Summary
Торговля рецепторов модулирует сигнализации и клеток реагировать с лигандами и, непосредственно, в ответ на условиях клеток, включая лиганд-индуцированной сигнализации. Здесь мы описываем мощный и гибкий метод для количественного оценки оборота рецептора медикаментозного используя иммунноокрашивания и colocalizational анализ.
Introduction
Рецепторы, особенно G-белком рецепторов (GPCR,), которые обычно продают внутриклеточно, и из клеточной поверхности 1. Эти сложно оркестровые и плотно контролируемые процессы диктуют доступные дополнения рецепторов клеток и регулировать рецептор временную активность, десенсибилизация и сенсибилизация 2 - 4. Важно отметить, что эти процессы реагируют на клеточных средах, включая активность рецепторов медикаментозного или бездействия. То есть, действия лигандов рецепторов в можете изменить внутриклеточный оборотом этих рецепторов, тем самым изменяя клеток реагировать. Таким образом, внешние лиганды оказывают еще больше эффектов на функции клеток, даже за пределами классической посланник-к-эффектора каскадов 5,6.
Рассматривая такие изменения в индуцированной торговли рецептора трудно. Все доступные методы включают ограничения. Анализы защиты Биотин были использованы для mõniTor поверхностных рецепторов населения. Эти рецепторы биотинилированный и timecourse из иммунопреципитации выполняется для количественного определения снижения биотинилированных рецепторов с течением времени. Эта методика по существу контролирует постепенной деградации начального, снабжены населения рецепторов 7, и это очень полезно при построении временное изменение этого процесса. К сожалению, этот анализ не может контролировать любой процесс, кроме деградации исходного пула рецепторов, таких как интернализации, рециркуляции или новых рецепторов. Кроме того, добавление антител в диапазоне 150kDa с рецептором в диапазоне 50kDa может изменить оборота рецептора 8,9, и этот метод может быть трудно использовать с низкими рецепторов уровня выражений.
Другие процедуры используют различные методы, чтобы определить внутриклеточные отсеки с торговлей людьми (например, Эндосомы, и т.д.) и оценить их колокализацию с рецепторами интерес. Это включает в себя СШАе гетерологичных системах, выражающих флуоресцентный белок-меченых химерных конструктов рецепторов и купейных маркеров (например, Раб-семейные GTPases). Это потенциально позволяет использовать визуализации живых клеток, удаляя вопросы, связанные с фиксацией и проницаемости. В то время как мощный, такая стратегия страдает от тех же ограничений гетерологичных систем в целом: TAG и уровень экспрессии эффектов на поведение и торговлей несовместимость с более физиологически представительных типов клеток. Более широко, красители используются для обозначения легко внутриклеточные отсеки (например, лизосомы, якобы) 10. Красители, однако, может не хватать специфичность (все кислые органелл случае красителей для лизосом) и не оценивают с торговлей через другие отсеки. Тем не менее, эти методы позволяют значительный контроль над системой и экспериментальных условиях и может извлечь выгоду из методов анализа колокализация представленных здесь ниже.
Метод же здесь присутствует уточняет отслеживание оборота рецепторов в колокализации. Использование иммуноцитохимии (МУС), чтобы маркировать соответствующие маркеры, можно определить несколько различных внутриклеточных отсеков. Это также позволяет использовать физиологически соответствующих первичных клеточных культур вместо гетерологичных системах. Этот протокол включает в себя МТП фиксации клеток процентов до маркировки; это позволяет маркировку на определенной временной точке после лечения (ов) лекарственного средства. Это производит «снимок» глобальной ассоциации рецептор-купе в то временной точке. С несколькими моменты времени, timecourse изменений с торговлей людьми также может быть построен.
Вкратце, клетки, обработанных лекарством, помечены для рецептора и внутриклеточное пространство интерес, конфокально отображаемого, и микрофотографии проанализированы математически количественно колокализацию рецептора и отсека 11. В нашем использования, мы рассмотрели колокализацию рецептора с Раb5, Rab11 и Лизосомные связанный мембранный белок 1 (LAMP1). Эти маркеры выявления ранних эндосом, эндосомы переработка и лизосом, соответственно. Эти меры колокализационные действовать в качестве прокси для всеобъемлющих процессов интернационализации, утилизации и деградации 12.
Как и со всеми методами, некоторые ограничения должны быть рассмотрены. В связи с необходимостью к изображению каждый отдельный нейрон анализируемого, эта методика может стать весьма трудоемким в зависимости от ряда условий и временных точках, участвующих. Все иммуномечение также должны бороться с последствиями на клеточном ультраструктуры, локализации белка и эпитопной доступности, вызванных фиксацией и проницаемости 13.
Хотя первоначально оптимизирован для использования с первичных культурах первичных сенсорных нейронов, этот метод широко совместимы с другими моделями монослойной культуры покрытием.
Использование математически количественно изме колокализации является, в частности,, гораздо более методологически строгими, чем предыдущие методы, используемые для оценки изменений с торговлей людьми рецепторов, которые часто полагались на смутных субъективных мер, таких, как визуально-контролируемых многоканальных наложений 14.
Этот метод особенно полезен для его широкой совместимостью с естественных вмешательств (до первичного поколения культуры) в интервенции в пробирке (во время роста культуры), а также различные маркировки цели 15. Как таковой, он может быть адаптирован к различным исследовательских вопросов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол является широко совместимы с различными моделями монослойных покрытием клеток / тканевых культур, схемы лечения наркозависимости, и маркировки целей. Таким образом, в реальных условиях эксплуатации, многие конкретные параметры зависят от экспериментального проектирования. Вот ссылки на эти пользовательских параметров являются общими. Пример условия, а используются для получения репрезентативных результатов, которые выделены курсивом.
1. Решения
- Приготовьте промывочный буфер путем смешивания 0,1 М Трис-буферном гипертонической (300 мм) физиологического раствора и 0,05% полисорбат 20; рН 7,4 при комнатной температуре.
- Подготовка блокирующего буфера. Для 0,05 М Трис-буфером гипертонической (300 мм) Солевой добавить 0,05% полисорбат 20, 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% холодной рыбьего желатина кожи и доведения рН до 7,4 при комнатной температуре.
- Подготовка антител в качестве разбавител добавлением 0,05% полисорбат 20, 1% БСА, 0,1% холодной рыбьего желатина кожи до 0,05 М Трис-буфером гипертонической (300 мм) физиологического раствора и довести рН до 7,4 при 4 о С.
Примечание: рН буфера трис зависит от температуры. То есть, изменение температуры будет изменить рН раствора. Для согласованности, эти буферы всегда должны быть отрегулированным рН при температуре, при которой они будут использоваться.
2. Культура клеток
Примечание: Соответствующие протоколы клеточной культуры будет варьироваться в зависимости от типа (ов), используемого клеток. Эти процедуры должны быть отдельно оптимизирован. Подробные методики культивирования клеток легко доступны, в том числе 16 лет. Аналогичная процедура была использована для получения репрезентативных результатов, с заметные различия:
- Культура, спинных нейронов из взрослых животных, как описано 12. Используйте для взрослых нейронов среду роста культуры клеток. Уменьшение плотности клеток глии от перед металлизацией, чем глутамат. Это приводит к смешанной нейрон-глиальных культуры, выращенной на покровные стекла 12-круглых по крайней мере 30-60 нейронов на чашку и сопровождающих глиальных клеток выращивали до approximatЭли 40% слияния. Следует отметить, что нейроны в первичной культуре не будет копировать и будет выталкиваться от пластины с помощью совместно культивировали глии, если глии могут расти слишком. Для того чтобы избежать воздействия на нейроны, физическое уменьшение числа глиальных предпочтительнее химических / фармакологических методов.
Примечание: Для целей настоящего Протокола, мы предполагаем, что клетки интерес вырос до их экспериментально-желаемое состояние и монослой покрытием. Мы считаем, что покрытие на стеклянных покровных 12-тур в 24-луночных планшетах наиболее удобным. Все объемы и процедуры, описанные являются подходящими для одного покровное в одну лунку 24-луночного планшета.
3. наркологическая культивируемых клеток
Примечание: Несколько последовательный или перекрытие, медикаментозное лечение возможно. Препаратов, дозы / концентрации и продолжительности воздействия используемых будет зависеть от конкретного эксперимента.
- Удалить оригинальный среду роста 16 Примечание: Важно, чтобы каждый независимый повторной (как правило, одна культура 24-луночный планшет) содержат одинаковое общее условие управления. Это позволит нормализации данных через повторов, которая исправляет для взаимного суда изменчивости.
- Инкубируйте клетки в первоначально условиях роста 16 в течение 48 часов.
- Для последующих процедур наркотиков, повторите шаги 3.1 и 3.2 с дельторфина 1 мкМ, SNC80 1 мкм, или транспортное средство и инкубировать в течение 60 мин 12. Солюбилизации дельторфина II в воде и солюбилизации SNC80 в 10 мМ в 40 мкм HCl и разрушать ультразвуком, разбавленного до 1 мМ в воде.
Примечание: Этот протокол предполагает препарат (ы) были солюбилизированного таким образом, что они могут быть растворены в нужной концентрации (ы) в выбранной среде роста. Соответствующие процедуры длянапример солюбилизации может изменяться в зависимости от препарата в вопросе и должен быть отдельно оптимизирован. - Промыть клетки осторожно, три раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку. Выполнение каждой промывки осторожно аспирации жидкости из скважины, затем быстро и аккуратно, заправки и свежим раствором, по желанию (в данном случае с промывочным буфером).
4. Фиксация и Иммуноцитохимия
Примечание: Конкретные цели маркировки будет зависеть от эксперимента. В нашем использования, мы пометили дельта опиоидные рецепторы (DOR) и Rab5, Раб 11, и LAMP1, как описано. Специфические антитела использовали будет зависеть от конкретного эксперимента. Оптимальные условия маркировки зависит от конкретного антитела (страны), используемые. Гораздо полнее обсуждение этой темы находится ниже.
- Фиксации клеток путем погружения в ~ 300 мкл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатно-буферном солевом растворе в течение 10 мин при 37 ° С.
Примечание: Важно, чтобы 4% параформальдегида быть свежеприготовленным из-за флуоресценции, вызванного использованием ранее замороженных параформальдегида. - Промыть клетки осторожно, 3 раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
- Инкубируйте клетки в 300 мкл блокирующего буфера в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Инкубируйте клетки с первичными антителами в 300 мкл антител разбавителем в течение 48 ч при температуре 4 ° С. В нашем использования, первичные антитела против ДОР (кролик анти-Дор) и один из: Rab5 (мышиное анти-Rab5), Раб 11 (мышь анти-Rab11), и ЛАМПА1 (козий анти-ЛАМПА1).
- Промыть клетки осторожно, три раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
- Инкубируйте клетки с вторичными антителами, конъюгированными с различными флуорофоров (см обсуждение ниже) в 300 мкл антител разбавителем в течение 1 часа при комнатной температуре. В этом и всех последующих шагов, защищают клетки от действия света. Для получения репрезентативных результатов, используйте зеленый излучающих флуорофора-сопряженных анти-кролик и eithэр красно-излучающих флуорофора-сопряженных анти-мыши или красно-излучающих флуорофора-сопряженных анти-козел.
- Промыть клетки осторожно, 3 раза, с ~ 1 мл промывочного буфера на каждую промывку, как описано в разделе 3.3.
- Удалить 12-раундовом покровные из 24-луночных планшетах, оставив ~ 1 мл промывочного буфера в каждую лунку, планшет на ~ 45º, а рычаг покровное прочь также полу с помощью тонких щипцов. Покровное будет упираться в стену скважины, откуда легко можно удалить с помощью пинцета.
- Установите покровные, сотовый стороной вниз, на микроскопа слайды с анти-выцветания монтажную среду.
5. Микроскоп Настройки
- Использование высокого увеличения объектива (100X), сначала найдите на представительный ячейку быть отображены с помощью эпифлуоресцентной.
- Настройте параметры съемки изображения для записи 8-разрядных несжатых TIFF изображения каждой надписью канала (для обнаружения каждого флуорофора, используемого, например, 488 нм, и 594 нм), к изображению каждый канал последовательно (либо строки или кадра), и в среднем от 4 до 6 сканов для конечного изображения. Оптимальное разрешение изображения будет микроскоп конкретных, но 1024 x 1024, как правило, дает хорошие результаты.
- Переключение на пути конфокальной микроскопии и фокус в плоскости г через центр клетки.
- Оптимизация микроотверстий (обычно 1 блок Эри), мощность лазера, и фотоэлектронный умножитель напряжения (коэффициент усиления) и смещения для каждого канала. Сохранение / запись этих параметров. Используйте те же настройки микроскопа для визуализации всех клеток меченых для любой целевой пары в то же репликации.
Примечание: Этот процесс, как правило, привести к достаточно фотовыцветания, что эта клетка не должна быть отображены для анализа.
6. изображений
- Использование высокого увеличения цели (например, 100X), сначала найдите ячейку, чтобы быть отображены с помощью эпифлуоресцентной.
- Переключение на пути конфокальной микроскопии и фокус в плоскости г через центр клетки. Яе доступно, использование программного обеспечения зум / культура ограничить область сканирования в ячейки интерес.
- Захват изображения для каждого канала с надписью, используя настройки ранее установленных. Повторите шаги 6.1 до 6.3 до изображения 15 или более клеток в состоянии за репликации для обеспечения достаточного образца.
7. Анализ колокализации
- Откройте пару изображений (например, "зеленый" и "красный") из ячейки в ImageJ. Используйте изображение> Цвет> Объединить каналы ... Команда для создания RGB изображение.
- Нарисуйте выделение вокруг клетки интерес. Используйте ImageJ плагин "PSC колокализации" (11; доступный от https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) количественно колокализации целей в выбранной ячейке.
- Запишите нужную колокализации меру (как правило, г Пирсона 17). Повторите этапы от 7,1 до 7,3 для каждого отображаемого клетки. 8. Нормализация данных
- Рассчитайте среднее записанных значений колокализации общих условиях управления каждой репликации каждого состояния маркировки.
Примечание: Например, среднее из значений колокализации нейронов в "48-часовой автомобиля, 60-мин транспортное средство" состояние лекарственного средства в каждой из 3-х независимых повторностей в каждой из 3-х условиях маркировка (рецептор, и каждый из 3-х отсеков). - Умножение средства от (-1), чтобы получить смещение для каждого репликации в каждом условии маркировки. Добавить смещение для каждого повторить в каждом маркировки состоянии каждому значению колокализации в этой репликации.
Примечание: Это нормализовать данные так, чтобы среднее колокализация мерой общего состояния управления равно 0 в каждой повторности каждого условия маркировки. - Бассейн данные из всех повторов каждого условия маркировки.
Примечание: Изменения в колокализации теперь могут быть проанализированы по повторах. Статистические анальныйлиз будет зависеть от экспериментального дизайна, но, как правило, связаны анализ-дисперсионного (ANOVA) с последующим соответствующих испытаний после специальных (например, Тьюки). Для статистических ресурсов, смотри, например, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя эту технику, можно количественно изменения в рецептора торговли после интернализации следующие обе хронические / длительная и острых медикаментозное лечение. После медикаментозного лечения, фиксации и маркировки, с высоким разрешением двухканальные микрофотографии захвачены в каждой ячейке интерес. Типичные изображения могут быть объединены с неправильным цветом колокализации генерировать иллюстративные фигуры (рисунок 1). После colocalizational анализ, как описано, выход количественный множество целевых целевой колокализации (например, рецептор-отсека маркер). Эти данные затем могут быть использованы для сравнения изменения в, в данном случае, оборот рецептора, индуцированное обработкой (ов) лекарственного (рисунок 2).
Рисунок 1. Типичные микрофотографии рецепторов и купе-маркера маркировки с FALколокализационные карты SE-цвета. Первичные культуры спинальных ганглиях сенсорных нейронов подвергались длительному (48 часов) и острым (1 час) медикаментозного лечения (левая ось этикетки). Только один продолжительный состояние показано в качестве репрезентативных результатов. Затем клетки immunolabeled для дельта опиоидными рецепторами (DOR) и маркера эндосомах утилизации (Раб) 11 с отличной первичной вторичной (флюорофора конъюгированного) антител пар (верхней оси этикетки). Клетки были обследованы с помощью двухканального последовательного конфокальной микроскопии (левой колонке, центральная колонка). Типичные изображения показывают два меченых цели в двух нейронов. Один нейрон обрабатывали длительного морфина с последующим острым автомобиля (вверху). Другой нейрон обрабатывали длительного морфина с последующим острым дельторфина II (дельты, агониста ДОР; внизу). В дополнение к последующим количественным анализом colocalizational эти представительные изображения были обработаны для создания карт колокализационные ложно-цветные (правая колонка). Масштабные бары шоВт 10 мкм. Взято из 12 в соответствии с положениями CC BY-NC 3.0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Количественные оценки колокализационные может быть использован для сравнения изменений в области незаконного оборота рецептора после интернализации. Первичные культуры спинальных ганглиях сенсорных нейронов подвергались длительному (48 часов) и острых (1 час) медикаментозного лечения (ось х этикеток). Только один продолжительный состояние показано в качестве репрезентативных результатов. Затем клетки immunolabelled для DOR и маркеров ранних эндосом, эндосомах утилизации, и лизосом. После визуализации оценки колокализационные были определены, нормализуется, и объединяли по 3 - 4 независимых повторностей. Затем данные были проанализированы с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с HSD ретроспективном Тьюки. Данные представлены как среднее +/- 95% доверительного интервала. * Обозначает р <0,05. Как видно, этот метод позволил выявить изменения в ДОР торговли после интернализации, вызванных острой лечения дельторфина II, но не SNC80 (два различных агонистов DOR). Взято из 12 в соответствии с положениями CC BY-NC 3.0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы оптимизировали этот протокол для анализа первичных культурах взрослых заднекорешковых ганглиев (первичные сенсорные нейроны). Она также может быть использован, практически без изменений, за монослойных покрытием широко культивируемых клеток. Colocalizational анализ можно также в срезах тканей и других подобных препаратов 11, однако компоненты лечения наркозависимости и тканей фиксация / подготовка не будет необходимости.
Интересно, что методы ICC, представленные здесь, также могут быть использованы, при соответствующей фиксации и тканевого препарата, чтобы выполнить двойной меткой иммуногистохимии в срезах тканей, независимо от последующего анализа (например, 19).
Этот протокол широко совместимы с различными целями маркировки. Каждый покровное из посеянных клеток будет двойной меткой. Как правило, это будет в отношении рецептора интереса и маркера одного из отсеков, представляющих интерес. Тамкак правило, будет несколько условий маркировки в целях изучения рецепторов колокализацию с несколькими различными отделениями.
Антитела по сути своей переменной. Соответствующие протоколы маркировки будет варьироваться между различными антителами. Это включает в себя соответствующие концентрации антител, буферные рецепты и временных точках. Следует также отметить, что различные партии одного и того же антитела лучше всего рассматривать как различные антитела. Таким образом, способы маркировки и специфичности антител должно быть подтверждено, и, если необходимо оптимизировать, для каждой комбинации антител и ткани-мишени. Методы, используемые здесь, полезной отправной точкой. При проверке маркировки, важно, чтобы выполнить соответствующие элементы управления: это включает образцы обработанных без добавления вторичных антител (контроль по флуоресценции) и без первичных антител (контроль за неспецифического вторичной маркировки).
Есть много факторов, которые влияют наразработка методов маркировки. Некоторые соображения ноте затрагивающего методы, представленные здесь, включают в себя использование Трис буфера, гипертонического раствора, полисорбат, BSA и холодной рыбьего желатина кожи. Фосфатные буферы могут привести к повышению неспецифической маркировки и может взаимодействовать с некоторыми менее используемых конъюгатов антител. Однако, трис буферы, как уже отмечалось, чувствительный к температуре. Гипертоническая концентрации солей снизить неспецифическую маркировку нарушая ионных взаимодействий. Возможно дальнейшее увеличение концентрации соли сверх того, что указано в этом протоколе, если это необходимо. Полисорбат 20 используется в качестве поверхностно-активного вещества относительно мягким / детергентом. Это предпочтительнее, чем Тритон Х-100, который, как сообщалось, значительно нарушить или даже растворить мембраны и тем самым исказить субклеточные структуры. Включение низкой концентрации Полисорбат 20 во всех буферов полезно в снижении неспецифической маркировки, так как это улучшает тщательность промывки. БСА обычно используется блокирующий агент предназначензанять неспецифические сайты связывания белка в ткани-мишени. Некоторые из них сообщили, что БСА может агрегировать и привести к неспецифической точечной маркировки. Если эта проблема возникает, то можно заменить БСА с обезжиренным сухим молоком или дополнительного холодного рыбьего желатина кожи. Холодный желатин рыбьей кожи не является источником белка млекопитающих также предназначена, чтобы занять неспецифическое связывание белка сайты, представляя низкую реактивность к антителам, направленным против белков млекопитающих 20.
Хотя это и не указано в этом протоколе, это характерно для добавления, блокирующим буфером, нормальной сыворотке от видов, у которых вторичные антитела был поднят. Типичные концентрации 1 - 3%. Как обсуждается ниже, уход в выборе вида должны быть внимательным, чтобы избежать перекрестных реакций.
При обнаружении двух или более флуоресцентно меченные цели, выбор соответствующих сочетаний флуорофором является особенно важным. Это важно иметь хорошую спектральную SEPAРацион, чтобы избежать перекрестных помех. Кроме того, выбор флуорофоров будет зависеть от конфигурации микроскопа для использования (доступных фильтров, лазерных линий и т.д.). Поставщики флуорофорные-антитела, конъюгированного будет давать советы о лучших комбинаций своей продукции (например, 21). Мы находим 488 NM- и 594 нм возбужденных флуорофоры быть лучшей парой для двойной маркировки и colocalizational анализа.
Вторичные антитела, как правило, виды реакционноспособных. То есть, они будут маркировать любые антитела, вырабатываемые целевых видов. Поэтому Дважды маркировки МТП требуется проявлять осторожность при выборе вида хозяина из первичных и вторичных антител, чтобы избежать перекрестной реактивности. Например, если праймериз выращиваются в кролика и козла, это не было бы целесообразно использовать козье поднял вторичный. Если наличие антител не позволяет такого разделения видов, существуют протоколы, доступные для выполнения маркировки с MULTIPле-же хозяева первичные антитела (например, 22), хотя следует ожидать значительно более оптимизация и проверка.
Поскольку этот метод количественно колокализацию в микрофотографии, это принципиально необходимо, чтобы все микроскопия быть последовательным, высокое качество, и точно представитель образцов в образ. Это включает в себя как аппаратные средства, используемые (качество оптики и т.д.) и конкретные процедуры и параметры выбранных. Есть отличные ресурсы для руководства по соответствующим микроскопии, в том числе 23,24 микроскопии специально для colocalizational анализа 11,17,25.
Хотя значительный методологический превосходства визуальных методов наложения, количественные показатели колокализации не так хорошо, поддаются поколения показательных цифр для публикации. Такие цифры иллюстративные часто полезны для читателей, и их отсутствие может быть раскритикован revieweRS. Мы обнаружили, что включение в искусственных цветах визуализирующей колокализации 'Схемы Зоны активности ", чтобы быть полезным в построении фигуры. Модуль ImageJ "колокализации Цветовая карта" (поставляется компанией https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) полезен в создании этих изображений. Важно отметить, однако, что эти изображения были бы строго иллюстративными в контексте методике, описанной здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом CIHR (MOP394808) и Канада заведующая кафедрой в CMCEWO был получателем стипендии последипломного из NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
