Protocol
Adulti (3-4 mesi) topi maschi su un misto C57BL / 6 di fondo sono stati utilizzati in questo protocollo. Gli animali sono stati tenuti al 12 hr luce / buio ciclo, e consentito l'accesso gratuito al cibo e all'acqua. Tutte le procedure eseguite in questo protocollo sono stati condotti secondo protocolli approvati dalla University Istituzionale cura e l'uso degli animali Comitato Drexel.
1. Preparazione Area Chirurgica
- Disinfettare tavolo operatorio con il 70% di etanolo, quindi coprire l'intera panchina chirurgica con assorbenti e organizzare strumenti chirurgici adiacente stereotassica.
- Impostare attrezzature stereotassico senza braccio manipolatore. Disporre il rilievo di riscaldamento sul stereotassica e impostato a 37 ° C. Evitare il surriscaldamento l'animale mettendo un piccolo pezzo di carta assorbente o tampone chirurgica tra l'animale e il rilievo di riscaldamento.
- Utilizzando le forbici in autoclave, tagliare piccoli pezzi di Gelfoam autoclavato in una piastra di Petri sterile contenente soluzione fisiologica sterile allo 0,9% fino a ready all'uso.
Nota: Mantenere ambiente di lavoro sterile, utilizzando strumenti in autoclave e rifornimenti chirurgici sterili. Re-sterilizzare gli strumenti chirurgici durante la procedura o in tra gli animali mediante immersione in uno sterilizzatore tallone per 10-15 secondi, a seconda delle necessità. Mantenere guanti puliti durante l'intera procedura sfregando le mani con il 70% di etanolo, se necessario, da disinfettare.
2. Prepping mouse per Chirurgia
- Rimuovere mouse dalla gabbia di casa e pesare (g).
- Posizionare il mouse nella camera di induzione isoflurano e ossigeno impostata su 2 L / min e vaporizzatore isoflurano a 5 per indurre un piano chirurgico di anestesia, circa 3-5 minuti. Monitor per la respirazione rallentata e l'immobilizzazione. Verificare che il mouse sia completamente sedato con la reflex pizzico piedi.
- Quando il mouse è completamente sedato, metterli in telaio stereotassico, fissare il naso nel cono naso, che è collegato con un tubo alla isoflurano. Inserire barre di orecchio in canale uditivo e stringere, garantendo la testa è stabile.
- Radere la testa da un orecchio all'altro, e da mezzo agli occhi di dietro le orecchie.
- Sterilizzare la pelle con alternanza di salviette di alcol isopropilico e soluzione betadine iodio, 3 volte ciascuno.
- Applicare lacrime artificiali per entrambi gli occhi per evitare che si secchi durante la procedura chirurgica.
3. Procedura chirurgica
- Monitorare la profondità dell'anestesia pizzicando la punta o la coda. Il topo è nel piano chirurgica appropriata quando non vi è alcuna risposta, e la respirazione è lenta e uniforme.
- Effettuare una incisione cutanea parasagittale da appena dietro gli occhi per quasi tra le orecchie in un unico movimento ferma con una lama n ° 11 bisturi. Spostare la pelle da parte e la clip a destra con pinza emostatica.
- Cancella cranio di membrana sovrastante con il lato opaco del bisturi n ° 11 e il cotone punta applicatori. Facoltativamente, pulire il cranio con cotone applicatore capovolto immerso in soluzione salina allo 0,9%. Lasciare asciugare completamente.
- Noiing un piccolo righello, segnare il bordo anteriore del craniotomia a 1 millimetro caudale alla sutura coronale, e il bordo sinistro del craniotomia a 1 mm lateralmente alla sutura sagittale (figura 1), con un pennarello indelebile. Quindi contrassegnare il bordo destro e caudale della craniotomia a 4 mm dal suture sagittali e coronali, rispettivamente (Figura 1).
- Utilizzando una punta 0,5 millimetri, cominciare a fare craniotomia perforando lentamente seguendo il marcatore contorno permanente. Fare attenzione a non sfondare il cranio completamente. Premere delicatamente sul pezzo isolato di osso parietale con n ° 5 pinze, aree di debolezza darà modo alla pressione. Quando l'osso assottigliata è sufficientemente debole per tutto il perimetro, il pezzo di osso è pronto per la rimozione.
NOTA: Se la difficoltà esperienze investigatore rimuovendo l'osso in un unico pezzo, questo suggerisce che l'osso non era sufficientemente diluito durante la perforazione. Si consideri la foratura ulteriormente il cranio nelle successive animali al facilitafacile rimozione te del pezzo dell'osso. - Usando una siringa da 10 ml munito di ago G 23, applicare una piccola quantità di soluzione fisiologica 0,9% per assorbire l'osso isolata e zona forata.
- Fissare il braccio manipolatore all'apparecchiatura stereotassica. Collegare un nuovo n ° 11 bisturi al titolare sonda con il lato tagliente della lama rivolta verso rostralmente.
NOTA: Sebbene i tessuti rostrale e caudale sperimentano gli spigoli smussati e della lama, rispettivamente, il danno meccanico indotto dalla ferita penetrante è comparabile in tutta l'estensione della lesione. Osserviamo differenze apprezzabili caratteristiche principali di gliosi reattiva tra cui upregulation di espressione GFAP o la proliferazione, tra le sezioni rostrali e caudale. - Tenendo il braccio manipolatore di mezzo, sollevare con cautela l'osso isolato con 5/45 pinze ad angolo. Inserire la punta della pinza nella parte dell'osso isolata e ascensore, utilizzando la leva per tirare fuori il pezzo di osso lasciato in uno fulil movimento l.
NOTA: Fare attenzione a non colpire il cervello o turbare la dura sotto il cranio. - Prendete un piccolo pezzo di schiuma gel assorbibile imbevuto e posizionare sul cervello scoperto per evitare che si secchi e assorbire il sangue che potrebbero essere presenti.
- Una volta che la schiuma di gel è a posto, oscillare il braccio manipolatore in posizione e regolare lama centro craniotomia sopra la schiuma gel. Rimuovere la schiuma gel e abbassare la lama fino a quando la punta tocca la dura, senza pungere la dura. Mark dorsale / ventrale coordinate utilizzando il nonio sul braccio verticale della stereotassico.
- Utilizzando il braccio manipolatore, abbassare lentamente la lama precisamente da 3 mm nel cervello. Ciò si ottiene utilizzando le marcature nonio sul braccio manipolatore. Lasciare lama per rimanere sul posto per 5-10 secondi. Portare il braccio stereotassica con attacco lama rostrale a caudale tre volte permettendo la lama per raggiungere i confini rostrale e caudale della craniotomia prima di passare alla opposifine te.
NOTA: La dura non viene rimosso prima di inserire la lama. In contrasto con la dura madre ratto, che è ~ 80 micron di spessore 7, la dura mouse è considerevolmente più sottile (spessore di pochi strati di cellule) e non produce una resistenza apprezzabile bisturi durante l'inserimento. Utilizzare una nuova lama di bisturi per ogni mouse per garantire che ogni animale riceve una lesione coerente. - Lentamente sollevare il braccio stereotassico, rimuovere la lama dal cervello. Dopo la rimozione della lama, immediatamente posto un altro pezzo di Gelfoam sulla superficie del cervello per assorbire qualsiasi eccesso di sangue o fluido.
- Nel frattempo, smontare il braccio stereotassica e smaltire la lama n ° 11 bisturi. Una volta emorragia si è fermata, rimuovere il Gelfoam.
- Chiudere la ferita sutura la pelle con sutura non riassorbibile, come ad esempio Ethilon o prolene. Le suture devono essere rimossi 9-10 giorni dopo l'intervento.
- Ritorna il mouse per la sua gabbia di casa, e lasciare il mouse per recuperare lentamente su un heating pad e monitor per eventuali segni di sofferenza. Il risveglio dall'anestesia isofluorane indotta si verifica in genere entro 2-5 minuti dopo la rimozione dal isofluorane. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riconquistato recumbancy sternale.
- Somministrare 0,5-1 ml di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea per garantire idratazione.
Cura 4. post-chirurgico
- Seguire da vicino gli animali dopo l'intervento fino al recupero dall'anestesia, prima di tornare alla colonia.
- Per ridurre il dolore e il disagio post-operatorio, amministrare 0,05-0,1 mg / kg buprenorfina per iniezione ip immediatamente dopo la procedura.
- Osservare gli animali per 2-3 giorni dopo l'intervento per gravi segni di sofferenza, come i movimenti limitati, la mancanza di cura, o la perdita di peso. Eutanasia animali che dimostrano uno qualsiasi di questi segni di sofferenza e rimuovere dallo studio.
- Per esaminare istopatologia dei tessuti lesi, eutanasia animali da stanDard perfusione intracardial.
- Brevemente, anestetizzare animali con un sovradosaggio di ketamina / xilazina, quindi intracardiaca perfuso con 15-20 ml di NaCl allo 0,9%, o fino a quando il fegato è liberata di sangue, seguiti da 60 ml di 4% paraformaldeide a conclusione dell'esperimento.
- Sezionare cervelli e post-correzione per 2-4 ore in paraformaldeide al 4% prima del trasferimento a una soluzione di saccarosio al 30%. Cervelli sezione su un criostato a 40-60 micron, e il processo di procedure istologiche o immunoistochimiche standard, oppure come descritto in Garcia 8,9.
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Representative Results
Dato che gli animali sottoposti a questa procedura non richiedono periodi sopravvivenza specializzati cura post-operatorio, brevi o time-lungo termine sono facilmente incorporati nello studio, a seconda delle necessità di indagare patologie acute o croniche a seguito di infortunio. Caratteristiche principali di gliosi reattiva, come l'up-regolazione di GFAP e l'ipertrofia del soma, si può osservare come già 2-3 giorni dopo un trauma. La fase di picco della proliferazione di astrociti reattivi è nei giorni 3-5 seguenti lesioni 10. I risultati rappresentativi di seguito riportate sono da animali che hanno ricevuto una pugnalata ferita lesione sette giorni prima.
La morfologia generale e citoarchitettura del proencefalo seguito di un infortunio proencefalo stab possono essere visualizzati mediante colorazione Nissl (Figura 2). Anche se la traccia della lama è più evidente in tutto il centro della lesione, il citoarchitettura corticale perturbato rivela fino rostrale e caudale del t danneggiataproblema. Astrociti reattivi possono essere osservati mediante immunoistochimica per GFAP (Figura 3). Si noti che molti astrociti corticali non presentano livelli rilevabili di immunoistochimica GFAP in assenza di lesioni. Tuttavia, l'espressione di GFAP è drammaticamente upregulated nel ipsilaterale nell'emisfero al pregiudizio, pur rimanendo a livelli relativamente bassi nell'emisfero controlaterale (Figura 3), suggerendo che gli astrociti reattivi sono limitati per l'emisfero ipsilaterale. Si noti che mentre il tessuto corticale ipsilaterale alla lesione dimostra marcata sovraregolazione di GFAP, altri marcatori di astrociti, come S100β sono costitutivamente espressi in assenza di una lesione (Figura 4), e mantenere livelli di espressione simili lesioni (Figura 4). Oltre a una maggiore espressione GFAP, astrociti reattivi sottoposti ipertrofia delle cellule. Organismi e processi cellulari si ingrossano e mostrano intensa colorazione per GFAP (Figura 3).
La proliferazione di astrociti reattivi può essere osservato con la somministrazione della timidina analogico, 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU), o mediante immunocolorazione per i marcatori di proliferazione Ki67 o PCNA. Noi abitualmente amministriamo 200 mg / kg BrdU, ip, per gli animali durante i giorni 3-5 dopo un trauma, il picco di gliosi reattiva 10 (Figura 3). Tuttavia il dosaggio preciso e tempi di BrdU devono essere considerati in modo indipendente per ogni studio, tenendo presente che BrdU definitivamente marcare le cellule in fase di proliferazione, come pure la loro progenie, al momento della somministrazione, ma che le cellule che entrano nel ciclo cellulare prima BrdU inizia, o dopo la somministrazione di BrdU è completo, non saranno contrassegnati. Nella Figura 4, mostriamo vasta co-localizzazione tra GFAP e BrdU dopo 1 settimana infortunio postale, indicando che molti astrociti reattivi proliferarono nel corso tempo di somministrazione di BrdU. Si noti che proliferating astrociti reattivi sono prevalentemente localizzati adiacente al nucleo della lesione, che astrociti reattivi localizzati distale dal nucleo lesione sono in gran parte non-proliferativa (Figura 4).
Figura 1:. Schematica del cranio del mouse, raffigurante l'area della craniotomia linee blu rappresentano le marcature iniziali identificano i limiti dell'area da perforare. Il massimo dei voti e sinistro sono misurati a 1 mm al di sotto o laterale suture coronali o sagittale, rispettivamente. I marchi in basso ea destra sono valutate al 4 mm dal suture coronale e sagittale, rispettivamente. La craniotomia viene eseguita mediante foratura un cerchio entro i confini contrassegnati (linea tratteggiata), creando una craniotomia che è di circa 3 mm di diametro (linea tratteggiata). Schema non è in scala.
Figura 2: colorazione Nissl tutta l'estensione rostrale-caudale del volume della lesione. (A - C) fette coronali dei cervelli feriti 1 settimana infortunio posto, mostrando il omolaterale emisfero alla lesione. Inserti raffigurano immagini ingrandite delle regioni in scatola. La traccia della lama è più evidente nel centro della lesione, ~ a 2,5 mm rispetto Bregma (freccia in B). Notare la citoarchitettura corticale perturbato (inserti) in sezioni anteriore (A) e posteriore (C) al centro della lesione. Bar Scala 500 micron, inserto, 250 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: strong> Brightfield immunoistochimica per GFAP 1 settimana a seguito di un infortunio forebrain pugnalata. (A - B) immagini a basso ingrandimento di GFAP colorazione nel controlaterale (A) e omolaterale (B) emisferi della stessa sezione di tessuto di un animale ferito. Il sito della lesione è mostrato in (B), e la regione corrispondente nell'emisfero controlaterale indenne è mostrato in (A). Barra Scala, 100 micron. (C - D) immagini ad alto ingrandimento del normale (C) e reattiva (D) astrociti dagli emisferi controlaterale e omolaterali, rispettivamente. Nota la drammatica ipertrofia del corpo e processi di astrociti reattivi cella (D), rispetto a (C). Bar Scala, 10 micron.
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Figura 4: astrociti reattivi proliferano a seguito di un infortunio forebrain pugnalata. (A - B) immunofluorescenza colorazione per BrdU (rosso) e GFAP (verde) in indenne, di controllo (A) e feriti (B) il cervello, 1 settimana dopo lesioni pugnalata. (C - D) Immunofluroescent colorazione per BrdU (rosso) e il marcatore astrociti S100β (verde) nella illeso (C) e di feriti (D) emisferi, 1 settimana dopo lesioni pugnalata. Animali ricevuti BrdU nei giorni 3-5 lesioni posta. Si noti che molti astrociti proliferano nel sito della lesione nella corteccia ferito (B e D, inserti, punte di freccia), mentre gli astrociti nella corteccia indenne non stanno proliferando (A e C, inserti). Controcolorazione con DAPI (blu). Bar Scala, 100 micron, incasso, 25 micron.
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Discussion
E 'fondamentale che il cranio o dura sottostante non vengano danneggiati durante la perforazione. Utilizzare una leggera pressione durante la perforazione al fine di garantire il cranio non è forato. Inoltre, si deve prestare attenzione mentre si solleva il pezzo del cranio per garantire la dura non è decollato con l'osso.
L'infortunio prosencefalo pugnalata qui descritto modelli una ferita penetrante al SNC. Anche se meno clinicamente traducibile di modelli TBI come la FPI e CCI, il modello di lesione prosencefalo pugnalata serve come uno strumento utile per una vasta gamma di studi volti a indagare vari eventi biochimici, cellulari o molecolari innescati da una discreta CNS insulto. Anche se i deficit cognitivi sono stati riportati nei ratti, 3 settimane dopo un infortunio bilaterale pugnalata 11, si deve rilevare che la pugnalata modello di lesione unilaterale, come qui descritto, è più adatto per studi che riguardano la risposta cellulare al danno. Aspetti fondamentali di vari processi neuropatologici, ad esempio cambiandogliosi attivo e la formazione di cicatrici possono essere facilmente osservati e studiati. In contrasto con FPI o CCI che producono diffusa e capillare neuropatologia, l'attivazione gliale localizzata e patologia, facilitare il confronto intra-animali, tra gli emisferi feriti e illeso. Inoltre, l'infiltrazione di cellule meningee nel CNS a livello della lesione offre l'opportunità di studiare le interazioni tra queste cellule e astrociti reattivi locali. Infatti, tali interazioni sono cruciali per la formazione di tessuto cicatriziale, e hanno dimostrato di regolare negativamente le proprietà permissive di astrociti reattivi alla rigenerazione assonale 12.
Qui usiamo procedure immunoistochimiche standard per dimostrare alcune delle caratteristiche principali di astrogliosi reattiva, come l'ipertrofia degli organi e dei processi cellulari, aumentata espressione GFAP, e la proliferazione lesioni indotte. Si noti che, anche se le cavità non sono osservati nei topi a 1-2 settimane folmuggito questa procedura, gli studi su ratti riportano formazione di cavità, 3 settimane dopo la lesione 11. Le differenze di neuropatologia tra i topi e ratti si osservano anche in lesioni del midollo spinale. Mentre i topi che subiscono una ferita del midollo spinale cisti esporre o formazione di cavità nel sito della lesione, tali cavità non si formano nei topi 13,14.
La procedura è semplice, affidabile, facilmente riproducibile, e richiede una minima attrezzatura. Può essere facilmente modificato per eseguire studi effettuati su ratti e topi. In particolare, l'utilizzo di questo modello con varie linee di topo transgenico o in studi farmacologici in grado di fornire nuova comprensione dei meccanismi che regolano la risposta al danno del sistema nervoso centrale. Dimensione della lesione e la gravità possono essere modificati regolando la profondità della lama e di percorrenza del braccio stereotassico portalama per produrre punture discreti anziché lesioni meccaniche longitudinali. Così, il modello di pugnalata ferita prosencefalo può servire come un eccellente experimentapiattaforma l con cui studiare aspetti specifici di varie risposte neuropatologici di un infortunio.
Lesioni al SNC innesca una risposta complessa che è dinamica e pluricellulari 6. Oltre a astrociti reattivi, microglia mobilitare rapidamente di fagocitare detriti e avviare entrambi cascate pro e anti-infiammatori segnalazione 15-18. Microglia e macrofagi attivati invasori producono citochine e chemochine, creando un ambiente ostile per la normale funzione cellulare e la sopravvivenza 19-21. Matrice (ECM) molecole extracellulari, come condroitina solfato proteoglicani (CSPG), sono prodotte da una varietà di tipi cellulari, incluse astrociti reattivi e fibroblasti, e creare un ambiente ostile per la rigenerazione e riorganizzazione strutturale di sopravvivere neuroni 22,23. Qui mostriamo alcune delle caratteristiche principali del astrogliosi reattiva che si verificano a seguito di un infortunio forebrain pugnalata. Upregulation di f intermedioilaments quali GFAP, astrociti proliferazione, e la formazione di cicatrici gliale, seguita da una successiva rimodellamento tissutale sono prontamente valutati secondo procedure di immunoistochimica standard.
Va notato che, mentre alcune caratteristiche della gliosi reattiva sono enfatizzate qui, gliosi reattiva è fortemente dipendente contesto, con caratteristiche diverse e profili di espressione genica che emergono seconda del grilletto 24 specifico. Tuttavia, un certo numero di proprietà fondamentali per quanto riguarda la risposta al danno del sistema nervoso centrale e tentativi di riparazione può essere modellato e ha studiato a prosencefalo stab tessuti lesionati. Infatti, è stato dimostrato che mirata ablazione di proliferare astrociti reattivi seguendo un proencefalo lesioni stab porta ad una maggiore infiltrazione leucocitaria nel SNC e aumento degenerazione neuronale, dimostrando le proprietà neuroprotettive di astrociti reattivi 2. Più di recente, astrociti reattivi isolate in seguito a una lesione penetrante pugnalata, but non una ferita non invasivo, dimostrano neurali potenziale delle cellule staminali in vitro 25,26. Così il stab proencefalo è un modello di lesione potente per studiare una vasta gamma di eventi biochimici, cellulari e molecolari innescati da lesioni al SNC. La facilità e la semplicità di questo modello di lesione faciliterà ulteriori studi che possono portare a nuove intuizioni nella risposta del sistema nervoso centrale a meccanismi di lesione e riparazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
References
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