Protocol
혼합 C57BL / 6 배경에 성인 (3-4 개월) 수컷 마우스는이 프로토콜에 사용되었다. 동물은 12 시간의 빛 / 어둠주기에 보관하고, 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있게 하였다. 이 프로토콜에서 수행되는 모든 절차는 드렉 셀 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 외과 영역 준비
- 70 % 에탄올로 수술 테이블을 소독 한 후 흡수 패드 전체 수술 벤치를 커버하고 정위에 인접 수술 도구를 준비.
- 조작 암없이 정위 장치를 설정합니다. 정위에 가열 패드를 배열하고 37 ℃로 설정합니다. 동물과 가열 패드 사이에 종이 타월이나 수술 패드의 작은 조각을 배치하여 동물의 과열을 피하십시오.
- 멸균 가위를 사용하여, REA까지 0.9 % 멸균 식염수를 함유하는 무균 페트리 접시에 멸균 gelfoam을 작은 조각을 잘라사용 DY.
참고 : 멸균 장비 및 무균 수술 소모품을 사용하여 멸균 작업 환경을 유지한다. 필요에 따라 10 ~ 15 초 동안 비드 살균기에 침지하여 동물 사이 절차를 수행하는 동안 또는에서 수술 도구를 다시 소독. 소독, 필요에 따라, 70 % 에탄올로 손을 문질러서 절차를 통해 깨끗한 장갑을 유지한다.
수술 2. 준비하고 마우스
- (G) 홈 케이지에서 마우스를 제거하고 무게.
- 이소 플루 란 유도 챔버 및 2 내지 5 L / 분으로 설정 이소 플루 란 기화기 산소로 놓고 마우스, 수술 적 단계의 마취에 약 3-5 분을 유도. 둔화 호흡과 고정을위한 모니터링합니다. 마우스가 완전히 발가락 핀치 반사를 이용하여 진정되어 있는지 확인합니다.
- 마우스가 완전히 진정 될 때, 정위 프레임에 배치 이소 플루 란에 튜브로 연결되어 코 콘에 코를 고정합니다. 머리를 보장하는 것은 안정, 귀 운하에 귀 막대를 삽입하고 조입니다.
- 귀에 귀에서 머리를 면도하고, 눈 사이에서 귀 뒤쪽에.
- 이소 프로필 알콜과 betadine 요오드 용액, 3 회씩 교대 와이프로 피부를 소독.
- 수술하는 동안 건조되는 것을 방지하기 위해 두 눈에 인공 눈물을 적용합니다.
3. 수술
- 발가락이나 꼬리를 곤란하게하여 마취의 깊이를 모니터링합니다. 응답이없고, 호흡 속도가 느린 경우에도 마우스 적합한 수술면이다.
- 다만 거의 11 호 메스 블레이드를 사용하여 하나, 회사의 움직임에 귀 사이에 눈 뒤에서 시상 피부 절개를합니다. 옆으로 피부를 이동하고 지혈과 오른쪽 클립.
- 11 호 메스와면의 무딘면을 사용하여 상부 막 클리어 두개골 어플리케이터를 쳐 냈습니다. 면 팁 어플리케이터는 0.9 % 식염수에 담근으로 선택적으로, 두개골을 닦습니다. 완전히 건조하도록 허용합니다.
- 우리작은 통치자를 보내고, 영구 마커, 시상 봉합 (그림 1) 측 방향 1mm의 관상 봉합에 꼬리 및 1mm의 개두술의 왼쪽 가장자리에서 개두술의 전방 경계를 표시합니다. 그리고 시상 및 관상 봉합, 각각 (그림 1)에서 4mm에서 개두술의 오른쪽 꼬리 경계를 표시합니다.
- 0.5 mm의 드릴 비트를 사용하여, 영구 마커 개요 다음 천천히 뚫어서 개두술을 시작한다. 완전히 두개골을 돌파하지 말아주십시오. 눌러 부드럽게 제 5 호 집게로 정수리 뼈의 고립 된 조각에, 부족한 부분은 압력에 방법을 제공합니다. 얇게 뼈 경계에 걸쳐 충분히 약한 경우, 뼈 조각 제거를위한 준비가되어 있습니다.
참고 : 연구자의 경험에 어려움이 한 조각의 뼈를 제거하는 경우,이 뼈가 충분히 시추 중에 희석되지 않았 음을 시사한다. facilita 이후 동물에 더 두개골을 드릴 고려뼈 조각의 테 쉽게 제거. - 23 G 바늘 장착 10 ㎖ 주사기를 사용하여, 고립 된 뼈와 천공 영역을 적시고 0.9 % 식염수의 소량을 적용한다.
- 정위 장비 조작 암을 연결합니다. rostrally 직면 블레이드의 날카로운면이 프로브 홀더에 새 11 호 메스 블레이드를 연결합니다.
주 : 주동이와 꼬리 조직은 블레이드의 날카로운 무딘 에지를 경험하지만, 각각 관통 부상에 의한 기계적 손상이 병변의 범위에 걸쳐 비교이다. 우리는 주동이의와 꼬리 부분 사이 GFAP 발현 또는 확산의 상향 조절을 포함한 반응성 신경교 증의 주요 기능에 뚜렷한 차이가 관찰되지 않습니다. - 길에서 조작 암을 유지, 신중하게 45분의 5 직각 집게를 사용하여 고립 된 뼈를 들어 올립니다. FUL 하나에 남아 뼈의 조각을 해내 레버리지를 사용하여 고립 된 뼈와 리프트의 측면에 포셉의 끝을 삽입L 운동.
참고 : 뇌를 찔러 또는 두개골 아래에 경질을 방해하지 않도록주의하십시오. - 흠뻑 흡수 젤 거품의 작은 조각을 가지고 마르지 않도록하고있을 수있는 혈액을 흡수하기 위해 노출 된 뇌에 배치합니다.
- 젤 거품이 장소에 있으면 제자리로 조작하는 사람의 팔을 스윙 젤 폼을 통해 개두술의 중심에 블레이드를 조정합니다. 젤 거품을 제거하고 끝이 경질을 천공없이 경질에 닿을 때까지 블레이드를 내립니다. 마크 지느러미 / 정위의 수직 팔에 버니어 스케일을 사용하여 복부 좌표.
- 조작 암을 사용하면, 천천히 블레이드를 뇌에 정확하게 3mm를 내립니다. 이것은 조작자 암에 버니어 스케일 표시를 사용함으로써 달성된다. 잎이 5 ~ 10 초 동안 제자리에 머물 수 있도록합니다. opposi로 이동하기 전에 개두술의 주동이와 꼬리의 경계에 도달하는 날을 허용 세 번이 꼬리 지느러미에 블레이드 첨부 주동이와 정위 팔을 이동테 끝.
참고 : 경질 블레이드를 삽입하기 전에 제거되지 않습니다. 인 쥐 경질, ~와 대조적으로, 두께 80 μm의 7은 마우스 경질 상당히 얇은 (몇 세포층 두께) 및 삽입 중에 메스 블레이드에 상당한 저항이 발생하지 않는다. 각 동물 일관된 부상을받을 수 있도록하기 위해 각 마우스의 새 메스 블레이드를 사용합니다. - 천천히 뇌에서 블레이드를 제거, 정위 팔을 올립니다. 블레이드의 제거 후, 즉시 초과 혈액이나 액체를 흡수하는 뇌 표면에 gelfoam을의 또 다른 조각을 배치합니다.
- 한편, 정위 팔을 제거하고 11 호 메스 블레이드 폐기하십시오. 출혈이 중지되면, gelfoam을 제거합니다.
- 이러한 에틸 론 또는 prolene의 비 흡수성 봉합사와 피부를 봉합에 의해 상처를 닫습니다. 봉합사는 수술 후 9~10일 제거해야합니다.
- 홈 케이지에 마우스를 반환하고, 마우스 난방 시스템에 천천히 복구 할 수 있습니다고통의 흔적에 대한 G 패드와 모니터. 이소 플루오 란 마취 유도 회복은 일반적으로 이소 플루오 란에서 꺼낸 후 2-5 분 이내에 발생한다. 이 흉골 recumbancy을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.
- 수화을 보장하기 위해 락 테이트 링거액 피하의 0.5 ml의 관리를 선택합니다.
4. 포스트 수술 케어
- 밀접하게 식민지로 돌아 가기 전에 마취에서 회복 될 때까지 수술 후 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- , 수술 후 통증과 불편 함을 줄일 즉시 절차에 따라 IP 주입에 의해 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 노르 핀을 관리합니다.
- 거동이 운동, 정리의 부족, 또는 체중 감소와 같은 고통의 심각한 징후 수술 후 2-3 일 동안은 동물을 관찰한다. 고통의 이러한 징후를 보여주는 동물을 안락사 및 연구에서 제거합니다.
- 스탠에 의해 동물을 안락사, 손상 조직의 조직 병리학을 검사하려면dard intracardial 관류.
- 간단히, 케타민 / 자일 라진의 과다 복용과 동물을 마취 한 후 intracardially 15 ~ 20 ml의 0.9 %의 NaCl로 관류, 또는 간은 실험의 결론에 4 % 파라 포름 알데히드의 60 ml의 다음에, 피 제거 될 때까지.
- 30 % 자당 용액에 전송하기 전에 4 % 파라 포름 알데히드에 2-4 시간 동안 두뇌 및 사후 수정을 해부하다. 가르시아 8,9에 설명, 또는 표준 조직 학적 또는 면역 조직 화학적 방법에 의해 섹션 40 ~ 60 μm의에서 저온 유지 장치에 두뇌 및 프로세스.
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Representative Results
이 절차를 겪는 동물이 필요하지 않기 때문에, 수술후 치료 전문 단기 또는 장기 생존 시간주기 쉽게 손상 후 급성 또는 만성 병리학 조사 할 필요성에 따라, 연구에 포함된다. 이러한 GFAP와 소마의 비대의 상향 조절 반응성 신경교 증의 주요 기능은, 일찍 부상 다음 2~3일으로 관찰 할 수있다. 반응성 성상 세포에 대한 증식의 최고 단계는 부상 10 다음 일 ~ 5시입니다. 아래의 대표적인 결과 7 일 이전에 찔린 상처 병변을받은 동물입니다.
전뇌의 자상 부상 다음 전뇌의 일반적인 형태와 cytoarchitecture는 Nissl 염색 (그림 2)에 의해 가시화 될 수있다. 블레이드 트랙 병변의 중앙에 걸쳐 가장 두드러진이지만, 파괴 피질 cytoarchitecture 손상된 t의 입쪽와 꼬리 정도 밝혀문제를 해결합니다. 반응성 성상 세포는 GFAP (그림 3)에 대한 면역 조직 화학 염색으로 관찰 할 수있다. 많은 대뇌 피질의 성상 세포는 손상이없는 경우 GFAP의 면역 검출 수준을 나타내지 않는 것이 있습니다. 반대측 반구 (그림 3)에서 상대적으로 낮은 수준을 유지하면서 그러나, GFAP의 발현이 크게 반응성 성상 세포는 동측 반구로 제한됩니다 것을 건의, 부상으로 반구 동측에서 상향 조절된다. 참고 병변에 대뇌 피질의 조직 동측는 GFAP의 현저한 상향 조절, 다른 성상 세포 마커, S100β 등이 구조적으로 부상 (그림 4)의 부재로 표현, 부상 (그림 4) 다음과 유사한 발현 수준을 유지하고 있습니다을 설명한다. 증가 GFAP 발현 이외에, 반응성 성상 세포는 세포의 비대를 겪는다. 세포 기관 및 프로세스는 확대되고 (GFAP에 대한 강한 염색을 보여그림 3).
반응성 성상 세포의 증식, 또는 증식 마커 또는 사료된다 PCNA 면역 염색하여 티미 딘 유사체, 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의)을 투여함으로써 관찰 될 수있다. 우리는 일상적으로 일 동안 동물, 3-5 다음 부상, 반응성 신경교 증 (10) (그림 3)의 피크를 200 ㎎ / ㎏ BrdU의이 IP를 관리 할 수 있습니다. 그러나의 BrdU의 정확한 투여 량과 타이밍 독립적 BrdU의 영구적 투여시, 증식을 겪는 세포뿐만 아니라, 그들의 자손 라벨 것을 명심 각각의 연구를 위해 고려되지만되어야한다는 BrdU의 전 세포주기를 입력 셀 시작, 또는 BrdU의 관리를 완료 한 후, 표시되지 않습니다. 그림 4에서, 우리는 많은 반응성 성상 세포가 BrdU의 관리의 시간 과정에서 증식을 나타내는 1 주 후 부상에서 GFAP 및 BrdU의 사이에 광범위한 공동 현지화을 보여줍니다. 그 홍보를 참고oliferating 반응성 성상 세포 반응성 성상 세포가 병변 코어에서 원심을 지역화하는 반면 주로, 병변 코어에 인접한 현지화 크게 비 증식 (그림 4)이다 있습니다.
그림 1. 마우스 두개골의 개략도, 개두술의 영역을 나타내는 파란색 선 영역의 경계를 식별하는 초기 표시가 천공되도록 도시한다. 위쪽 및 왼쪽 마크는 각각 아래의 1mm에서 측정 또는 관상 또는 시상 봉합에 측면된다. 하단과 오른쪽 마크는 각각, 관상 및 시상 봉합에서 4mm로 측정하고 있습니다. 개두술은 직경 (점선)에 약 3mm이다 개두술을 작성, 표시 범위 내에서 원 (점선)을 시추에 의해 수행된다. 도식은 축척이 아니다.
그림 2 : 병변 볼륨의 주동이의 - 꼬리 범위에 걸쳐 Nissl 염색. (A - C) 병변에 반구 동측을 보여주는 부상 뇌의 코로나 조각 일주 포스트 부상. 세트는 박스 지역의 이미지를 확대 도시한다. 블레이드 트랙은 ~, 브레 그마 (B의 화살표)에서 2.5 mm의 병변의 중심에서 가장 눈에 띄는입니다. 병변의 중심 부분의 앞쪽 (A)와 후방 (C)의 중단 대뇌 피질의 cytoarchitecture (세트)를 참고. 스케일 바 500 μm의, 삽입, 250 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 강한> 전뇌의 자상 부상 다음 GFAP 일주에 대한 시야 면역 조직 화학. (A - B) 부상 동물로부터 반대측 (A)에서 GFAP 염색 및 동측 성 (B)와 동일한 조직 절편의 반구의 저배율 이미지. 병변 부위를 (B)에 도시되고, 손상되지 않은 반대쪽 반구의 해당 영역 (A)에 도시되어있다. 스케일 바, 100 μm의. (C - D) 정상 (C)과 반대측 동측 반구에서 반응성 (D) 아스트로 사이트의 고배율 이미지 각각. (C)에 비해에서 세포체 및 반응성 성상 세포의 프로세스의 극적인 비대 (D)를 참고. 스케일 바, 10 μm의.
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그림 4 : 반응성 성상 세포는 전뇌의 자상 부상 다음 증식. (A - B) BrdU의 (적색)과 GFAP (녹색) 손상되지 않은, 제어 (A)과 부상 (B)의 뇌, 자상 부상 다음 일주에 대한 면역 형광 염색. (C - D) BrdU의 (빨간색)에 대한 Immunofluroescent 염색 및 성상 세포 마커 S100β (녹색) 손상되지 않은 (C)과 부상 (D) 반구, 자상 부상 다음 일주. 동물 일 3-5 포스트 부상을 통해 BrdU의를 받았다. 손상되지 않은 피질에서 성상 세포는 (A와 C, 인 세트)를 증식하지 않는 반면, 많은 성상 세포는, 부상 피질 (B와 D, 세트, 화살촉)에서 병변 부위에서 증식되어 있습니다. DAPI (파란색)으로 대조. 스케일 바, 100 ㎛, 삽입, 25 μm의.
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Discussion
그것은 두개골 또는 기본 두라는 시추하는 동안 손상되지 것이 중요합니다. 구멍이되지 두개골을 보장하기 위해 시추하는 동안 가벼운 압력을 사용합니다. 경질을 보장하기 위해 두개골 조각을 해제하는 것은 뼈와 함께 들어 올려되지 않은 상태뿐만 아니라,주의를 기울여야합니다.
전뇌의 자상 부상 모델 여기 중추 신경계에 침투 부상을 설명했다. 이러한 FPI 또는 CCI 등 TBI 모델보다 임상 적으로 번역하지만, 전뇌의 자상 병변 모델은 이산 CNS의 모욕에 의해 트리거 다양한 생화학 세포 또는 분자 사건을 조사하기위한 연구의 넓은 범위에 대한 유용한 도구 역할을한다. 인지 결핍이 래트에서보고되었지만, 3 주 양자 자상 부상 11 후에는 일방적 자상 병변 모델은 여기에 기술 된 바와 같이, 부상 세포 반응을 해결 연구에 가장 적합한 것을 주목해야한다. 이러한 재 등 다양한 신경 병리학 적 과정의 기본 관점,활성 신경교 증과 흉터 형성은 쉽게 관찰하고 연구 할 수 있습니다. 확산 및 광범위한 신경 병리학, 지역화 아교 활성화 및 병리를 생성 FPI 또는 CCI 대조적으로 부상하고 손상되지 않은 반구 사이 인트라 동물의 비교를 용이하게한다. 또한, 병변 부위 CNS에 수막 세포의 침윤이 지방 세포의 반응성 성상 세포 사이의 상호 작용을 조사 할 기회를 제공한다. 실제로, 이러한 상호 작용은 흉터 조직의 형성에 중요하고, 부정적인 축삭 재생 (12)에 반응성 성상 세포의 허용 특성을 조절하는 것으로 나타났다.
여기에서 우리는 세포 기관 및 프로세스의 비대, 증가 GFAP 발현, 부상에 의한 확산 등의 반응 astrogliosis의 주요 기능 중 일부를 보여주기 위해 표준 면역 조직 화학적 방법을 사용합니다. 공동 1 ~ 2 주에 마우스에서 관찰되지 않지만 FOL합니다과 같은 절차, 래트를 이용한 연구에서 부상 11 다음 3주, 공동 형성을보고한다. 마우스 및 래트 신경 병리학 사이의 차이는 또한 척수 손상에서 관찰된다. 척수 손상 전시 낭종 또는 병변 사이트에서 공동 형성을 받아야 쥐 반면, 이러한 공동 쥐 (13, 14)에 형성하지 않는다.
절차는 간단하고 쉽게 재현성, 신뢰성, 및 최소의 장비를 필요로한다. 그것은 쉽게 랫트 또는 마우스 연구를 수행하도록 변형 될 수있다. 특히, 다양한 유전자 변형 마우스 라인 또는 약리학 적 연구에서이 모델의 사용은 부상으로 중추 신경계 반응을 조절하는 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 병변의 크기 및 심각도는 이산 천공보다는 종 방향 기계적 병변을 생성하기 위해 블레이드를 들고 정위 아암의 블레이드와 이동 거리의 깊이를 조절함으로써 변형 될 수있다. 따라서, 전뇌 스터브 손상 모델은 우수한 experimenta 역할을 할 수와 L 플랫폼은 부상으로 다양한 신경 병리학 적 반응의 특정 측면을 연구합니다.
중추 신경계에 손상 동적 6 다세포하는 복잡한 반응을 트리거합니다. 반응성 성상 세포에 더하여, 미세 아교 세포 파편을 식균하고 Pro 및 소염 시그널링 캐스케이드 15-18 모두를 개시하는 빨리 동원. 활성화 된 미세 아교 세포와 대 식세포 침입 정상적인 세포 기능과 생존 19-21에 대한 적대적인 환경을 조성, 사이토 카인과 케모카인을 생산하고 있습니다. 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (CSPG)와 같은 세포 외 기질 (ECM) 분자는, 반응성 성상 세포와 섬유 아세포를 포함한 세포 유형의 다양한 제조 및 신경 22,23 생존 재생 구조적 재구성 적대적 환경을 만들 수있다. 여기서 우리는 전뇌의 자상 부상에 따라 발생하는 반응 astrogliosis의 주요 기능 중 일부 보여줍니다. 중간 F의 상향 조절이후 조직 리모델링 다음과 같은 GFAP, 성상 세포의 증식 및 아교 반흔 형성으로 ilaments은 쉽게 표준 면역 조직 화학 절차를 사용하여 평가됩니다.
그것은 반응성 신경교 증의 일부 기능이 여기에 강조하는 동안, 반응성 신경교 증은 다양한 기능과 특정 트리거 (24)에 따라 등장 유전자 발현 프로파일, 높은 문맥 종속되어 있음을 주목해야한다. 그럼에도 불구하고, 수리 부상과 시도로 중추 신경계 반응에 관한 기본 곳의 모델링 및 전뇌의 자상 병변 조직에서 공부하실 수 있습니다. 실제로, 반응성 성상 세포 2의 신경 속성을 보여주는, 자상 부상 CNS으로 증가 백혈구 침윤 증가 신경 변성에 이르게 전뇌 다음과 같은 반응성 성상 세포 증식의 제거를 목표로하는 것으로 나타났다. 더 최근에, 반응성 성상 세포는 관통 자상 병변, B 다음 격리UT하지 비 침습적 부상, 시험관 (25, 26)에서 신경 줄기 세포 잠재력을 보여준다. 따라서 전뇌 스터브는 CNS 손상에 의해 유발, 세포 생화학 및 분자 사건의 광범위한 연구를위한 강력한 손상 모델이다. 이 손상 모델의 쉽고 단순 상해 및 수리 메커니즘 CNS 응답에 새로운 통찰력으로 이어질 수 있습니다 추가 연구를 촉진 할 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
References
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