Protocol
Adultos (3-4 meses de edad) los ratones macho en una mixta C57BL / 6 antecedentes fueron utilizados en este protocolo. Los animales se mantuvieron en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo, y se les permite el acceso libre a comida y agua. Todos los procedimientos realizados en este protocolo se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional Universidad Drexel.
1. Preparación Área Quirúrgica
- Desinfectar mesa quirúrgica con etanol al 70%, y luego cubrir todo el banco quirúrgica con almohadillas absorbentes y organizar instrumentos quirúrgicos adyacente a estereotáxica.
- Configurar equipos estereotáxica sin brazo manipulador. Organizar la almohadilla térmica en el estereotáxica y se puso a 37 ° C. Evite el sobrecalentamiento del animal mediante la colocación de un pequeño pedazo de toalla de papel o almohadilla quirúrgica entre el animal y la resistencia de calentamiento.
- Con unas tijeras en autoclave, cortar pequeñas piezas de espuma de gel en autoclave en una placa Petri estéril que contiene solución salina al 0,9% estéril hasta ready para su uso.
Nota: Mantener entorno de trabajo estéril utilizando instrumentos autoclave y suministros quirúrgicos estériles. Re-esterilizar instrumentos quirúrgicos durante el procedimiento o en medio de animales por inmersión en un esterilizador de cuentas de 10 a 15 segundos, según sea necesario. Mantener guantes limpios durante todo el procedimiento por el roce de las manos con etanol al 70%, según sea necesario, de desinfectar.
2. Prepping ratón de Cirugía
- Retire del ratón de jaula y pesar (g).
- Coloque el ratón en la cámara de inducción isoflurano y oxígeno a establecer 2 L / min y vaporizador de isoflurano a 5 para inducir un plano quirúrgico de anestesia, aproximadamente 3-5 min. Vigile la respiración lenta e inmovilización. Compruebe que el ratón está completamente sedado utilizando el reflejo pizca dedo del pie.
- Cuando el ratón está completamente sedado, coloque en el marco estereotáxico, asegure la nariz en el cono de la nariz, que se adjunta con la tubería al isoflurano. Inserte barras de oído en el canal auditivo y ajuste, asegurando la cabeza es estable.
- Afeitarse la cabeza de oreja a oreja, y de entre los ojos de detrás de las orejas.
- Esterilizar la piel con alternancia de toallitas de alcohol isopropílico y solución de yodo betadine, 3 veces cada una.
- Aplicar lágrimas artificiales para los dos ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento quirúrgico.
3. Procedimiento Quirúrgico
- Supervisar la profundidad de la anestesia pellizcando la punta o la cola. El ratón es en el plano quirúrgico apropiado cuando no hay respuesta, y la respiración es lenta y uniforme.
- Hacer una incisión en la piel parasagital desde justo detrás de los ojos hasta casi entre las orejas en un solo movimiento firme utilizando una hoja de bisturí No. 11. Mueva la piel a un lado y el clip lado derecho con pinza hemostática.
- Claro cráneo de la membrana que recubre utilizando el lado opaco de la N º 11 bisturí y punta de algodón aplicadores. Opcionalmente, limpie el cráneo con algodón aplicador con punta sumergida en solución salina al 0,9%. Deje que se seque por completo.
- Nosotrosing una pequeña regla, marcar el borde anterior de la craneotomía en 1 mm de caudal a la sutura coronal, y el borde izquierdo de la craneotomía en 1 mm lateral a la sutura sagital (Figura 1), con un marcador permanente. A continuación, marque los bordes derecho e caudales del craneotomía en 4 mm de las suturas sagital y coronal, respectivamente (Figura 1).
- Con una broca de 0,5 mm, comenzar a hacer craneotomía perforando lentamente siguiendo el esquema marcador permanente. Asegúrese de no romper el cráneo completo. Presione suavemente en la pieza aislada del hueso parietal con el número 5 pinzas, áreas de debilidad dará paso a la presión. Cuando el hueso adelgazado es suficientemente débil en todo el perímetro, la pieza ósea está listo para el retiro.
NOTA: Si la dificultad experiencias investigador retirar el hueso en una sola pieza, esto sugiere que el hueso no se ha adelgazado lo suficiente durante la perforación. Considere la perforación del cráneo aún más en los animales posteriores a FACILITAretiro fácil te de la pieza ósea. - Usando una jeringa de 10 ml equipado con una aguja de 23 G, aplicar una pequeña cantidad de 0,9% de solución salina para empapar el hueso aislado y el área perforado.
- Fije el brazo manipulador al equipo estereotáxica. Adjunte una nueva hoja de bisturí No. 11 en el soporte de la sonda con el lado afilado de la hoja hacia rostral.
NOTA: Aunque los tejidos rostral y caudal experimentan los bordes afilados y romos de la hoja, respectivamente, el daño mecánico inducido por la lesión penetrante es comparable en toda la extensión de la lesión. Observamos diferencias apreciables en las principales características de gliosis reactiva incluyendo la regulación positiva de la expresión de GFAP o proliferación, entre las secciones rostral y caudal. - Mantener el brazo manipulador fuera del camino, levante con cuidado el hueso aislado utilizando 5/45 fórceps en ángulo. Inserte la punta de la pinza en el lado del hueso y ascensor aislado, el uso de apalancamiento de sacar el trozo de hueso dejado atrás en una full movimiento.
NOTA: Tenga cuidado de no apuñalar el cerebro o perturbar la dura debajo del cráneo. - Tome un pequeño pedazo de la espuma de gel absorbible empapado y colocarlo sobre el cerebro al descubierto para evitar que se reseque y disfrutar de sangre que pueda estar presente.
- Una vez que la espuma de gel está en su lugar, hacer pivotar el brazo manipulador en su lugar y ajustar la cuchilla hacia el centro de la craneotomía sobre la espuma de gel. Retire la espuma de gel y baje la hoja hasta que la punta toca la duramadre sin perforación de la duramadre. Marcos dorsal / ventral coordenadas utilizando la escala vernier en el brazo vertical de la estereotáxica.
- Utilizando el brazo manipulador, baje lentamente la hoja exactamente 3 mm en el cerebro. Esto se logra mediante el uso de las marcas de escala vernier en el brazo manipulador. Permita que la cuchilla para permanecer en el lugar durante 5-10 seg. Mueva el brazo estereotáxica con rostral acoplamiento a la hoja a caudal tres veces lo que permite que la hoja alcance los límites rostral y caudal de la craneotomía antes de pasar al opposite final.
NOTA: La duramadre no se elimina antes de insertar la cuchilla. En contraste con la duramadre de rata, que es de ~ 80 m de espesor 7, la duramadre ratón es considerablemente más delgada (sólo unas pocas capas de células de espesor) y no produce una resistencia apreciable a la hoja de bisturí durante la inserción. Utilice una nueva hoja de bisturí para cada ratón para asegurar que cada animal recibe una lesión consistente. - Lentamente levante el brazo estereotáxica, la eliminación de la hoja desde el cerebro. Después de la eliminación de la hoja, colocar inmediatamente otra pieza de espuma de gel en la superficie del cerebro para absorber cualquier exceso de sangre o fluido.
- Mientras tanto, retire el brazo estereotáxica y disponer de la hoja de bisturí No. 11. Una vez que el sangrado se ha detenido, quitar la espuma de gel.
- Cierre de la herida mediante sutura la piel con sutura no absorbible, tal como Ethilon o prolene. Las suturas deben ser retirados de 9-10 días después de la cirugía.
- Devuelva el ratón a su jaula, y permitir que el ratón para recuperar lentamente en un heating almohadilla y el monitor para detectar cualquier signo de malestar. Recuperación de la anestesia inducida por isofluorano-ocurre típicamente dentro de 2-5 min después de la eliminación de la isofluorano. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado recumbancy esternal.
- Administrar 0,5-1 ml de lactato por vía subcutánea solución de Ringer para asegurar la hidratación.
Cuidado 4. Post-quirúrgica
- Seguir de cerca los animales después de la operación hasta que la recuperación de la anestesia antes de regresar a la colonia.
- Para reducir el dolor y las molestias después de la operación, administrar 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección ip inmediatamente después del procedimiento.
- Observar los animales durante 2-3 días después de la operación de signos graves de angustia como los movimientos restringidos, falta de aseo, o pérdida de peso. La eutanasia a los animales que demuestran cualquiera de estos síntomas de angustia y retirar del estudio.
- Para examinar la histopatología de los tejidos lesionados, la eutanasia de animales por stanperfusión intracardiaca dard.
- Brevemente, anestesiar los animales con una sobredosis de ketamina / xilazina, a continuación, intracardially perfundido con 15-20 ml de NaCl al 0,9%, o hasta que el hígado se borra de la sangre, seguido de 60 ml de paraformaldehído al 4% en la conclusión del experimento.
- Diseccionar los cerebros y post-corrección para 2-4 h en paraformaldehído al 4% antes de ser transferido a la solución de sacarosa al 30%. Sección cerebros en un criostato de 40 a 60 micras, y el proceso mediante procedimientos histológicos o inmunohistoquímicos estándar, o como se describe en Garcia 8,9.
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Representative Results
Porque los animales sometidos a este procedimiento no requieren períodos de supervivencia especializados cuidados postoperatorios, cortos o de tiempo a largo plazo se incorporan fácilmente en el estudio, en función de la necesidad de investigar la patología aguda o crónica después de una lesión. Principales características de gliosis reactiva, como la regulación positiva de GFAP y la hipertrofia del soma, se pueden observar ya en 2-3 días después de la lesión. La fase pico de la proliferación de astrocitos reactivos es durante los días 3-5 después de la lesión 10. Los resultados representativos se muestran a continuación son de animales que recibieron una lesión de arma blanca herida 7 días antes.
La morfología general y citoarquitectura del cerebro anterior después de una lesión puñalada cerebro anterior pueden ser visualizados por tinción de Nissl (Figura 2). Aunque la pista cuchilla es más prominente a lo largo del centro de la lesión, la citoarquitectura cortical interrumpido revela el alcance rostral y caudal de la t dañadoproblema. Astrocitos reactivos se pueden observar mediante técnicas de inmunohistoquímica para GFAP (Figura 3). Tenga en cuenta que muchos astrocitos corticales no presentan niveles detectables de GFAP inmunohistoquímica en ausencia de lesión. Sin embargo, la expresión de GFAP es upregulated dramáticamente en el hemisferio ipsilateral a la lesión si bien permanece en niveles relativamente bajos en el hemisferio contralateral (Figura 3), lo que sugiere que los astrocitos reactivos están restringidas al hemisferio ipsilateral. Tenga en cuenta que mientras que el tejido cortical ipsilateral a la lesión demuestra marcada regulación positiva de GFAP, otros marcadores astrocíticos, tales como S100β se expresa constitutivamente en la ausencia de una lesión (Figura 4), y mantener los niveles de expresión similares después de la lesión (Figura 4). Además del aumento de la expresión de GFAP, astrocitos reactivos sufren hipertrofia celular. Órganos y procesos celulares se agrandan y muestran tinción intensa para GFAP (La Figura 3).
La proliferación de astrocitos reactivos pueden ser observados por la administración del análogo de la timidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), o por inmunotinción para los marcadores de proliferación Ki67 o PCNA. Rutinariamente administramos 200 mg / kg de BrdU, ip, a los animales durante el día 3-5 después de una lesión, el pico de gliosis reactiva 10 (Figura 3). Sin embargo, la dosificación precisa y el momento de BrdU deben ser considerados de forma independiente para cada estudio, teniendo en cuenta que BrdU etiquetará permanentemente las células sometidas a la proliferación, así como su progenie, en el momento de la administración, pero que las células que entran en el ciclo celular antes de BrdU comienza, o después de la administración de BrdU es completa, no va a ser marcado. En la Figura 4, se muestra extensa co-localización entre GFAP y BrdU después de la lesión en 1 semana, lo que indica que muchos astrocitos reactivos proliferaron durante el curso del tiempo de administración de BrdU. Tenga en cuenta que proliferating astrocitos reactivos se localizan predominantemente adyacente al núcleo de la lesión, mientras que los astrocitos reactivos localizados distal desde el núcleo de la lesión son en gran parte no proliferativa (Figura 4).
Figura 1:. Esquemática del cráneo del ratón, que representa el área de la craneotomía Las líneas azules representan las marcas iniciales que identifican los límites de la zona a ser perforados. Las marcas superior e izquierdo se miden a 1 mm por debajo o lateral a la sutura coronal o sagital, respectivamente. Las marcas inferior y derecho se miden a 4 mm de las suturas coronal y sagital, respectivamente. La craneotomía se lleva a cabo mediante la perforación de un círculo dentro de los límites marcados (línea de puntos), la creación de una craneotomía que es aproximadamente 3 mm de diámetro (línea discontinua). Esquema no está a escala.
Figura 2: tinción de Nissl en toda la extensión rostral-caudal del volumen de la lesión. (A - C) rebanadas coronales de cerebros lesionados 1 semana después de la lesión, que muestra el hemisferio ipsilateral a la lesión. Inserciones no mostrará a zoom en las imágenes de las regiones en caja. La pista de cuchilla es más prominente en el centro de la lesión, ~ 2,5 mm de Bregma (flecha en B). Tenga en cuenta la citoarquitectura cortical interrumpido (inserciones) en las secciones anterior (A) y posterior (C) hasta el centro de la lesión. Barra de escala 500 micras, inserción, 250 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: strong> inmunohistoquímica campo claro para GFAP 1 semana después de una lesión de arma blanca del cerebro anterior. (A - B) imágenes bajo aumento de la tinción de GFAP en el contralateral (A) y ipsilateral (B) hemisferios de la misma sección de tejido de un animal herido. El sitio de la lesión se muestra en (B), y la región correspondiente en el hemisferio contralateral ileso se muestra en (A). Barra de escala, 100 micras. (C - D) Las imágenes de alta magnificación de (D) astrocitos reactivos de los hemisferios ipsilateral y contralateral normal (C) y, respectivamente. Tenga en cuenta la dramática hipertrofia del cuerpo y los procesos de los astrocitos reactivos celular en (D), en comparación con (C). Barra de escala, 10 micras.
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Figura 4: astrocitos reactivos proliferan después de una lesión de arma blanca del cerebro anterior. (A - B) tinción de inmunofluorescencia para BrdU (rojo) y GFAP (verde) en ileso, de control (A) y (B) heridos cerebros, 1 semana después de una lesión de arma blanca. (C - D) inmunofluorescentes que la tinción de BrdU (rojo) y el marcador de astrocitos S100β (verde) en el ileso (C) y (D) heridos hemisferios, 1 semana después de una lesión de arma blanca. Los animales recibieron BrdU durante días 3-5 después de la lesión. Tenga en cuenta que muchos astrocitos están proliferando en el sitio de la lesión en la corteza lesionada (B y D, inserciones, puntas de flecha), mientras que los astrocitos en la corteza no lesionada no están proliferando (A y C, inserciones). Contratinción con DAPI (azul). Las barras de escala, 100 m, inserción, 25 micras.
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Discussion
Es fundamental que el cráneo o dura subyacente no se dañen durante la perforación. Utilice una ligera presión durante la perforación para asegurar el cráneo no está pinchado. Además, se debe tener cuidado al levantar la pieza del cráneo para asegurar la duramadre no se levanta con el hueso.
La lesión de arma blanca del cerebro anterior describe aquí los modelos de una lesión penetrante en el SNC. Aunque menos clínicamente traducible que los modelos de TBI como FPI o CCI, el modelo de lesión de arma blanca del cerebro anterior sirve como una herramienta útil para una amplia gama de estudios destinados a la investigación de varios eventos bioquímicos, celulares o moleculares desencadenados por una discreta ataque al SNC. Aunque los déficits cognitivos se han reportado en ratas, 3 semanas después de una lesión de arma blanca bilateral 11, cabe señalar que el modelo de lesión de arma blanca unilateral, como se describe aquí, es el más adecuado para los estudios que abordan la respuesta celular a la lesión. Aspectos fundamentales de diversos procesos neuropatológicos, tales como regliosis activa y la formación de cicatrices pueden ser observadas y estudiadas fácilmente. En contraste con FPI o CCI que producen neuropatología difusa y generalizada, la activación glial localizada y patología, facilitar las comparaciones intra-animales, entre los hemisferios lesionados y no lesionados. Además, la infiltración de células meníngeas en el SNC en el sitio de la lesión presenta una oportunidad para investigar las interacciones entre estas células y astrocitos reactivos locales. De hecho, tales interacciones son fundamentales en la formación de tejido cicatricial, y se ha demostrado para regular negativamente las propiedades permisivas de astrocitos reactivos a la regeneración axonal 12.
Aquí utilizamos procedimientos inmunohistoquímicos estándar para demostrar algunas de las principales características de astrogliosis reactiva tales como hipertrofia de órganos y procesos celulares, aumento de la expresión de GFAP, y la proliferación inducida por la lesión. Tenga en cuenta que aunque las cavidades no se observan en los ratones en 1-2 semanas folmugido este procedimiento, los estudios que utilizaron ratas informan formación de la cavidad, 3 semanas después de la lesión 11. Las diferencias en la neuropatología entre ratones y ratas también se observan en las lesiones de la médula espinal. Mientras que las ratas que sufren una lesión de la médula espinal quistes exhibición o formación de cavidades en el sitio de la lesión, tales cavidades no se forman en ratones 13,14.
El procedimiento es sencillo, fiable, fácilmente reproducible, y requiere un equipo mínimo. Puede ser modificado fácilmente para realizar rata o ratón estudios. En particular, el uso de este modelo con varias líneas de ratones transgénicos o en estudios farmacológicos puede dar una idea de la novela en los mecanismos que regulan la respuesta a lesiones del SNC. Tamaño de la lesión y la gravedad se pueden modificar mediante el ajuste de la profundidad de la cuchilla y la distancia de viaje del brazo estereotáxico que sostiene la hoja para producir pinchazos discretos en lugar de las lesiones mecánicas longitudinales. Por lo tanto, el modelo de lesión puñalada cerebro anterior puede servir como un excelente Experimental plataforma con la que el estudio de aspectos concretos de diversas respuestas a las lesiones neuropatológicas.
La lesión del SNC desencadena una respuesta compleja que es dinámico y multicelular 6. Además de los astrocitos reactivos, microglia movilizar rápidamente a fagocitar los restos e iniciar ambas cascadas pro y anti-inflamatorias de señalización 15-18. Microglia activada y los macrófagos invasores producen citocinas y quimiocinas, la creación de un ambiente hostil para la función celular normal y la supervivencia 19-21. La matriz (ECM) moléculas extracelulares, tales como sulfato de condroitina proteoglicano (CSPG), se producen a partir de una variedad de tipos celulares, incluyendo astrocitos reactivos y fibroblastos, y crean un ambiente hostil para la regeneración y reorganización estructural de neuronas supervivientes 22,23. Aquí nos demuestran algunas de las principales características de astrogliosis reactiva que se producen después de una lesión de arma blanca del cerebro anterior. Upregulation de f intermedioilaments como GFAP, la proliferación de astrocitos, y la formación de la cicatriz glial, seguido de la remodelación tisular posterior se evalúan fácilmente utilizando procedimientos estándar de inmunohistoquímica.
Cabe señalar que mientras que algunas de las características de gliosis reactiva se hace hincapié aquí, gliosis reactiva es altamente dependiente del contexto, con diferentes características y perfiles de expresión génica que emergen en función del disparador específico 24. Sin embargo, un número de propiedades fundamentales con respecto a la respuesta a la lesión del SNC y los intentos de reparación puede ser modelado y estudió en puñalada prosencéfalo tejido lesionado. De hecho, se ha demostrado que dirige la ablación de la proliferación de astrocitos reactivos después de una lesión del cerebro anterior puñalada conduce a un aumento de la infiltración de leucocitos en el SNC y el aumento de la degeneración neuronal, lo que demuestra las propiedades neuroprotectoras de los astrocitos reactivos 2. Más recientemente, los astrocitos reactivos aislados tras una lesión penetrante de arma blanca, but no una lesión no invasiva, demuestran el potencial de células madre neurales in vitro 25,26. Así, la puñalada cerebro anterior es un modelo de lesión de gran alcance para el estudio de una amplia gama de eventos bioquímicos, celulares y moleculares desencadenados por una lesión en el SNC. La facilidad y la sencillez de este modelo de lesión facilitarán estudios adicionales que pueden conducir a nuevos conocimientos sobre la respuesta del SNC a los mecanismos de lesión y reparación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
References
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