Summary
Receptorhandel modulerar signalering och cellsvar till ligander och är, i sig, som reagerar för cellförhållanden, inklusive ligandinducerad signalering. Här beskriver vi en kraftfull och flexibel teknik för att kvantitativt bedöma läkemedelsinducerad receptorhandel med användning immunomärkning och colocalizational analys.
Introduction
Receptorer, särskilt G-proteinkopplade receptorer (GPCR), rutinmässigt trafikerade intracellulärt, till och från cellytan 1. Dessa komplext iscensatt och hårt kontrollerade processer diktera cellernas tillgängliga receptor kompletterar och reglera receptor timliga verksamhet, hyposensibilisering, och resensitization 2-4. Viktigt dessa processer är lyhörda för cellulära miljöer inklusive läkemedelsinducerad receptoraktivitet eller inaktivitet. Det vill säga, kan de åtgärder som ligander vid receptorer förändrar intracellulär handel med dessa receptorer, och därigenom förändra cellsvar. På detta sätt, externa ligander utövar ännu fler effekter på cellfunktion, även utanför klassiska messenger-till-effektor kaskader 5,6.
Undersöka sådana förändringar i inducerad receptorhandeln är svårt. Alla tillgängliga teknik innebär begränsningar. Biotin-skyddsanalyser har använts för att MoniTor ytreceptorer populationer. Dessa receptorer biotinyleras och tidsförloppet av immunoprecipitationer utförs för att kvantifiera minskningen av biotinylerade receptorer över tiden. Denna teknik övervakar i huvudsak den gradvisa nedbrytningen av en initial, märkt population av receptorer 7, och är mycket användbar vid konstruktion av tidsförlopp av denna process. Olyckligtvis är denna analys inte kan övervaka alla andra än nedbrytning av den ursprungliga gruppen av receptorer såsom interna, återvinning, eller nya receptorer processen. Dessutom kan tillsatsen av en antikropp i 150kDa intervallet till en receptor i 50 kDa intervallet förändrar receptorns handel 8,9, och denna teknik kan vara svåra att använda med låga expressionsnivå receptorer.
Andra förfaranden använder olika metoder för att identifiera intracellulära människohandel fack (t.ex. endosomer, etc.) och bedöma deras colocalization med receptorerna av intresse. Detta inkluderar osse av heterologa system som uttrycker fluorescerande protein-märkta chimära konstruktioner av receptorerna och fack markörer (t.ex. Rab-familjen GTPaser). Detta möjliggör potentiellt användningen av levande cell imaging, ta bort frågor som rör fixering och permeabilization. Även kraftfull, lider en sådan strategi från samma begränsningar av heterologa system i allmänhet: tag och uttrycksnivå effekter på människohandel beteende och oförenlighet med mer fysiologiskt representativa celltyper. Mer populärt är färgämnen som används för att enkelt märka intracellulära fack (t.ex. lysosomer, skenbart) 10. Färgämnen kan dock sakna specificitet (alla sura organ i fråga om färgämnen för lysosomer) och inte bedöma människohandel genom andra avdelningar. Ändå dessa tekniker tillåter betydande kontroll över systemet och experimentella förhållanden och kan dra nytta av de metoder colocalization analys som presenteras här nedan.
Metoden we närvarande här förfinar spårning av receptorn människohandel genom samlokalisering. Använda immuncytokemi (ICC) för att märka lämpliga markörer, är det möjligt att identifiera flera distinkta intracellulära avdelningar. Detta medger även användning av fysiologiskt relevanta primära cellkulturer i stället för heterologa system. Detta ICC-protokollet innebär fastställande av celler av intresse före märkning; detta medger märkning vid en specifik tidpunkt efter läkemedelsbehandling (ar). Detta ger en "ögonblicksbild" av globala receptor avdelningar organisationer vid den tidpunkt. Med flera tidpunkter, kan en tidsförloppet av förändringar människohandel också konstrueras.
I korthet, celler är läkemedelsbehandlade, märkt för receptorn och intracellulära fack av intresse, confocally avbildas, och mikrofotografierna analyseras för att matematiskt kvantifiera colocalization av receptorn och facket 11. I vår användning, undersökte vi colocalization av en receptor med Rab5, Rab11 och Lysosomala-associerat membranprotein 1 (LAMP1). Dessa markörer identifiera tidiga endosomer, återvinning endosomer och lysosomer, respektive. Dessa colocalization åtgärder fungerar som ombud för de övergripande processerna för internalisering, återvinning och nedbrytning 12.
Som med alla tekniker, bör vissa begränsningar övervägas. På grund av behovet av att bilden varje individ neuron analyseras, kan denna teknik bli ganska arbetskrävande beroende på antal villkor och tidpunkter inblandade. Alla immunomärkning måste också brottas med effekterna på cellultra, protein lokalisering och epitop tillgänglighet orsakade av fixering och permeabilization 13.
Även ursprungligen optimerad för användning med primära kulturer av primära sensoriska neuroner, är denna metod i stort sett förenlig med andra monoskikt guldpläterade odlingsmodeller.
Användningen av ett matematiskt kvantifieras measure av colocalization är, framför allt, mycket mer metodologiskt strängare än tidigare tekniker som används för att bedöma receptor människohandel förändringar, som ofta har förlitat sig på vaga, subjektiva åtgärder som visuellt inspekterade flerkanalsöver 14.
Denna teknik är speciellt användbar för sitt breda kompatibilitet med in vivo åtgärder (före primärkultur generationen), in vitro-insatser (under kultur tillväxt), och olika märkning riktar 15. Som sådan kan den anpassas till många olika frågeställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs! Detta protokoll är i stort sett förenlig med olika monoskikt guldpläterade cell / vävnadsodling modeller, drogbehandlingskurer, och mål märkning. Sålunda vid faktisk användning, kommer många specifika parametrar varierar beroende på experimentell design. Här hänvisningar till dessa användardefinierade parametrar är generiska. Exempel förhållanden, som används för att erhålla representativa resultat, ingår i kursiv stil.
1. Lösningar
- Bered tvättbuffert genom att blanda 0,1 M Tris-buffrat Hyperton (300 mM) Saline och 0,05% polysorbat 20; pH 7,4 vid RT.
- Bered blockeringsbuffert. Till 0,05 M Tris-buffrad Hyperton (300 mM) Saltlösning till 0,05% Polysorbat 20, 3% bovint serumalbumin (BSA) och 0,1% kall fiskskinnsgelatin och justera pH till 7,4 vid RT.
- Bered antikroppsutspädningsmedel genom tillsats av 0,05% Polysorbat 20, 1% BSA, 0,1% kall fiskskinnsgelatin till 0,05 M Tris-buffrad Hyperton (300 mM) Saltlösning och justera pH till 7,4 vid 4 ° C
Anm: pH-värdet hos Tris-buffertar är temperaturberoende. Det vill säga, en förändring i temperatur kommer att förändra lösningens pH. För konsekvensens skull bör dessa buffertar alltid vara pH-justerade vid den temperatur vid vilken de kommer att användas.
2. Cellkultur
Obs: Lämpliga cellodlings protokoll kommer att variera beroende på celltyp (er) som används. Dessa procedurer måste optimeras separat. Detaljerade cellodlingsmetoder är lätt tillgängliga, inklusive 16. Ett liknande förfarande användes för att erhålla de representativa resultat, med de anmärkningsvärda skillnaderna:
- Kultur dorsalrotsganglier neuroner från vuxna djur som beskrivs 12. Använd vuxen-neurontillväxtmedium att odla cellerna. Minska gliala celldensitet genom preplating, snarare än glutamat. Detta resulterar i en blandad neuron-glia kultur som odlas på 12-runda glastäck med åtminstone 30-60 neuroner per platta och tillhörande gliaceller vuxit till approximately 40% konfluens. Det bör noteras att neuroner i en primärkultur inte kommer att replikeras och kommer att skjutas bort från plattan genom sam-odlas Glia om Glia får växa överdrivet. För att undvika att påverka nervceller, är fysisk minskning av gliaceller siffror att föredra framför kemiska / farmakologiska metoder.
Obs: När det gäller detta protokoll, antar vi att cellerna av intresse odlas på deras experimentellt önskat tillstånd och mono guldpläterade. Vi finner att bordläggningen på 12-runda täckglas i 24 brunnsplattor vara mest praktiskt. Alla volymer och förfaranden som beskrivs är lämpliga för en täck i en brunn på en platta med 24 brunnar.
3. Läkemedelsbehandling av odlade celler
Obs: Flera sekventiell eller överlappande, läkemedelsbehandlingar är möjliga. Drogerna, doser / koncentrationer och exponeringstider används kommer att bero på den specifika experiment.
- Ta bort den ursprungliga odlingsmedium 16 OBS: Det är viktigt att varje oberoende replikat (i allmänhet en enda 24-brunnar kultur) innehåller samma gemensamma styr skick. Detta kommer att tillåta normalisering av data över replikat, som korrigerar för inter rättegång variabilitet.
- Inkubera cellerna i de ursprungliga tillväxtbetingelser 16 för 48 timmar.
- För efterföljande läkemedelsbehandlingar, upprepa steg 3,1 och 3,2 med deltorfin 1 iM, SNC80 1 iM, eller fordon och inkubera i 60 minuter 12. Solubilisera deltorfin II i vatten och lösa SNC80 vid 10 mM i 40 iM HCI och sonikat, späddes till 1 mM i vatten.
Notera: Detta protokoll förut läkemedlet (er) har solubiliserats, så att de kan lösas vid den önskade koncentrationen (er) i den valda tillväxtmediet. Lämpliga förfaranden försådan solubilisering varierar beroende på läkemedlet i fråga och måste optimeras separat. - Tvätta cellerna försiktigt, tre gånger, med ~ 1 ml tvättbuffert per tvätt. Utför varje tvätt genom att försiktigt suga vätskan från brunnen, sedan snabbt och försiktigt, påfyllning brunnen med färsk lösning, om så önskas (i detta fall med tvättbuffert).
4. Fixering och Immunocytochemistry
Obs: De särskilda märknings mål kommer att variera genom experiment. I vår användning, märkt vi deltaopioidreceptorer (DOR) och Rab5, Rab 11, och LAMP1, såsom diskuterats. De specifika antikropparna som används kommer att bero på den specifika experimentet. Optimala märkningsbetingelser är beroende av den specifika antikroppen (er) som används. En mycket fylligare diskussion om detta ämne är under.
- Fixera cellerna genom nedsänkning i ~ 300 | il 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning under 10 min vid 37 ° C.
OBS: Det är viktigt att 4% paraformaldehyd beredas på grund av autofluorescens orsakas av användning av tidigare fryst paraformaldehyd. - Tvätta cellerna försiktigt, 3 gånger, med ~ 1 ml tvättbuffert per tvätt, enligt beskrivningen i 3.3.
- Inkubera cellerna i 300 | j, l blockerande buffert under 2 h vid RT.
- Inkubera cellerna med primära antikroppar i 300 pl av antikroppsutspädningsmedel för 48 timmar vid 4 ° C. I vår användning, primära antikroppar mot DOR (kanin-anti-DOR) och en av: Rab5 (mus-anti-Rab5), Rab 11 (mus-anti-Rab11), och LAMP1 (get-anti-LAMP1).
- Tvätta cellerna försiktigt, tre gånger, med ~ 1 ml tvättbuffert per tvätt, enligt beskrivningen i 3.3.
- Inkubera cellerna med sekundära antikroppar konjugerade till olika fluoroforer (se diskussion nedan) i 300 | il av antikroppspädningsmedel för en timme vid RT. I denna och alla efterföljande steg, skydda cellerna från ljus. För att erhålla representativa resultat, använd grön-emitting fluoroforen-konjugerade anti-kanin och either en röd-emitterande fluoroforen-konjugerade anti-mus eller röd-emitterande fluoroforen-konjugerade anti-get.
- Tvätta cellerna försiktigt, 3 gånger, med ~ 1 ml tvättbuffert per tvätt, enligt beskrivningen i 3.3.
- Ta bort de 12-runda täck från plattor med 24 brunnar genom att lämna ~ 1 ml tvättbuffert i varje brunn, som håller plattan vid ~ 45 ° och bänd täck bort av väl golvet med fin pincett. Täckglas kommer till vila mot brunnsväggen, varifrån det lätt kan avlägsnas med användning av pincett.
- Montera täckglas, cellsidan nedåt, på objektglas med anti-fading monteringsmedium.
5. Mikroskop Inställningar
- Med hjälp av en hög förstoring mål (100X), först hitta en representativ cell som ska avbildas med epifluorescence.
- Konfigurera bild fånga inställningar för att spela in 8-bitars okomprimerad TIFF-bilder för varje märkt kanal (för detektering av varje fluoroforen används t.ex. 488 nm och 594 nm), för att avbilda varje kanal i tur och ordning (antingen genom linje eller ram), och att i genomsnitt 4 till 6 söker efter den slutliga bilden. Optimal bildupplösning blir mikroskop specifika, men 1024 x 1024 ger vanligen goda resultat.
- Växla till den konfokala avbildningsbanan och fokus till ett z-plan genom centrum av cellen.
- Optimera hål (typiskt 1 Airy enhet), lasereffekt, och fotomultiplikatorrör spänning (vinst) och offset för varje kanal. Spara / registrera dessa inställningar. Använd samma inställningar mikroskop för avbildning alla celler märkta för varje givet mål par i samma kopia.
Obs: Denna process kommer vanligtvis att resultera i tillräcklig fotoblekning att denna cell inte bör avbildas för analys.
6. Imaging
- Med hjälp av en hög förstoring mål (t.ex. 100X), först hitta en cell som ska avbildas med epifluorescence.
- Växla till den konfokala avbildningsbanan och fokus till ett z-plan genom centrum av cellen. Jagf tillgänglig, använda programvara zoom / gröda att begränsa skanningsområdet till cellen av intresse.
- Ta bilder för varje märkt kanal med inställningarna som tidigare fastställts. Upprepa steg 6,1-6,3 bilden 15 eller flera celler per betingelse per replikat att säkerställa en tillräcklig prov.
7. colocalization Analys
- Öppna par av bilder (t.ex. "gröna" och "röd") i en cell i ImageJ. Använd bild> Färga> Merge kanaler ... kommando för att skapa en RGB-bild.
- Rita en markering runt cellen av intresse. Använd ImageJ plugin "PSC colocalization" (11, tillgänglig från https://www.cpib.ac.uk/tools-resources/software/psc-colocalization-plugin/) att kvantifiera colocalization av målen i den markerade cellen.
- Spela önskad colocalization åtgärden (typiskt Pearson r 17). Upprepa steg 7,1-7,3 för varje avbildas cell. 8. Data Normalisering
- Beräkna medelvärdet av de registrerade colocalization värdena för de gemensamma kontrollvillkor för varje replikera för varje märkning tillstånd.
Obs: Till exempel medelvärdet av colocalization värden av nervceller i "48-timmars fordon, 60-min bil" drug tillstånd i varje 3 oberoende replikat i varje 3 märkningsförhållanden (receptorn och var och en av 3 fack). - Multiplicera organen från (-1) för att ge förskjutningen för varje replikat i varje märknings skick. Lägg förskjutningen för varje replikeras i varje märkning tillstånd till varje colocalization värde i att replikera.
Obs! Detta kommer att normalisera data så att den genomsnittliga colocalization åtgärd för den gemensamma styr villkoret är 0 i varje kopia av varje märkning tillstånd. - Slå samman data från alla replikat av varje märkning tillstånd.
Obs! Ändringar i colocalization kan nu analyseras över replikat. Statistisk anallys kommer att bero på experimentell design men kommer vanligtvis att analys-of-varians (ANOVA) följt av lämpliga post-hoc-tester (t.ex. Tukeys). För statistiska resurser, se till exempel, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med denna teknik är det möjligt att kvantifiera förändringar i receptor efter internahandel efter både kroniska / långvariga och akuta läkemedelsbehandlingar. Efter läkemedelsbehandling, fixering och märkning, är högupplösta tvåkanaliga fotomikrografier fångas i varje cell av intresse. Bilderna kan kombineras med falskt färg colocalization att generera illustrativa siffror (Figur 1). Efterföljande colocalizational analys, som beskrivs, ge kvantitativa mängder av mål-mål colocalization (t.ex. receptor-fack markör). Dessa data kan sedan användas för att jämföra förändringar i, i detta fall, receptorhandel inducerad av läkemedelsbehandling (er) (Figur 2).
Figur 1. Representativa mikrofotografier av receptor och fack-markör märkning med falSE-färg colocalization kartor. Primära kulturer av dorsalrotsganglier sensoriska neuroner exponerades för långvarig (48 timmar) och akut (1 tim) läkemedelsbehandlingar (vänster axel etiketter). Endast en långvarig tillstånd visas som representativa resultat. Cellerna immunolabeled för deltaopioidreceptorer (DOR) och en markör för återvinning endosomer (Rab 11) med tydlig primär-sekundär (fluorofor konjugerad) par antikropps (bästa axeletiketter). Cellerna avbildades med två-kanals sekventiella konfokalmikroskopi (vänstra kolumnen, mittkolumnen). Bilderna visar två märkta mål i två nervceller. En neuron behandlades med förlängd morfin följt av akut fordon (överst). Den andra neuron behandlades med förlängd morfin följt av akut deltorfin II (DELT, en DOR agonist, botten). Förutom efterföljande kvantitativ colocalizational analys, var dessa representativa bilder bearbetas för att generera falskt färg colocalization kartor (höger kolumn). Skala barer show 10 | im. Anpassad från 12 enligt bestämmelserna i CC BY-NC 3.0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kvantitativa colocalization poäng kan användas för att jämföra förändringar i receptor efter interna människohandel. Primära kulturer av dorsalrotsganglier sensoriska neuroner exponerades för långvarig (48 timmar) och akuta (1 tim) läkemedelsbehandlingar (x-axeletiketter). Endast en långvarig tillstånd visas som representativa resultat. Cellerna immunolabelled för DOR och markörer för tidiga endosomer, återvinning endosomer och lysosomer. Efter avbildning colocalization poäng bestämdes, normaliseras, och slogs samman över 3-4 oberoende replikat. Data analyserades sedan genom två-vägs variansanalys (ANOVA) med Tukey HSD post hoc. Data presenteras som medelvärde +/- 95% konfidensintervall. * Betecknar p <0,05. Såsom är uppenbart, denna teknik medgav identifiering av förändringar i DOR efterinternahandel inducerade genom akut behandling med deltorfin II, men inte SNC80 (två olika DOR agonister). Anpassad från 12 enligt bestämmelserna i CC BY-NC 3.0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har optimerat detta protokoll för analys av primära kulturer av vuxna dorsala ganglieneuroner (primära sensoriska neuroner). Det kan också användas, med liten eller ingen modifiering, för monoskiktserat odlade celler i stort sett. Den colocalizational analys är också möjlig i vävnadssnitt och andra sådana preparat 11, men läkemedelsbehandling och vävnadsfixering / beredning komponenter skulle inte vara lämpligt.
Av intresse kan ICC metoder som presenteras här också användas, med lämplig fixering och vävnadspreparat, för att utföra dubbel-märkt immunohistokemi i vävnadssnitt, oavsett efterföljande analys (t.ex. 19).
Detta protokoll är i stort sett förenlig med olika märknings mål. Varje täck av pläterade celler blir dubbel-märkt. Typiskt kommer detta att vara för receptom av intresse och en markör av ett av facken av intresse. Därkommer typiskt att vara flera märkningsvillkor för att undersöka receptor colocalization med flera olika fack.
Antikroppar är i sig variabel. Lämpliga märkningsprotokoll kommer att variera mellan olika antikroppar. Detta inkluderar lämpliga antikroppskoncentrationer, buffert recept och tidpunkter. Det bör också noteras att olika satser av samma antikropp bäst anses vara olika antikroppar. Som sådan bör metoder märkning och antikroppsspecificitet valideras och vid behov optimeras för varje kombination av antikroppar och målvävnaden. De metoder som används här är en bra utgångspunkt. När validering märkning, är det viktigt att utföra lämpliga kontroller: detta inkluderar prover bearbetats utan tillsats av sekundära antikroppar (att kontrollera för autofluorescens) och utan primära antikroppar (att kontrollera för icke-specifik sekundär märkning).
Det finns många faktorer som påverkarutformning av märkningsmetoder. Vissa överväganden av noterar påverkar de metoder som presenteras här innefattar användning av Tris-buffertar, hyperton saltlösning, Polysorbat, BSA och kall fiskskinnsgelatin. Fosfat buffertar kan orsaka högre ospecifik märkning och kan interagera med vissa mindre använda antikroppskonjugaten. Emellertid, Tris-buffertar är, såsom noterats, temperaturkänslig. Hypertona saltkoncentrationer minska icke-specifik märkning genom att störa joniska interaktioner. Det är möjligt att ytterligare öka saltkoncentrationer utöver vad som anges i detta protokoll, om så önskas. Polysorbat 20 används som en relativt mild tensid / detergent. Detta föredrages framför Triton X-100, som har rapporterats att avsevärt störa eller till och med lösas upp, membran och därmed snedvrida subcellulär struktur. Införandet av låg koncentration Polysorbat 20 i alla buffertar är användbara för att minska icke-specifik märkning, eftersom det förbättrar grundlighet tvättar. BSA är en vanligt förekommande blockerande medel avseddaatt ockupera icke-specifika proteinbindningsställen i målvävnaden. Vissa har rapporterat att BSA kan aggregera och leda till icke-specifik punktat märkning. Om problemet uppstår, är det möjligt att ersätta BSA med fettfri torrmjölk eller ytterligare kall fiskskinn gelatin. Kall fiskskinnsgelatin är ett icke-däggdjursprotein källan även avsett att uppta ospecifik proteinbindningsställen samtidigt presentera låg reaktivitet till antikroppar riktade mot däggdjursproteiner 20.
Även om det inte anges i detta protokoll, är det typiskt att lägga till den blockerande buffert, normalt serum från de arter där den sekundära antikroppen togs upp. Typiska koncentrationer är 1 - 3%. Som diskuteras nedan, måste man i urvals arter utnyttjas för att undvika korsreaktiviteter.
Vid detektering två eller flera fluorescensmärkta mål, är det särskilt viktigt att välja lämpliga fluoroforenheter kombinationer. Det är viktigt att ha bra spektral separanson för att undvika överhörning. Vidare kommer valet av fluoroforer beror på konfigurationen av mikroskopet som skall användas (tillgängliga filter, laserlinjer, osv). Fluorofor-konjugerade leverantörer antikropps kommer att erbjuda råd om de bästa kombinationerna av sina produkter (t.ex. 21). Vi hittar 488 Nm och 594 nm-exciterade fluoroforer att vara bäst par för dubbel märkning och colocalizational analys.
Sekundära antikroppar typiskt art reaktiva. Det är, kommer de att märka eventuella antikroppar producerade av målarten. Dubbel märkning ICC kräver därför att försiktighet iakttas i valet av värdarten av de primära och sekundära antikroppar för att undvika korsreaktivitet. Till exempel, om primär föds upp i kanin och get, skulle det inte vara lämpligt att använda en get-upp sekundära. Om antikropps tillgänglighet inte tillåter sådan separation arter, det finns protokoll som finns tillgängliga för att utföra märkning med multiple samma värd primära antikroppar (t ex 22), men bör förväntas betydligt mer optimering och validering.
Eftersom denna metod kvantifierar colocalization i mikrofotografier är det i grunden nödvändigt att alla mikroskopi vara konsekvent, av hög kvalitet, och noggrant representativa för de prover avbildas. Detta inkluderar både den använda hårdvaran (optik kvalitet, etc.) och de särskilda förfaranden och parametrar som valts. Det finns utmärkta resurser som finns för vägledning om lämplig mikroskopi 23,24, inklusive mikroskopi speciellt för colocalizational analys 11,17,25.
Även om betydande metodologiska överlägsenhet visuella overlay metoder, inte kvantitativa mått på colocalization inte så fint lämpar sig för generering av belysande siffror för publicering. Sådana illustrativa siffror är ofta till hjälp för läsarna och deras frånvaro kan kritiseras av reviewers. Vi har funnit att införlivandet av falsk-färg 'heatmaps' visualisera colocalization att vara till hjälp vid konstruktion av figurer. Den ImageJ plugin "colocalization färgkarta" (tillgänglig från https://sites.google.com/site/colocalizationcolormap/) är användbara för att generera dessa bilder. Det är viktigt att notera, emellertid, att dessa bilder skulle vara strikt illustrativa i samband med den teknik som beskrivs här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från CIHR (MOP394808) och Kanada forskning ordförande till CMCEWO var mottagare av en Post-Graduate Scholarship från NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps - Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1,500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2,000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J.
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -B., Guan, J. -S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -Q., Zhang, Z. -N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. Discovering Statistics Using R. , SAGE Publications. Los Angeles, CA. (2012).
- Mattioli, T. -A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- The Molecular Probes Handbook. Johnson, I., Spence, M. , Life Technologies. Carlsbad, CA. (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. , Springer. New York, NY. (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
