Summary
Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.
Introduction
Receptoren, met name G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs), routinematig intracellulair verhandeld, en naar het celoppervlak 1. Deze complexe, georkestreerd en strak gecontroleerde processen dicteren beschikbaar receptor complementen cellen 'en reguleren receptor tijdelijke activiteit, desensibilisatie, en resensitization 2-4. Belangrijk, deze processen reageren op cellulaire omgevingen zoals drugs geïnduceerde receptor activiteit of inactiviteit. Dat wil zeggen, kan de acties van liganden aan receptoren intracellulaire mensenhandel van die receptoren te veranderen, waardoor de cel responsiviteit veranderen. Op deze wijze extern liganden hebben nog meer effecten op celfunctie, zelfs buiten klassieke messenger-to-effector cascades 5,6.
Het onderzoeken van dergelijke wijzigingen in geïnduceerde receptor mensenhandel is moeilijk. Alle beschikbare technieken te betrekken beperkingen. Bescherming Biotine assays werden gebruikt Monitor oppervlak receptoren populaties. Deze receptoren worden gebiotinyleerd en een tijdsverloop van immunoprecipitaties uitgevoerd om de vermindering van gebiotinyleerde receptoren tijd kwantificeren. Deze techniek ziet wezen geleidelijke afbraak van een aanvankelijk, gelabeld populatie receptoren 7 en is zeer nuttig bij het construeren tijdsverloop van dit proces. Helaas is deze test kan niet anders dan de afbraak van de oorspronkelijke pool van receptoren, zoals internalisatie, recycling of nieuwe receptoren te monitoren. Ook kan de toevoeging van een antilichaam van de 150kDa bereik voor een receptor in het bereik van de 50 kDa receptor handel 8,9 wijzigen en deze techniek moeilijk te gebruiken met een lage expressie-niveau receptoren.
Andere procedures gebruiken verschillende methoden om intracellulaire mensenhandel compartimenten (bv endosomen, etc.) te identificeren en hun colokalisatie beoordelen met de receptoren van belang. Dit omvat de onse van heterologe systemen uiten fluorescerend eiwit-tag chimere constructen van de receptoren en compartiment markers (bijv Rab-familie GTPasen). Dit maakt mogelijk het gebruik van de live-cell imaging, het verwijderen van kwesties in verband met fixatie en permeabilisatie. Terwijl krachtige dergelijke strategie vertoont dezelfde beperkingen van heterologe systemen in het algemeen: tag en expressieniveau effecten op trafficking gedrag en onverenigbaarheid met fysiologisch representatieve celtypen. Meer in de volksmond, worden kleurstoffen gebruikt om eenvoudig intracellulaire compartimenten labelen (bijvoorbeeld lysosomen, ogenschijnlijk) 10. Kleurstoffen kunnen echter specificiteit (alle zure organellen bij kleurstoffen voor lysosomen) ontbreekt en geen handel niet beoordelen via andere compartimenten. Toch zijn deze technieken maken een aanzienlijke controle over het systeem en de experimentele omstandigheden en kunnen profiteren van de colocalization analysemethoden hier gepresenteerde, hieronder.
Werkwijze we hier aanwezig verfijnt het volgen van receptor mensenhandel door colocalization. Met behulp van immunocytochemie (ICC) passende markers label, is het mogelijk om meerdere verschillende intracellulaire compartimenten identificeren. Dit maakt ook het gebruik van fysiologisch relevante primaire celculturen in plaats van heterologe systemen. Deze ICC-protocol gaat vaststelling van de cellen van belang voorafgaand aan de etikettering; Dit maakt de etikettering op een bepaald tijdstip na behandeling met geneesmiddelen (s). Dit levert een 'snapshot' van de wereldwijde receptor-compartiment verenigingen op dat tijdstip. Met meerdere tijdstippen, kan een tijdsverloop van mensenhandel veranderingen ook worden gebouwd.
In het kort, cellen zijn drug-behandelde, gelabeld voor de receptor en intracellulaire compartiment van belang, confocally afgebeeld, en de microfoto's worden geanalyseerd om mathematisch kwantificeren colokalisatie van de receptor en compartiment 11. In onze toepassing, onderzochten we de colokalisatie van een receptor met Rab5, Rab11 en Lysosomale-geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP1). Deze markers te identificeren vroege endosomen, recycling endosomen en lysosomen, respectievelijk. Deze colocalization maatregelen fungeren als proxy voor de overkoepelende processen van internalisatie, recycling, en degradatie 12.
Zoals bij alle technieken moeten enige beperkingen worden overwogen. Vanwege de noodzaak beeld elk individu neuron geanalyseerd, kan deze techniek zeer arbeidsintensief zijn naargelang het aantal condities en tijdstippen betrokken. Alle immunokleuring moet ook kampen met de effecten op de cellulaire ultrastructuur, eiwit lokalisatie en epitoop toegankelijkheid veroorzaakt door fixatie en permeabilisatie 13.
Niettemin oorspronkelijk geoptimaliseerd voor primaire kweken van primaire sensorische neuronen, deze methode is grotendeels verenigbaar met andere monolaag uitgeplaat kweekmodellen.
Het gebruik van een mathematisch gekwantificeerde MEASURe van colocalization is, in het bijzonder, veel meer methodologisch strenger dan de vorige technieken die worden gebruikt om receptor mensenhandel veranderingen, die vaak hebben vertrouwd op vage, subjectieve maatregelen zoals visueel geïnspecteerd multi-channel overlays 14 beoordelen.
Deze techniek is bijzonder bruikbaar voor de brede compatibiliteit met in vivo acties (vóór primaire kweek generatie), in vitro interventies (in groeicultuur) en diverse kenmerken 15 richt. Als zodanig kan worden aangepast aan verschillende onderzoeksvragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Dit protocol is grotendeels compatibel met verschillende monolaag-plated cel / weefselkweek modellen, medicamenteuze behandeling regimes, en etikettering doelen. Zo is in het werkelijke gebruik, zullen veel specifieke parameters variëren op basis van experimenteel design. Hier, verwijzingen naar deze door de gebruiker gedefinieerde parameters zijn generiek. Voorbeeld omstandigheden, zoals gebruikt voor de representatieve resultaten te verkrijgen, zijn cursief weergegeven.
1. Oplossingen
- Bereid wasbuffer door het mengen van 0,1 M Tris-gebufferde hypertonische (300 mM) Zoutoplossing en 0,05% polysorbaat 20; pH 7,4 bij kamertemperatuur.
- Bereid blokkerende buffer. Tot 0,05 M Tris-gebufferde hypertonische (300 mM) Saline voeg 0,05% polysorbaat 20, 3% runderserumalbumine (BSA) en 0,1% koud vissenhuid gelatine en breng de pH op 7,4 bij kamertemperatuur.
- Bereid antilichaamverdunner door toevoeging van 0,05% polysorbaat 20, 1% BSA, 0,1% koude vissenhuid gelatine 0,05 M Tris-gebufferde hypertonische (300 mM) en zoutoplossing op pH 7,4 bij 4 oC
Opmerking: De pH van Tris-buffers temperatuurafhankelijk is. Dat wil zeggen, een verandering in temperatuur zal de pH van de oplossing te veranderen. Voor samenhang moeten deze buffers steeds pH afgesteld bij de temperatuur waarop ze zullen worden gebruikt.
2. Celkweek
Opmerking: Geschikte celkweek protocollen zal variëren op basis van celtype (s) gebruikt. Deze procedures moeten afzonderlijk worden geoptimaliseerd. Gedetailleerde celcultuur methoden zijn direct beschikbaar, waaronder 16. Een soortgelijke procedure werd gebruikt om de representatieve resultaten, met als belangrijke verschillen te vinden:
- Cultuur achterwortelganglia neuronen van volwassen dieren, zoals beschreven 12. Gebruik adult-neuron groeimedium aan de cultuur van de cellen. Verminder de gliale cel dichtheid van preplating, in plaats van glutamaat. Dit resulteert in een gemengde gliale neuron-kweek gekweekt op 12-ronde glazen dekglaasjes met ten minste 30-60 neuronen per plaat en bijbehorende gliale cellen gekweekt tot approximatEly 40% confluentie. Opgemerkt wordt dat neuronen in een primaire kweek niet zal repliceren en gaat uit van de plaat worden gedrukt door co-gekweekt glia als de glia mogen overmatig groeien. Om te voorkomen dat die de neuronen, fysische vermindering van gliale getallen de voorkeur chemisch / farmacologische methodes.
Opmerking: Voor de toepassing van dit protocol, nemen we aan dat de cellen van belang worden gekweekt om hun experimenteel gewenste toestand en-monolaag vergulde. We vinden dat uitplaten op 12-ronde glazen dekglaasjes in 24 putjesplaten meeste handig. Alle volumes en procedures beschreven zijn geschikt voor een dekglaasje in een putje van een 24 wells plaat.
3. Drug Behandeling van gekweekte cellen
Opmerking: Meerdere sequentiële, of overlappende, medicamenteuze behandelingen zijn mogelijk. De drugs, doses / concentraties en duur van de blootstelling zal afhangen van het specifieke experiment.
- Verwijder het originele groeimedium 16 Opmerking: Het is van belang dat elke onafhankelijke herhaalde (gewoonlijk een 24-well plaat cultuur) bevatten hetzelfde gemeenschappelijke controleconditie. Dit zal normalisering van data over replica, die corrigeert voor inter-proces variabiliteit mogelijk te maken.
- Incubeer de cellen in de oorspronkelijke groeiomstandigheden 16 voor 48 uur.
- Voor de daaropvolgende drug behandelingen, herhaalt u de stappen 3.1 en 3.2 met deltorfine 1 uM, SNC80 1 uM, of voertuig en incubeer gedurende 60 min 12. Oplosbaar deltorfine II in water en oplosbaar SNC80 bij 10 mM in 40 uM HCl en ultrasone trillingen, verdund tot 1 mM in water.
Opmerking: Dit protocol veronderstelt het geneesmiddel (en) zijn opgelost zodanig dat zij kunnen worden opgelost in de gewenste concentratie (s) in het gekozen groeimedium. Passende procedures voorzoals oplosbaar is afhankelijk van het betreffende geneesmiddel en moet apart worden geoptimaliseerd. - Was de cellen voorzichtig driemaal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt. Voer elke wasbeurt door voorzichtig opzuigen van de vloeistof uit de put, dan snel, en voorzichtig, het vullen van de goed met verse oplossing, zoals gewenst (in dit geval met het wassen buffer).
4. Fixatie en Immunocytochemie
Opmerking: De specifieke etikettering doelstellingen zullen verschillen per experiment. In onze toepassing kan er gelabelde delta opioïdereceptoren (DOR) en Rab5, Rab 11 en LAMP1, zoals besproken. De specifieke antilichamen zal afhangen van het specifieke experiment. Optimale etiket nader zijn afhankelijk van de specifieke antilichamen (s) gebruikt. Een veel vollediger bespreking van dit onderwerp is hieronder.
- Fixeer de cellen door onderdompeling in ~ 300 pi 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: Het is van belang dat het 4% paraformaldehyde vers bereid vanwege de autofluorescentie veroorzaakt door het gebruik van eerder ingevroren paraformaldehyde. - Was de cellen voorzichtig 3 maal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt, zoals beschreven in 3.3.
- Incubeer de cellen in 300 ul blokkeerbuffer gedurende 2 uur bij KT.
- Incubeer de cellen met primaire antilichamen in 300 gl antilichaam verdunningsmiddel voor 48 uur bij 4 * C. In onze toepassing, primaire antilichamen tegen DOR (konijn anti-DOR) en een van: Rab5 (muis anti-Rab5), Rab 11 (muis anti-Rab11) en LAMP1 (geit anti-LAMP1).
- Was de cellen voorzichtig driemaal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt, zoals beschreven in 3.3.
- Incubeer de cellen met secundaire antilichamen geconjugeerd aan verschillende fluoroforen (zie bespreking hieronder) in 300 gl antilichaam verdunningsmiddel gedurende 1 uur bij KT. In deze en alle volgende stappen beschermt de cellen tegen licht. Om representatieve resultaten te verkrijgen, gebruikt green-emitterende fluorofoor geconjugeerd anti-konijn en either een rood-emitterende fluorofoor geconjugeerd anti-muis of rood-emitterende fluorofoor geconjugeerd anti-geit.
- Was de cellen voorzichtig 3 maal met ~ 1 ml wasbuffer per wasbeurt, zoals beschreven in 3.3.
- Verwijder de 12-round dekglaasjes van 24 putjes door het verlaten ~ 1 ml wasbuffer in elk putje, die de plaat bij ~ 45 ° en wip het dekglaasje af van de put vloer met behulp van fijn pincet. Het dekglaasje komt te rusten tegen de putwand, van waaruit het gemakkelijk kan worden verwijderd met de pincet.
- Monteer de dekglaasjes, cel-side-down, op microscoopglaasjes met anti-fading montage medium.
5. Microscoop Instellingen
- Het gebruik van een hoge vergroting doelstelling (100X), eerst een representatieve cel worden afgebeeld met behulp van epifluorescentie lokaliseren.
- Het beeld vast te leggen instellingen configureren om 8-bit ongecomprimeerde TIFF-afbeeldingen van elk gemerkt kanaal opnemen (voor detectie van elk fluorofoor bijvoorbeeld gebruikt, 488 nm en 594 nm), aan te elk kanaal na elkaar (door lijn of frame), en gemiddeld 4-6 scans voor het uiteindelijke beeld. Optimale beeldresolutie zal microscoop-specifiek zijn, maar 1024 x 1024 levert meestal goede resultaten.
- Schakel de confocale beeldvorming pad en focus naar een z-vlak door het midden van de cel.
- Optimaliseren pinhole (typisch 1 Airy eenheid), laservermogen en fotomultiplier buis voltage (gain) en offset voor elk kanaal. Opslaan / opnemen deze instellingen. Gebruik dezelfde microscoop instellingen voor het afbeelden alle cellen gelabeld voor een gegeven doel pair in dezelfde repliceren.
Opmerking: Dit proces zal gewoonlijk resulteren in voldoende fotobleken dat deze cel niet worden afgebeeld voor analyse.
6. Imaging
- Het gebruik van een hoge vergroting doel (bijvoorbeeld 100X), eerst een cel die moet worden afgebeeld met behulp van epifluorescentie lokaliseren.
- Schakel de confocale beeldvorming pad en focus naar een z-vlak door het midden van de cel. Ikf beschikbaar zijn, gebruiken software zoom / gewas om de scan gebied om de cel van belang te beperken.
- Maak foto's voor elk gemerkt kanaal met de instellingen eerder vastgestelde. Herhaal stap 6,1-6,3 om de afbeelding 15 of meer cellen per conditie per repliceren naar een voldoende steekproef te waarborgen.
7. colocalization Analyse
- Open het paar afbeeldingen (bijvoorbeeld, "groene" en "rode") van een cel in ImageJ. Gebruik de Afbeelding> Kleur> Kanalen Samenvoegen ... commando om een RGB-afbeelding te genereren.
- Trek een selectie rond de cel van belang. Gebruik ImageJ plugin "PSC colocalization" (11; verkrijgbaar van https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) tot colokalisatie van de doelstellingen kwantificeren de geselecteerde cel.
- Noteer de gewenste colocalization maatregel (meestal Pearson's r 17). Herhaal stap 7,1-7,3 voor elke cel afgebeeld. 8. gegevens Normalisatie
- Bereken het gemiddelde van de geregistreerde colocalization waarden van de gemeenschappelijke controlecondities van elk exemplaar van elk labeling conditie.
Opmerking: Bijvoorbeeld, het gemiddelde van de waarden colocalization van neuronen in de "48-hr voertuig 60-min voertuig" drug toestand in elk van 3 onafhankelijke herhalingen van iedere 3 labeling omstandigheden (receptor en elk van 3 compartimenten). - Vermenigvuldig het middel (-1) teneinde de verschuiving voor elke replicaat elk labeling conditie. Voeg de offset voor elke repliceren in elke etikettering voorwaarde om elke colocalization waarde in die repliceren.
Opmerking: Dit zal de gegevens normaliseren, zodanig dat de gemiddelde colocalization maatregel voor de gemeenschappelijke controle conditie is 0 in elk exemplaar van elk etikettering conditie. - Verzamel de gegevens van alle replicaten van elke labeling conditie.
Opmerking: Veranderingen in colocalization kan nu worden geanalyseerd over replica. Statistische analetion zal afhangen van experimentele opzet, maar zal doorgaans betrekken analyse-van-variantie (ANOVA), gevolgd door de juiste post-hoc tests (bv, Tukey). Voor statistische bronnen, zie bijvoorbeeld 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met deze techniek is het mogelijk om veranderingen in post-receptor internalisatie handel na zowel chronische / acute en langdurige behandeling met medicijnen te kwantificeren. Na medicamenteuze behandelingen, fixatie, en etikettering, zijn hoge-resolutie tweekanaals microfoto gevangen van elke cel van belang. Representatieve beelden kunnen gecombineerd worden met valse kleuren colocalization naar illustratieve figuren (figuur 1) te genereren. Latere colocalizational analyse, zoals beschreven, opbrengst kwantitatieve scores van target-target colocalization (bijvoorbeeld receptor-compartiment marker). Deze gegevens kunnen dan gebruikt worden om veranderingen vergelijken, in casu receptor handel geïnduceerd door de behandeling met geneesmiddelen (s) (figuur 2).
Figuur 1. Vertegenwoordiger microfoto van receptor en compartiment-marker labeling met false-color colokalisatie kaarten. Primaire culturen van achterwortelganglia sensorische neuronen werden blootgesteld aan langdurige (48 uur) en acute (1 uur) medicamenteuze behandelingen (aslabels links). Slechts één verlengde toestand wordt weergegeven als representatieve resultaten. De cellen werden vervolgens immunologisch voor delta opioïdereceptoren (DOR) en een marker voor recycling endosomen (Rab 11) met verschillende primaire-secundaire (fluorofoor geconjugeerd) antilichaam pairs (bovenste as labels). De cellen werden afgebeeld door tweekanaals opeenvolgende confocale microscopie (linker kolom middenkolom). Vertegenwoordiger beelden tonen de twee gelabelde doelen in twee neuronen. Een neuron werd behandeld met verlengd morfine gevolgd door acute voertuig (boven). De andere neuron werd behandeld met verlengd morfine gevolgd door acute deltorfine II (DELT, een DOR agonist, onderaan). Naast daaropvolgende kwantitatieve colocalizational analyse werden deze representatieve beelden verwerkt tot kunstmatige kleuren colocalization maps (rechterkant) genereren. Schaal bars show 10 urn. Aangepast van 12 onder de bepalingen van de CC BY-NC 3.0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Kwantitatieve colocalization scores kunnen worden gebruikt om veranderingen in post-receptor internalisatie handel geselecteerd. Primaire kweken van ganglia van sensorische neuronen blootgesteld aan langdurige (48 hr) en acute (1 uur) drugs (x-as labels). Slechts één verlengde toestand wordt weergegeven als representatieve resultaten. De cellen werden vervolgens immunolabelled voor DOR en markers van de vroege endosomen, recycling endosomen en lysosomen. Na beeldvorming colocalization scores werden bepaald, genormaliseerd, en samengevoegd over 3 - 4 onafhankelijke herhalingen. De gegevens werden vervolgens geanalyseerd met tweeweg variantieanalyse (ANOVA) met Tukey's HSD post-hoc. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde +/- 95% betrouwbaarheidsinterval. * Geeft p <0,05. Zoals duidelijk is, deze techniek kon de identificatie van veranderingen in DOR na internalisatie handel geïnduceerd door acute behandeling met deltorfine II, maar niet SNC80 (twee DOR agonisten). Aangepast van 12 onder de bepalingen van de CC BY-NC 3.0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben dit protocol voor de analyse van primaire kweken van volwassen dorsale wortel ganglion neuronen (primaire sensorische neuronen) geoptimaliseerd. Het kan ook worden toegepast met weinig of geen wijziging, voor monolaag gekweekte cellen uitgeplaat lijnen. De colocalizational analyse is ook mogelijk in het weefsel plakjes en andere dergelijke preparaten 11, maar de behandeling met geneesmiddelen en weefsel fixatie / voorbereiding componenten zou niet passend zijn.
Interessant kan de ICC methoden hier gepresenteerde worden gebruikt, met geschikte fixatie en weefselpreparaat, dubbele gemerkte immunohistochemie uitgevoerd in weefselcoupes, ongeacht de daaropvolgende analyse (bijvoorbeeld 19).
Dit protocol is grotendeels compatibel met verschillende etikettering doelen. Elke dekglaasje van vergulde cellen zullen dubbel-gelabeld zijn. Typisch zal dit voor de receptor van belang en een marker van een van de compartimenten van belang. Erzal doorgaans meerdere etikettering voorwaarden om te receptor colocalization met meerdere verschillende compartimenten te onderzoeken.
Antilichamen zijn inherent variabel. Adequate etikettering protocollen variëren tussen de verschillende antilichamen. Dit omvat de juiste antilichaam concentraties, buffer recepten en tijdstippen. Ook moet worden opgemerkt dat verschillende partijen van hetzelfde antilichaam best worden als verschillende antilichamen. Als zodanig moet labelingswerkwijzen en antistofspecificiteit gevalideerd en eventueel geoptimaliseerd voor elke combinatie van antilichaam en doelweefsel. De methoden die hier gebruikt zijn een nuttig uitgangspunt. Bij het valideren labeling is het belangrijk passende controles uitvoeren: dit omvat verwerkt zonder toevoeging van secundaire antilichamen (te controleren voor autofluorescentie) en zonder primaire antilichamen (te controleren voor niet-specifieke secundaire labeling) monsters.
Er zijn veel factoren die invloed hebben op deontwerp voor de etikettering methoden. Enkele overwegingen van opmerking die de hier vermelde werkwijzen omvatten het gebruik van buffers Tris, hypertone zoutoplossing, polysorbaat, BSA en koude vishuid gelatine. Fosfaatbuffers kunnen hogere niet-specifieke etikettering veroorzaken en kan interageren met een aantal minder gebruikte antilichaamconjugaten. Echter, Tris buffers, zoals opgemerkt, temperatuurgevoelige. Hypertone zoutconcentraties verminderen niet-specifieke labeling door het verstoren van ionische interacties. Het is mogelijk om verder te verhogen zoutconcentraties dan wat in dit protocol, indien gewenst. Polysorbaat 20 wordt gebruikt als een relatief zachte surfactant / detergent. Dit verdient de voorkeur boven Triton X-100, waarvan is gemeld aanzienlijk verstoren of zelfs oplossen, membranen en leiden dus subcellulaire structuur. De opname van lage concentratie Polysorbaat 20 in alle buffers is nuttig bij het verminderen van niet-specifieke labeling, omdat het verbetert de grondigheid wasbeurten. BSA is een veelgebruikte blokker bedoeldom niet-specifieke eiwitbindingsplaatsen in het doelweefsel te bezetten. Sommigen hebben gemeld dat BSA kan aggregeren en leiden tot niet-specifieke labeling puntvormige. Als dit probleem zich voordoet, kan men BSA vervangen door niet-vette droge melk of extra koude vissenhuid gelatine. Koud vis huid gelatine is een niet-zoogdieren eiwitbron ook bedoeld om niet-specifieke eiwit-bindende plaatsen te bezetten, terwijl de presentatie lage reactiviteit naar antilichamen gericht tegen eiwitten van zoogdieren 20.
Hoewel niet vermeld in dit protocol, het is typisch toe te voegen, tot het blokkeren buffer, normaal serum van de soorten waarbij het secundaire antilichaam werd opgewekt. Typische concentraties 1-3%. Zoals hieronder besproken, moet de zorg in selectie soorten worden uitgeoefend om cross-reactiviteiten voorkomen.
Bij het detecteren van twee of meer fluorescent gelabelde doelwitten, de keuze van geschikte fluorofoor combinaties bijzonder belangrijk. Het is essentieel om een goede spectrale SEPArantsoen om overspraak te voorkomen. Verder zal de keuze van fluoroforen afhankelijk van de configuratie van de microscoop te gebruiken (verkrijgbaar filters, laserlijnen, etc.). Leveranciers fluorofoor-geconjugeerde antilichaam zal advies geven over de beste combinaties van hun producten (bijvoorbeeld 21). We vinden 488 NM- en 594 nm-enthousiast fluoroforen om beste paar voor double-labeling en colocalizational analyse.
Secundaire antilichamen gewoonlijk species-reactief. Dat wil zeggen, zullen ze geen antilichamen die door de doelsoort te labelen. Double-labeling ICC vereist derhalve voorzichtigheid wendingen gastheersoort van de primaire en secundaire antilichamen om kruisreactiviteit te vermijden. Bijvoorbeeld, als de voorverkiezingen zijn opgegroeid in konijnen en geiten, het zou niet passend zijn om gebruik maken van een geit verhoogde secundaire. Indien beschikbaarheid antilichaam niet mogelijk maken deze soorten scheiding er protocollen beschikbaar voor labeling bereiken met multiple zelfde host primaire antilichamen (bijvoorbeeld 22), maar mag worden verwacht aanzienlijk optimalisatie en validatie.
Aangezien deze methode kwantificeert colocalization in microfoto is principieel noodzakelijk dat alle microscopie consistent hoge kwaliteit, en nauwkeurig representatief voor de afgebeelde monsters. Dit omvat zowel de gebruikte hardware (optische kwaliteit, etc.) en de bijzondere procedures en parameters gekozen. Er zijn uitstekende middelen die beschikbaar zijn voor begeleiding op de juiste microscopie 23,24, inclusief microscopie specifiek voor colocalizational analyse 11,17,25.
Hoewel aanzienlijke methodologische superioriteit visuele overlay methoden behoeven kwantitatieve metingen van colocalization minder goed lenen voor het genereren van betekenisvolle cijfers voor publicatie. Dergelijke illustratieve cijfers zijn vaak nuttig voor lezers en hun afwezigheid kan worden bekritiseerd door reviewers. Wij hebben gevonden dat de opname van kunstmatige kleuren 'heatmaps' visualiseren colocalization om behulpzaam te construeren cijfers zijn. De ImageJ plugin "colocalization Colormap" (verkrijgbaar bij https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) is nuttig in het genereren van deze beelden. Het is belangrijk op te merken echter op dat deze beelden uitsluitend illustratief in de context van de hier beschreven techniek zou zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van CIHR (MOP394808) en een Canada Research Chair aan CMCEWO was de ontvanger van een Post-Graduate Scholarship van NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J.
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
