Protocol
Erwachsene (3-4 Monate alt) männlichen Mäusen auf eine gemischte C57BL / 6 Hintergrund wurden in diesem Protokoll verwendet. Die Tiere wurden auf einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus gehalten und freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Alle Verfahren in diesem Protokoll durchgeführt wurden nach Protokollen, die von der Drexel University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt durchgeführt.
1. Vorbereitung OP-Bereich
- Desinfizieren Sie OP-Tisch mit 70% Ethanol, dann decken die gesamte chirurgische Bank mit absorbierenden Kissen und vereinbaren chirurgische Instrumente neben stereotaktischen.
- Up stereotaktischen Gerät ohne Manipulatorarmes gesetzt. Ordnen Sie das Heizkissen auf der stereotaktischen und auf 37 ° C eingestellt. Vermeiden Sie eine Überhitzung des Tieres, indem Sie ein kleines Stück Papiertuch oder einem chirurgischen Polster zwischen dem Tier und dem Heizkissen.
- Verwendung autoklaviert Schere, geschnitten kleine Stücke autoklaviert Gelschaum in eine sterile Petrischale gegeben, die 0,9% steriler Kochsalzlösung, bis ready zum Einsatz.
Hinweis: Halten Sie sterile Arbeitsumgebung durch die Verwendung autoklaviert Instrumente und sterile OP-Bedarf. Erneute Sterilisation chirurgischer Instrumente während des Eingriffs oder zwischen Tieren durch Eintauchen in eine Perle Sterilisator für 10-15 sec, je nach Bedarf. Pflegen Sie saubere Handschuhe während des gesamten Verfahrens durch Reiben Hände mit 70% Ethanol, bei Bedarf zu desinfizieren sein.
2. Prepping Maus für Chirurgie
- Entfernen Sie Maus von zu Hause aus Käfig und wiegen (g).
- Bewegen Sie die Maus in Isofluran Induktionskammer und setzen Sauerstoff zu 2 l / min und Isofluran Verdampfer bis 5, eine chirurgische Ebene der Anästhesie, etwa 3-5 min zu induzieren. Monitor für verlangsamte Atmung und Immobilisierung. Überprüfen Sie, ob die Maus ist komplett mit der Zehe Prise Reflex sediert.
- Bei der Maus vollständig sediert wird, legen Sie in stereotaktischen Rahmen, sichern Sie die Nase in der Nasenkegel, der mit Schlauch an den Isofluran angebracht ist. Stecken Ohr Bars in den Gehörgang ein und ziehen Sie, die Gewährleistung der Kopf ist stabil.
- Rasur des Kopfes von Ohr zu Ohr, und zwischen den Augen, um hinter den Ohren.
- Sterilisieren der Haut mit abwechselnden Wischtücher aus Isopropylalkohol und Betadin Jodlösung jeweils 3 mal.
- Künstliche Tränen für beide Augen, um sie vor dem Austrocknen während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern.
3. Chirurgische Verfahren
- Überwachung der Narkosetiefe durch Kneifen der Zehe oder Schwanz. Die Maus in die entsprechende chirurgische Ebene, wenn es keine Antwort gibt, und die Atmung ist langsam und gleichmäßig.
- Machen Sie eine parasagittal Hautschnitt von gerade hinter den Augen, fast zwischen den Ohren in einer einzigen, festen Bewegung unter Verwendung eines Nr 11 Skalpellklinge. Bewegen Sie die Haut beiseite und Clip rechts mit Gefäßklemme.
- Klar Schädel des darüberliegenden Membran mit der stumpfen Seite der No. 11 Skalpell und Wattestäbchen Applikatoren. Gegebenenfalls wischen Sie die Schädel mit Wattestäbchen in 0,9% Kochsalzlösung eingetaucht. Komplett trocknen lassen.
- Unsing ein kleines Lineal, markieren Sie den vorderen Rand des Kraniotomie bei 1 mm kaudal der Kranznaht, und dem linken Rand des Kraniotomie bei 1 mm lateral der Pfeilnaht (Abbildung 1), mit einem wasserfesten Stift. Markieren das rechte und Schwanz Grenzen der Kraniotomie bei 4 mm von der sagittalen und koronalen Naht, bzw. (Abbildung 1).
- Unter Verwendung einer 0,5 mm Bohrer, beginnen, Kraniotomie durch Bohren langsam nach dem Permanentmarker Umriss zu machen. Achten Sie darauf, durch den Schädel vollständig zu brechen. Drücken Sie vorsichtig auf den isolierten Stück Scheitelbein mit No. 5 Zangen, Schwachstellen werden bis zum Druck zu geben. Wenn die ausgedünnt Knochen ist im gesamten Umfang ausreichend schwach, ist die Knochenstück zum Ausbau bereit.
HINWEIS: Wenn die Ermittler Erfahrungen Schwierigkeiten beim Entfernen der Knochen in einem Stück, bedeutet dies, dass Knochen nicht ausreichend beim Bohren ausgedünnt. Betrachten Sie weitere Bohren des Schädels in den Folge Tiere facilitate ein leichtes Entfernen des Knochenstück. - Mit einem 10-ml-Spritze mit einer 23 G-Nadel ausgestattet, eine kleine Menge von 0,9% Salzlösung, um das isolierte Knochen gebohrt und Umgebung genießen.
- Befestigen Sie den Manipulatorarm zu der stereotaktischen Geräte. Befestigen Sie eine neue Nummer 11 Skalpellklinge auf die Sondenhalter mit der scharfen Seite der Klinge gegen rostral.
HINWEIS: Obwohl die rostral und Schwanzgewebe erleben Sie die scharfen und stumpfen Kanten der Klinge bzw. ist die mechanische Beschädigung durch den durchdringenden Verletzungen induziert in der gesamten Ausdehnung der Läsion vergleichbar. Wir beobachten keine nennenswerten Unterschiede in der Hauptmerkmale der reaktiven Gliose einschließlich Hochregulation von GFAP-Expression oder Proliferation, zwischen rostralen und kaudalen Abschnitte. - Halten Sie den Manipulatorarm aus dem Weg, heben Sie die isolierten Knochen mit 5/45 abgewinkelt Pinzette. Legen Sie die Spitze der Zange in die Seite des isolierten Knochen und Lift, mit Hebelwirkung, um das Knochenstück hinter einem ful links abziehenl Bewegung.
HINWEIS: Achten Sie darauf, um das Gehirn zu erstechen oder stören die Dura unter dem Schädel. - Nehmen Sie ein kleines Stück des getränkten resorbierbare Gel-Schaum und auf den freigelegten Gehirn, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern und genießen Sie kein Blut, die vorhanden sein könnten.
- Sobald das Gel Schaum vorhanden ist, schwingen die Manipulatorarm in Stelle und passen Klinge Zentrum Kraniotomie über das Gel-Schaum. Entfernen Sie die Gel-Schaum und senken Sie die Klinge, bis die Spitze der Dura berührt, ohne Punktion der Dura. Mark dorsal / ventral Koordinaten unter Verwendung des Nonius auf der vertikalen Arm der stereotaktischen.
- Unter Verwendung des Manipulatorarmes, langsam senken die Klinge genau 3 mm in das Gehirn. Dies wird mit Hilfe der Noniusskala Markierungen auf dem Manipulatorarm erreicht. Lassen Sie Messer, um im Platz für 5-10 sec bleiben. Bewegen Sie den stereotaktischen Arm mit Blattansatz rostral bis dreimal so das Blatt, um die rostralen und kaudalen Grenzen der Kraniotomie zu erreichen, bevor er nach dem Einspruch kaudalte Ende.
HINWEIS: Die Dura wird nicht entfernt, bevor die Klinge eingesetzt wird. Im Gegensatz zur Ratten-Dura, das ist ca. 80 um Dicke 7 ist die Maus dura wesentlich dünner (nur wenige Zellschichten dick) und keinen nennenswerten Widerstand auf die Skalpellklinge während des Einsetzens erzeugen. Verwenden ein neues Skalpellklinge für jede Maus, um sicherzustellen, dass jedes Tier eine konsistente Verletzung. - Langsam heben die stereotaktischen Arm, das Entfernen der Klinge aus dem Gehirn. Nach dem Entfernen der Klinge, sofort mit einem weiteren Stück Gelschaum auf der Hirnoberfläche zu tanken überschüssige Blut oder Flüssigkeit.
- In der Zwischenzeit, entfernen Sie den stereotaktischen Arm und entsorgen Sie die No. 11 Skalpellklinge. Sobald Blutung aufgehört hat, entfernen Sie die Gelschaum.
- Schließen Sie die Wunde durch Naht der Haut mit nicht-resorbierbares Nahtmaterial, wie zum Beispiel Ethilon oder Prolene. Nähte sollten nach der Operation entfernt werden 9-10 Tage.
- Rückflug die Maus, um seinen eigenen Käfig, und lassen Sie die Maus, um langsam auf einem heatin erholeng-Pad und Monitor für jegliche Anzeichen von Leiden. Erholung von Isofluran-induzierten Anästhesie tritt normalerweise innerhalb von 2-5 min nach Entnahme aus dem Isofluran. Stellen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es sternale Festliegen wiedererlangt.
- Verabreichen 0,5-1 ml Ringer-Laktat-Lösung subkutan Hydratisierung sicherzustellen.
4. Post-OP-Pflege
- Tiere nach der Operation genau zu überwachen, bis aus der Narkose vor der Rückkehr in die Kolonie.
- Um Schmerzen und Beschwerden nach der Operation zu reduzieren, zu verwalten 0,05-0,1 mg / kg Buprenorphin durch ip-Injektion unmittelbar nach dem Eingriff.
- Beobachten Sie Tiere für 2-3 Tage nach der Operation für schwere Anzeichen von Leiden, wie beschränkt Bewegungen, mangelnde Pflege oder Gewichtsverlust. Euthanize Tieren demonstriert jede dieser Anzeichen von Leiden und von der Studie zu entfernen.
- Um Histopathologie der verletzten Gewebe zu untersuchen, einschläfern Tiere durch standard intrakardiale Perfusion.
- Kurz anästhesiert Tiere mit einer Überdosis an Ketamin / Xylazin, dann intrakardial mit 15-20 ml 0,9% NaCl perfundiert, oder bis die Leber von dem Blut eliminiert, gefolgt von 60 ml einer 4% Paraformaldehyd bei Abschluss des Experiments.
- Sezieren Gehirne und post-fix für 2-4 Stunden in 4% Paraformaldehyd vor der Übertragung auf 30% Saccharose-Lösung. Abschnitt Gehirn auf einem Kryostaten bei 40-60 um und Prozess durch histologische Standard oder immunhistochemische Verfahren, oder wie in Garcia 8,9 beschrieben.
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Representative Results
Weil Tiere unterziehen dieses Verfahren benötigen keine spezielle postoperative Pflege, kurz- oder langfristige Überlebenszeitperioden lassen sich leicht in die Studie aufgenommen, je nach Notwendigkeit, akute oder chronische Pathologie nach der Verletzung zu untersuchen. Hauptmerkmale der reaktiven Gliose, wie Hochregulation von GFAP und Hypertrophie von Soma, kann so früh wie 2-3 Tage nach der Verletzung beobachtet werden. Die Hochphase der Proliferation für reaktive Astrozyten ist während der Tage 3-5 nach der Verletzung 10. Die unten repräsentative Ergebnisse sind von Tieren, die eine Stichwunde Läsion 7 Tage früher erhalten.
Die allgemeine Morphologie und Zellarchitektur des Vorderhirns nach einer Vorderhirn Stichverletzung durch Nissl-Färbung (Abbildung 2) sichtbar gemacht werden. Obwohl die Klinge Spur ist im gesamten Zentrum der Läsion prominentesten, zeigt die gestört kortikale Zellarchitektur der rostralen und kaudalen Ausdehnung des beschädigten tAusgabe. Reaktive Astrozyten durch Immunhistochemie für GFAP (Abbildung 3) beobachtet werden. Beachten, dass viele kortikalen Astrozyten immunhistochemisch nachweisbare Mengen an GFAP in Abwesenheit von Verletzungen nicht aufweist. Jedoch GFAP-Expression drastisch in der Hemisphäre ipsilateral zur Verletzung hochreguliert, während verbleibende bei relativ geringen Konzentrationen in der kontralateralen Hemisphäre (Figur 3), was darauf hindeutet, dass reaktive Astrozyten sind dem ipsilateralen Hemisphäre beschränkt. Man beachte, dass, während das Rindengewebe ipsilateral zu der Läsion zeigt deutliche Hochregulation von GFAP andere astrocytic Marker wie S100β konstitutiv in Abwesenheit einer Verletzung (Figur 4) ausgedrückt wird, und ähnliche Expressionsspiegel nach der Verletzung (Figur 4) zu halten. Neben der erhöhten GFAP-Expression, reaktiven Astrozyten unterziehen und Zellvergrößerung. Zellkörper und Prozesse werden erweitert und zeigen intensive Färbung auf GFAP (Abbildung 3).
Die Proliferation von reaktiven Astrocyten können durch Verabreichen der Thymidin-Analogon, 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) oder durch Immunfärbung für die proliferative Marker Ki67 oder PCNA beachten. Wir routinemßig verabreichen 200 mg / kg BrdU, ip, um Tiere an den Tagen 3-5 nach der Verletzung, die Spitze der reaktiven Gliose 10 (Abbildung 3). Allerdings ist die genaue Dosierung und Zeitpunkt der BrdU sollte unabhängig für jede Studie in Betracht gezogen werden, wenn man bedenkt, dass BrdU dauerhaft Zellen, die eine Proliferation, sowie deren Nachkommen zu kennzeichnen, bei der Verwaltung, sondern, dass Zellen, die den Zellzyklus vor BrdU eingeben beginnt, oder nach BrdU Verwaltung abgeschlossen ist, wird nicht gekennzeichnet werden. In 4 zeigen wir umfangreiche Co-Lokalisation zwischen GFAP und BrdU in 1 Woche nach der Verletzung, was darauf hinweist, dass viele reaktive Astrozyten während des Zeitverlaufs von BrdU Verwaltung vermehrt. Beachten Sie, dass proliferating reaktiven Astrozyten überwiegend lokalisiert angrenzend an die Läsion Kern, während reaktive Astrozyten lokalisiert distal von der Läsion Kern weitgehend nicht proliferative (Abbildung 4).
Abb. 1: Schematische Darstellung des Maus-Schädel, der Darstellung der Bereich der Kraniotomie Blaue Linien zeigen die Anfangsmarkierungen der Grenzen des Gebiets gebohrt werden. Die oberen und linken Markierungen in 1 mm gemessen unter oder seitlich der koronaler oder sagittaler Nähte auf. Die unteren und rechten Markierungen in 4 mm vom koronalen und sagittalen Naht gemessen. Kraniotomie durch Bohren eines Kreises, in den markierten Grenzen (gestrichelte Linie), wodurch eine Kraniotomie, die ungefähr 3 mm Durchmesser (gestrichelte Linie) durchgeführt wird. Schematische nicht maßstabsgerecht ist.
Abbildung 2: Nissl-Färbung in der gesamten rostral-caudale Ausmaß der Läsion Volumens. (A - C) Im koronaren Scheiben verletzte Gehirne 1 Woche nach der Verletzung, zeigt die Hemisphäre ipsilateral zur Läsion. Einsätze zeigen in Bildern der boxed Regionen erkennen. Die Klinge Spur am deutlichsten in der Mitte der Läsion, ~ 2,5 mm vom Bregma (Pfeil B). Beachten Sie das gestört kortikale Zellarchitektur (Einlagen) in Abschnitte vordere (A) und posterioren (C) auf die Läsion entfernt. Maßstabsleiste 500 um, einfügung, 250 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: strong> Hell Immunhistochemie für GFAP 1 Woche nach einer Vorderhirn Stichverletzung. (A - B) mit niedriger Vergrößerung Bilder von GFAP-Färbung im kontralateralen (A) und ipsilateralen (B) Hemisphären des gleichen Gewebeschnitt aus einem verletzten Tier. Läsionsstelle ist in (B) gezeigt, und der entsprechende Bereich in der unverletzten kontralateralen Hemisphäre ist in (A) gezeigt ist. Maßstabsbalken, 100 um. (C - D) Hohe vergrößerte Bilder normal (C) und reaktiver (D) Astrozyten aus den kontralateralen und ipsilateralen Hemisphären sind. Beachten Sie den dramatischen Hypertrophie der Zellkörper und Prozesse von reaktiven Astrocyten in (D) im Vergleich zu (C). Maßstabsleiste, 10 & mgr; m.
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Abbildung 4: Reaktive Astrozyten vermehren sich nach einer Vorderhirn Stichverletzung. (A - B) Immunfluoreszenzfärbung für BrdU (rot) und GFAP (grün) in unverletzt, Kontrolle (A) und Verletzten (B) Gehirn, 1 Woche nach Stichverletzung. (C - D) Immunofluroescent Färbung für BrdU (rot) und die Astrozyten Marker S100β (grün) in der unverletzten (C) und Verletzten (D) Halbkugeln, 1 Woche nach Stichverletzung. Die Tiere erhielten BrdU über Tage 3-5 nach der Verletzung. Beachten Sie, dass viele Astrozyten an der Läsionsstelle im verletzten Kortex (B und D, einfügungen, Pfeilspitzen) vermehren, während Astrozyten in der unverletzten Kortex nicht proliferierenden (A und C, einfügungen). Gegenfärbung mit DAPI (blau). Maßstabsbalken, 100 & mgr; m, einfügung, 25 um.
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Discussion
Es ist kritisch, daß der Schädel oder der zugrunde liegenden Dura nicht während des Bohrens beschädigt wird. Mit leichtem Druck während des Bohrens, um den Schädel zu gewährleisten wird nicht punktiert. Außerdem sollte darauf geachtet werden, beim Anheben der Schädelteil auf die Dura zu gewährleisten ist nicht mit dem Knochen abgehoben werden.
Das Vorderhirn Stichverletzung hier beschriebenen Modelle eine durchdringende Verletzungen des ZNS. Obwohl weniger klinisch übersetzbar als TBI Modelle wie FPI oder CCI, dient das Vorderhirn stab Läsionsmodell als nützliches Werkzeug für eine breite Palette von Studien zu untersuchen verschiedene biochemische, zelluläre oder molekulare Ereignisse durch eine diskrete ZNS-Schädigung ausgelöst abzielen. Obwohl kognitive Defizite bei Ratten berichtet worden ist, 3 Wochen nach bilateraler Stichverletzung 11, es sei darauf hingewiesen, dass die einseitige stab Läsionsmodell, wie hier beschrieben ist, eignet sich besonders für Studien über die die zelluläre Antwort auf Verletzung. Fundamentalen Aspekte verschiedener neuropathologischen Prozessen, wie Wiederaktiver Gliose und Narbenbildung kann leicht beobachtet und untersucht werden. Im Gegensatz zu FPI oder CCI, die diffuse und weitverbreitete Neuropathologie, die lokalisierte Glia-Aktivierung und Pathologie zu produzieren, zu erleichtern innerTier Vergleiche zwischen den verletzten und unverletzten Hemisphären. Darüber hinaus präsentiert die Infiltration von meningealen Zellen in das ZNS an der Läsionsstelle eine Möglichkeit, um die Wechselwirkungen zwischen diesen Zellen und lokale reaktiven Astrozyten zu untersuchen. Tatsächlich sind solche Wechselwirkungen kritisch bei der Bildung von Narbengewebe, und es wurde gezeigt, um die permissive Eigenschaften reaktiver Astrocyten Regeneration von Axons 12 negativ regulieren.
Hier verwenden wir Standard immunhistochemischen Verfahren, einige der Hauptmerkmale der reaktiven Astrogliose zeigen, wie Hypertrophie der Zellkörper und Prozesse, erhöht GFAP-Expression, und Verletzungen induzierte Proliferation. Beachten Sie, dass obwohl Hohlräume nicht in Mäusen in 1-2 Wochen beobachtet folgenden dieses Verfahren, Studien mit Ratten berichten Hohlraumbildung, 3 Wochen nach der Verletzung 11. Unterschiede in der Neuropathologie von Mäusen und Ratten werden auch in Rückenmarksverletzungen beobachtet. Wohingegen Ratten, die eine Verletzung des Rückenmarks aufweisen Zysten oder Hohlraumbildung an der Läsionsstelle durchlaufen haben solche Hohlräume bilden in Mäusen 13,14.
Das Verfahren ist einfach, zuverlässig, leicht reproduzierbar und erfordert minimale Ausrüstung. Es kann leicht modifiziert werden, um Ratte oder Maus Tests durchzuführen. Insbesondere kann die Verwendung dieses Modells mit verschiedenen transgenen Mauslinien oder in pharmakologischen Studien neuartigen Einblick in die Mechanismen, die das ZNS Reaktion auf eine Verletzung zu schaffen. Läsion Größe und Schwere kann durch Einstellen der Tiefe des Blattes und der Entfernung der stereotaktischen Arm und halten Sie die Klinge, um diskrete Punktionen statt Längs mechanische Läsionen produzieren geändert werden. So kann das Vorderhirn stab Verletzungsmodell als eine ausgezeichnete Experimenta dienenl-Plattform, mit denen auf bestimmte Aspekte verschiedener neuropathologischen Reaktionen auf Verletzungen untersuchen.
Verletzung des ZNS löst eine komplexe Reaktion, die dynamisch und vielzelligen 6 ist. Neben der reaktiven Astrozyten, Mikroglia mobilisieren schnell auf Schutt phagozytieren und initiieren sowohl pro und anti-inflammatorische Signalkaskaden 15-18. Aktivierte Mikroglia und eindringenden Makrophagen produzieren Zytokine und Chemokine, die Schaffung einer feindlichen Umgebung für die normale Zellfunktion und das Überleben 19-21. Extrazellulären Matrix (ECM) -Moleküle, wie Chondroitinsulfat-Proteoglykan (CSPG), werden aus einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich reaktiven Astrozyten und Fibroblasten, und eine feindliche Umgebung für die Regeneration und strukturelle Reorganisation der überlebenden Neuronen 22,23. Hier zeigen wir einige der Hauptmerkmale der reaktiven Astrogliose, die im Anschluss an eine Vorderhirn stab Verletzungsgefahr. Hochregulation von Zwischen filaments wie GFAP, Astrozytenproliferation und Gliazellen Narbenbildung, gefolgt von der anschließenden Gewebeumbau leicht beurteilt unter Verwendung von Standardverfahren der Immunhistochemie.
Es sollte beachtet werden, dass einige Merkmale der reaktiven Gliose hier betont wird, reaktiven Gliose stark kontextabhängig, mit unterschiedlichen Eigenschaften und Genexpressionsprofile, die entstehen, von der spezifischen Auslöser 24 abhängig sein. Dennoch kann eine Reihe von grundlegenden Eigenschaften in Bezug auf die ZNS-Reaktion auf eine Verletzung und Reparaturversuche modelliert und untersucht in Vorderhirn stab verletzten Gewebes werden. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass die Ablation von proliferierenden reaktiven Astrozyten gezielt nach einer Vorderhirn Stichverletzung führt zu erhöhten Leukozyteninfiltration in das ZNS und erhöhte neuronale Degeneration und zeigt die neuroprotektiven Eigenschaften von reaktiven Astrocyten 2. In jüngerer Zeit getrennt nach einer durchdringenden stab Läsion, b reaktiven Astrozytenut nicht eine nicht-invasive Schädigung zeigen neurale Stammzellpotential in vitro 25,26. So das Vorderhirn stab ist ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung Verletzung eine breite Palette von biochemischen, zellulären und molekularen Vorgänge von Verletzungen des ZNS ausgelöst. Die Leichtigkeit und Einfachheit dieser Verletzung Modell wird weitere Studien, die neue Einblicke in die CNS Reaktion auf Verletzungen und Reparaturmechanismen führen kann, zu erleichtern.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
References
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