محددة. شروط وضع العلامات المثلى تعتمد على الأجسام المضادة المحددة (المنشأ) المستخدمة. مناقشة أشمل بكثير من هذا الموضوع أدناه.
- إصلاح الخلايا عن طريق الغمر في ~ 300 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: من المهم أن الفقرة 4٪الفورمالديهايد أن طازجة نظرا لتألق ذاتي الناجمة عن استخدام امتصاص العرق سابقا المجمدة. - غسل الخلايا برفق، 3 مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3.
- احتضان الخلايا في 300 ميكرولتر العازلة حظر لمدة 2 ساعة على RT.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية في 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة مخفف لمدة 48 ساعة على 4 درجات مئوية. في استخدامنا، الأجسام المضادة الأولية ضد DOR (أرنب مكافحة DOR) واحدة من: Rab5 (الماوس مكافحة Rab5)، راب 11 (الماوس مكافحة Rab11)، وLAMP1 (الماعز المضادة للLAMP1).
- غسل الخلايا بلطف، ثلاث مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3.
- احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorophores مختلفة (انظر المناقشة أدناه) في 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة مخفف لمدة 1 ساعة على RT. في هذا، وجميع الخطوات اللاحقة، وحماية الخلايا من الضوء. للحصول على نتائج ممثلة، استخدم الخضراء التي ينبعث منها fluorophore مترافق المضادة للأرنب وإييثإيه انبعاث الأحمر-fluorophore مترافق المضادة للماوس أو انبعاث الأحمر-fluorophore مترافق مكافحة الماعز.
- غسل الخلايا برفق، 3 مرات، مع ~ 1 مل من غسل العازلة في غسل، كما هو موضح في 3.3.
- إزالة لل coverslips 12 جولة من 24 لوحات جيدة من خلال ترك ~ 1 مل من غسل العازلة في كل بئر، وعقد لوحة في ~ 45º، ورافعة ساترة من خارج الأرض جيدا باستخدام ملقط غرامة. وساترة يأتي للراحة ضد الجدار جيدا، من حيث أنه يمكن بسهولة إزالة باستخدام ملقط.
- جبل لل coverslips، خلية جنبا إلى أسفل، على المجهر الشرائح مع anti-يتلاشى تصاعد المتوسط.
5. إعدادات المجهر
- باستخدام الهدف تضخم عالية (100X)، حدد موقع أول خلية التمثيلية للتصوير باستخدام epifluorescence.
- تكوين إعدادات التقاط صورة لتسجيل 8 بت صور TIFF مضغوط من كل قناة المسمى (للكشف عن كل fluorophore المستخدمة على سبيل المثال، 488 نانومتر و 594 نانومتر)، لصورة كل بالتتابع قناة (إما عن طريق الإنترنت أو الإطار)، ومتوسط 4-6 مسح للصورة النهائية. ودقة وضوح الصورة الأمثل هو المجهر محددة، ولكن 1024 x 1024 عادة ما تعطي نتائج جيدة.
- التبديل إلى طريق التصوير متحد البؤر والتركيز على ض الطائرة من خلال مركز الخلية.
- تحسين الثقب (عادة 1 وحدة إيري)، قوة الليزر، وأنبوب مضخم الجهد (ربح) وتعويض لكل قناة. حفظ / تسجيل هذه الإعدادات. استخدام الإعدادات المجهر نفسها لتصوير كل الخلايا المسمى لأي زوج هدف معين في نفس تكرار.
ملاحظة: هذه العملية سوف تؤدي عادة في photobleaching من كافية على أن هذه الخلية لا ينبغي أن تصوير لتحليلها.
6. التصوير
- باستخدام الهدف تضخم عالية (على سبيل المثال، 100X)، حدد موقع أول خلية للتصوير باستخدام epifluorescence.
- التبديل إلى طريق التصوير متحد البؤر والتركيز على ض الطائرة من خلال مركز الخلية. أناو متاح، واستخدام البرامج التكبير / المحاصيل لتقييد منطقة المسح الضوئي إلى الخلية من الفائدة.
- التقاط الصور لكل قناة المسمى باستخدام إعدادات إنشاء سابقا. كرر الخطوات من 6،1-6،3 لصورة 15 أو أكثر من الخلايا في حالة تكرار لكل لضمان عينة كافية.
7. تحليل Colocalization
- فتح زوج من الصور (على سبيل المثال، "الأخضر" و "الأحمر") من خلية في يماغيج. استخدام صورة> اللون> القنوات دمج ... الأمر لتوليد صورة RGB.
- رسم التحديد حول خلية من الفائدة. استخدام يماغيج المساعد "PSC Colocalization" (11؛ متاح من https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) لتحديد colocalization من الأهداف في الخلية المحددة.
- تسجيل التدبير colocalization المطلوب (عادة ص بيرسون 17). كرر الخطوات من 7،1-7،3 لكل خلية المصورة. 8. بيانات التطبيع
- حساب متوسط القيم colocalization المسجلة للظروف سيطرة مشتركة من كل تكرار لكل حالة وصفها.
ملاحظة: على سبيل المثال، متوسط القيم colocalization من الخلايا العصبية في "السيارة لمدة 48 ساعة، 60-مين مركبة" حالة المخدرات في كل من 3 مكررات مستقلة في كل من 3 شروط وضع العلامات (مستقبلات وكل من 3 حجرات). - مضاعفة الوسائل التي كتبها (-1) لانتاج الإزاحة لكل تكرار في كل حالة وصفها. إضافة الإزاحة لكل تكرار في كل حالة وضع العلامات على كل قيمة colocalization في ذلك تكرار.
ملاحظة: هذا تطبيع البيانات مثل أن متوسط قياس colocalization لحالة سيطرة مشتركة هو 0 في كل تكرار لكل حالة وصفها. - تجميع البيانات من جميع مكررات لكل حالة وصفها.
ملاحظة: يمكن الآن تحليل التغييرات في colocalization عبر مكررات. الشرج الإحصائيسوف يسيس تعتمد على التصميم التجريبي ولكن عادة ما تتضمن تحليل-التباين (ANOVA)، يليه الاختبارات المناسبة بعد خاصة (على سبيل المثال، توكي). على الموارد الإحصائية، انظر على سبيل المثال، 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذه التقنية، فمن الممكن لقياس التغيرات في مستقبلات الاتجار بعد استيعاب التالية كلا المزمنة / لفترات طويلة وحادة العلاج بالعقاقير. بعد العلاج بالعقاقير، التثبيت، ووضع العلامات، ويتم التقاط عالية الدقة photomicrographs ثنائي القناة من كل خلية من الفائدة. ويمكن الجمع بين صور تمثيلية مع كاذبة اللون colocalization لتوليد الأرقام توضيحية (الشكل 1). تحليل colocalizational لاحق، كما وصفها، تسفر عن عشرات الكمية من colocalization المستهدفة الهدف (على سبيل المثال، مستقبلات المقصورة علامة). ومن ثم يمكن استخدام هذه البيانات لمقارنة التغيرات في، في هذه الحالة، والاتجار مستقبلات الناجمة عن العلاج من تعاطي المخدرات (ق) (الشكل 2).
الشكل 1. photomicrographs التمثيلية للمستقبل ومقصورة علامة التوسيم مع FALتعرضت خرائط colocalization SE-اللون. الثقافات الأولية من الظهرية العقد الجذرية الخلايا العصبية الحسية لفترات طويلة (48 ساعة) وحدة (1 ساعة) العلاج بالعقاقير (تسميات المحور الأيسر). فقط يتم عرض حالة طويلة واحدة كنتائج التمثيلية. الخلايا ثم تم immunolabeled لمستقبلات المواد الأفيونية الدلتا (DOR) وعلامة من الإندوسومات إعادة التدوير (راب 11) مع متميزة الابتدائي الثانوي (fluorophore مترافق) أزواج الأضداد (تسميات المحور العليا). تم تصوير الخلايا عن طريق ثنائي القناة المجهر متتابعة متحد البؤر (العمود الأيسر، عمود في الوسط). صور تمثيلية تظهر اثنين من الأهداف المسمى في اثنين من الخلايا العصبية. كان يعالج أحد الخلايا العصبية مع المورفين لفترات طويلة تليها سيارة الحادة (أعلى). تم التعامل مع الخلايا العصبية الأخرى مع المورفين لفترات طويلة تليها deltorphin الحادة II (DELT، ناهض DOR، أسفل). بالإضافة إلى تحليل لاحق colocalizational الكمي، تم تجهيز هذه الصور التمثيلية لتوليد خرائط colocalization كاذبة اللون (العمود الأيمن). الحانات النطاق شوث 10 ميكرون. مقتبس من 12 وفقا لأحكام CC BY-NC 3.0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. عشرات colocalization الكمية يمكن استخدامها لمقارنة التغيرات في الاتجار مستقبلات بعد استيعاب. تعرضت الثقافات الأولية من الظهرية العقد الجذرية الخلايا العصبية الحسية لفترات طويلة (48 ساعة) والحادة (1 ساعة) العلاج بالعقاقير (تسميات المحور س). فقط يتم عرض حالة طويلة واحدة كنتائج التمثيلية. الخلايا ثم تم immunolabelled لDOR وعلامات الإندوسومات في وقت مبكر، الإندوسومات إعادة التدوير، والجسيمات الحالة. بعد أن تحدد التصوير عشرات colocalization، تطبيع، والمجمعة عبر 3-4 مكررات مستقلة. ثم تم تحليل البيانات عن طريق تحليل اتجاهين التباين (ANOVA) مع HSD بعد خاصة توكي و. يتم عرض البيانات كما يعني فاصل الثقة +/- 95٪. * يدل p <0.05. كما هو واضح، هذه التقنية تتيح تحديد التغيرات في دور الاتجار بعد استيعاب-الناجم عن العلاج حادة مع deltorphin II، ولكن ليس SNC80 (اثنان منبهات DOR مختلفة). مقتبس من 12 وفقا لأحكام CC BY-NC 3.0. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد الأمثل هذا البروتوكول لتحليل الثقافات الأولية من الكبار الخلايا العصبية عقدة الجذر الظهري (الخلايا العصبية الحسية الأولية). ويمكن أيضا أن تستخدم، مع تعديل طفيف أو لا، لالخلايا المستزرعة مطلي أحادي الطبقة على نطاق واسع. تحليل colocalizational من الممكن أيضا في شرائح الأنسجة والاستعدادات أخرى من هذا القبيل 11، ومع ذلك فإن مكونات العلاج من تعاطي المخدرات وتثبيت الأنسجة / إعداد لا يكون مناسبا.
من الفائدة، وأساليب ICC المقدمة هنا يمكن أن تستخدم أيضا، مع تثبيت المناسب وإعداد الأنسجة، لأداء المناعية المزدوج المسمى في شرائح الأنسجة، وبغض النظر عن تحليل لاحقة (على سبيل المثال، 19).
هذا البروتوكول هو متوافق على نطاق واسع مع أهداف وضع العلامات المختلفة. وكل ساترة للخلايا مطلي يكون المزدوج المسمى. عادة، وهذا سيكون لمستقبلات المصالح وعلامة واحدة من المقصورات في المصالح. هناكسوف يكون عادة شروط وضع العلامات المتعددة من أجل دراسة مستقبلات colocalization مع مقصورات مختلفة متعددة.
الأجسام المضادة هي متغيرة بطبيعتها. سوف تختلف بروتوكولات وضع العلامات المناسبة بين الأجسام المضادة المختلفة. وهذا يشمل التركيزات المناسبة الأجسام المضادة، وصفات العازلة، وtimepoints. كما تجدر الإشارة إلى أن الكثير مختلفة من نفس الأجسام المضادة تعتبر الأفضل أن تكون الأجسام المضادة المختلفة. على هذا النحو، ينبغي التحقق من صحة طرق وضع العلامات والأجسام المضادة النوعية، وإذا لزم الأمر الأمثل لكل مجموعة من الأجسام المضادة والهدف الأنسجة. الأساليب المستخدمة هنا هي نقطة بداية مفيدة. عند التحقق من صحة وضع العلامات، وأنه من المهم لأداء الضوابط المناسبة: وهذا يشمل عينات معالجتها دون إضافة الأجسام المضادة الثانوية (للسيطرة على تألق ذاتي) ودون الأجسام المضادة الأولية (للسيطرة على وضع العلامات الثانوية غير محددة).
هناك العديد من العوامل التي تؤثر علىتصميم طرق وضع العلامات. وتشمل بعض الاعتبارات من المذكرة التي تؤثر على الأساليب المقدمة هنا استخدام مخازن تريس، ملحي مفرط التوتر، بوليسوربات، BSA، والباردة الأسماك الجيلاتين الجلد. يمكن مخازن الفوسفات يسبب أعلى العلامات غير محددة ويمكن أن تتفاعل مع بعض تقارن الأجسام المضادة الأقل استعمالا. ومع ذلك، ومخازن تريس هي، كما لوحظ، ودرجة الحرارة حساسة. تركيز الملح مفرط التوتر تقلل العلامات غير محددة عن طريق تعطيل التفاعلات الأيونية. فمن الممكن لزيادة تركيز الملح تتجاوز ما هو محدد في هذا البروتوكول، إذا رغبت في ذلك. يستخدم بوليسوربات 20 كما السطحي لطيف نسبيا / المنظفات. ويفضل هذا على تريتون X-100، والتي تم الإبلاغ عن تعطيل كبير، أو حتى تذوب، الأغشية، وبالتالي تشوه هيكل التحت خلوية. إدراج من الاسعار المنخفضة للتركيز بوليسوربات 20 في جميع المخازن مفيد في تقليل العلامات غير محددة، كما أنه يحسن من دقة وشمولية يغسل. BSA هو عامل عرقلة تستخدم عادة يقصدلاحتلال بروتين ملزمة مواقع غير محددة في النسيج المستهدف. وأفادت بعض أن BSA قد تجميع ويؤدي إلى وضع العلامات منقط غير محددة. إذا دعت هذه المسألة، فمن الممكن أن تحل محل BSA مع الحليب المجفف منزوع الدسم أو السمك الباردة إضافية الجيلاتين الجلد. الباردة الجيلاتين جلد السمك هو مصدر البروتين غير الثدييات يهدف أيضا لاحتلال البروتين غير محددة ملزمة مواقع حين تقديم المنخفض للتفاعل الأجسام المضادة الموجهة ضد بروتينات في الثدييات 20.
وإن لم يكن المحددة في هذا البروتوكول، وانه يعتبر نموذجا لإضافة، إلى عازلة تمنع، المصل العادي من الأنواع التي تجمع فيها الأجسام المضادة الثانوية. تركيزات النموذجية هي 1-3٪. كما هو مبين أدناه، يجب توخي الحذر عند اختيار الأنواع لتجنب نشاطية متقاطعة.
عندما كشف اثنين أو أكثر من الأهداف fluorescently المسمى، واختيار توليفات fluorophore المناسبة أهمية خاصة. فمن الضروري أن يكون جيد الطيفية سيباالتموينية من أجل تجنب الحديث المتبادل. وعلاوة على ذلك، فإن اختيار fluorophores تعتمد على تكوين المجهر لاستخدامها (الفلاتر المتاحة، وخطوط ليزر، وما إلى ذلك). سوف الموردين الأجسام المضادة Fluorophore مترافق تقديم المشورة حول أفضل مزيج من منتجاتها (على سبيل المثال، 21). نجد 488 nm- و 594 نانومتر fluorophores متحمس لتكون أفضل زوج لمضاعفة وضع العلامات وتحليل colocalizational.
الأجسام المضادة الثانوية وعادة ما تكون الأنواع رد الفعل. وهذا يعني أنها سوف تسمية أي الأجسام المضادة التي تنتجها الأنواع المستهدفة. لذا يتطلب المزدوج وضع العلامات ICC توخي الحذر في اختيار الأنواع مجموعة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية من أجل تجنب عبر التفاعل. على سبيل المثال، إذا تربى الانتخابات التمهيدية في الأرانب والماعز، فإنه لن يكون من المناسب استخدام الثانوية التي أثيرت الماعز. إذا لم توفر الضد يسمح لفصل الأنواع من هذا القبيل، هناك بروتوكولات المتاحة لتحقيق وضع العلامات مع multip، على الرغم من أن من المتوقع أكبر بكثير الأمثل والتحقق من صحة جنيه الأجسام المضادة الأولية نفس المضيف (على سبيل المثال، 22).
كما يقيس هذا الأسلوب colocalization في photomicrographs، فمن الضروري بشكل أساسي أن جميع المجهري تكون متسقة، وذات جودة عالية، وتمثيلا بدقة من العينات تصويرها. وهذا يشمل كلا من الأجهزة المستخدمة (جودة البصريات، الخ) وإجراءات ومعايير معينة المختار. هناك موارد الممتازة المتاحة للحصول على إرشادات حول المجهري المناسب 23،24، بما في ذلك الفحص المجهري خصيصا لتحليل colocalizational 11،17،25.
على الرغم من التفوق المنهجي كبير لأساليب تراكب البصرية، والتدابير الكمية من colocalization لا تقرض كما لطيف أنفسهم لتوليد الأرقام توضيحية للنشر. هذه الأرقام توضيحية هي مفيدة في كثير من الأحيان للقراء ويمكن انتقدت غياب من خلال revieweRS. لقد وجدنا أن إدراج كاذبة اللون تصور colocalization 'heatmaps' أن تكون مفيدة في بناء الشخصيات. البرنامج المساعد يماغيج "Colocalization خارطة الألوان" (متوفر من https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) مفيد في توليد هذه الصور. من المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أن هذه الصور ستكون توضيحي بدقة في سياق تقنية الموضحة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من CIHR (MOP394808) وكرسي أبحاث كندا لCMCEWO كان المستفيد من منحة الدراسات العليا من NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J.
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
