Protocol
成人（3-4个月）雄性小鼠的混合C57BL / 6背景是在这个协议中使用。动物保持在12小时光照/黑暗周期，并允许自由摄取食物和水。在此协议下的所有程序都按照批准的德雷克塞尔大学机构动物护理和使用委员会的协议进行的。
1.准备手术区
- 消毒手术台上，用70％的乙醇，然后覆盖整个手术台上，吸收垫，并安排手术器械相邻立体。
- 建立立体设备无机械手臂。安排上的立体定位的加热垫，并设置为37℃。避免通过将一小片纸巾或手术垫的动物和加热垫之间过热的动物。
- 使用高压灭菌剪刀，切小块蒸压明胶海绵到含有0.9％无菌盐水的溶液，直到意图的无菌培养皿DY使用。
注：使用蒸压文书和无菌手术耗材保持无菌的工作环境。在过程或在通过浸渍到珠灭菌10-15秒，可以根据需要重新消毒的手术器械的动物之间。保持干净的手套在整个过程通过摩擦的手用70％的乙醇，根据需要，进行消毒。
2.鼠标预学习外科手术
- 从家笼中取出鼠标和重量（克）。
- 鼠标放置到异氟醚诱导室，并设置氧气2升/分钟，异氟醚蒸发至5诱导麻醉手术平面，约3-5分钟。监测呼吸减慢和固定。检查鼠标使用的是脚趾捏反射完全镇静。
- 当鼠标被完全镇静，放置在立体框架，将鼻的鼻锥，其中附有油管的异氟醚。插入耳棒插入耳道，并拧紧，保证了头部是稳定的。
- 从耳刮头部的耳朵，并且从眼睛之间到耳朵后面。
- 消毒用异丙醇和优碘碘溶液，每次3倍的交替湿巾皮肤。
- 应用人工泪液来双眼，以防止它们在外科手术过程中变干。
3.手术过程
- 按捏脚趾或尾部监测麻醉深度。鼠标是在合适的手术飞机的时候没有反应，呼吸缓慢而均匀。
- 使矢状窦旁皮肤切口从刚才的眼神几乎用11号手术刀片在一个单一的，坚定的运动两耳之间的后面。移动肌肤一边夹右侧有止血。
- 覆盖膜使用11号手术刀和棉花的暗面颅骨清除涂药。或者，擦拭头骨棉签蘸0.9％生理盐水。允许完全干燥。
- 我们荷兰国际集团的小尺，标记开颅在1毫米尾椎冠状缝，和开颅在1毫米左边缘的前缘横向于矢状缝（ 图1），用一个永久性标记。然后标记开颅的右侧和尾部的边界处从矢状面和冠状缝线，分别（ 图1）4毫米。
- 使用0.5毫米钻头，开始钻慢慢继永久性标记轮廓进行开颅手术。一定不要通过头骨打破完全。轻轻按压在隔离片顶骨与5号钳，薄弱环节将让位给的压力。当薄骨是整个周长足够弱，骨片是准备拆除。
注意：如果调查的经验困难除去骨在一块，这表明骨没有充分钻孔期间变薄。考虑在随后的动物facilita进一步钻探头骨忒容易去除的骨片。 - 使用10毫升注射器配有23政针，将少量0.9％盐水浸泡分离骨和钻孔区域。
- 附加操纵臂的立体定位设备。附加一个新的第11号解剖刀刀片的探针架座具有面向吻侧刀片的锋利边。
注意：虽然喙和尾部组织遇到刀片的锋利和钝边，分别引起的穿透性损伤的机械损伤是整个病变的程度相当。我们观察到反应神经胶质增生的主要特征包括上调GFAP表达或扩散，喙和尾部部分之间没有明显的差异。 - 保持机械臂出的方式，小心抬起使用5/45角度的钳分离骨。插入镊子进入分离骨和升降机的一侧的前端，使用杠杆拉断的骨片在一个FUL留下升运动。
注意：要小心，不要刺伤大脑或干扰颅骨下方的硬脑膜。 - 取一小块浸泡吸收凝胶泡沫，并放置在裸露的大脑，以防止其干燥和吸收血液中任何可能存在的。
- 一旦凝胶泡沫就位，摆动操纵臂到位并调整刀片开颅中心在凝胶泡沫。取下凝胶泡沫，降低叶片直至尖端接触硬膜，而不刺穿硬脑膜。马克背/使用游标刻度上的立体的纵臂腹坐标。
- 使用机械臂，慢慢放下刀精确3毫米进入大脑。这是通过使用游标刻度标记上的操纵臂实现。允许刀片留在原地5-10秒。移动立体手臂插脚喙移动到opposi前尾鳍三次使刀片到达开颅手术的喙和尾部的边界TE结束。
注：硬膜之前不插入刀片拆除。与此相反的大鼠硬脑膜，这是〜80微米厚7，鼠标硬脑膜是相当薄（只有几个细胞层厚度）和插入过程中不会产生对解剖刀片的明显的阻力。使用一个新的手术刀刀片每只小鼠以确保每个动物接受了一致的损伤。 - 慢慢抬高手臂立体，去除脑部的刀片。去除叶片后，立即放在脑表面另一块明胶海绵来吸收多余的血液或体液。
- 同时，除去立体手臂和处置的第11号手术刀刀片。一旦出血停止后，取出明胶海绵。
- 通过缝合与非吸收缝线，如ethilon或普理灵皮肤闭合伤口。下列手术缝线应去掉9-10天。
- 返回鼠标其家笼，并让鼠标在加热系统缓慢复苏摹垫和监测遇险的任何迹象。回收异氟烷诱导麻醉通常去除的异氟烷后发生在2-5分钟。不要让动物无人看管，直到它已经恢复胸骨recumbancy。
- 辖0.5-1毫升乳酸林格氏液皮下的，以确保水合作用。
4.手术后护理
- 回到殖民地之前密切监测动物手术后，直到恢复从麻醉。
- 为了减轻疼痛和不适术后，管理0.05-0.1毫克/公斤丁丙诺啡腹腔注射立刻过程如下。
- 动物观察2-3天手术后遇险严重迹象，如限制运动，缺乏疏导，或体重减轻。安乐死的动物展示任何痛苦的这些迹象，并从研究中删除。
- 为了检查受伤组织的病理学，由Stan动物安乐死准心内灌注。
- 简言之，麻醉动物用氯胺酮/赛拉嗪的过量，则心内灌注15-20毫升的0.9％的NaCl，或直到肝清除血液，随后60毫升4％多聚甲醛在实验结束时。
- 转移到30％的蔗糖溶液之前，解剖的大脑和定位后2-4小时在4％多聚甲醛。或如加西亚8,9-描述部分的大脑上低温恒温器在40-60微米，并处理通过标准组织学或免疫组织化学程序。
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Representative Results
由于动物接受该方法不需要专门的术后护理，短期或长期的时间生存期很容易被纳入研究，根据不同的需要进行调查急性或慢性的病理损伤后。反应性神经胶质增生的主要功能，如GFAP和体细胞的肥大的上调，可以早在2-3天损伤后观察到的。增生的星形胶质细胞反应的高峰期是在受伤后10天3-5。如下所示的代表性的结果是从该接收一刀病变7天早期动物。
前脑的以下一个前脑刺伤的一般形态和细胞结构可以通过Nissl染色（ 图2）被可视化。虽然刀片轨道在整个病变的中心最为突出，在破坏皮质细胞结构揭示了损坏吨的喙和尾程度问题。活性星形细胞可以通过免疫组织化学对GFAP（ 图3）中观察到。请注意，许多星形胶质细胞没有表现出在没有受伤的GFAP免疫组化的检测水平。然而，GFAP的表达被显着上调的半球同侧损伤在对侧半球（ 图3）相对较低的水平，同时保持，表明活性星形细胞被限制在同侧半球。注意，虽然皮质组织同侧病变演示GFAP的显着上调，其它星形细胞标志物，如S100β被组成性表达在不存在损伤（ 图4），并保持在损伤后（ 图4）类似的表达水平。除了增加GFAP的表达，活性星形细胞进行的细胞肥大。胞体和进程成为扩大和显示强染色的GFAP（图3）。
活性星形细胞的增殖可以通过施用的胸苷类似物，5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）标记进行观察，或通过免疫染色的增殖标记Ki67的或PCNA。我们经常给予200毫克/千克的BrdU，IP，动物在3-5天以下的伤害，胶质细胞增生反应10（ 图3）的峰值。然而的BrdU的精确剂量和时间应单独考虑每个研究，铭记的BrdU将永久标记细胞进行增殖，以及它们的子代，在给药时间，但细胞进入细胞周期的BrdU前开始，或之后的BrdU管理完成后，将不被标记。在图4中 ，我们表明，GFAP和BrdU之间的广泛的共定位在后1周损伤，表明的BrdU给药时间过程中的许多活性星形细胞增生。需要注意的是PRoliferating活性星形细胞被主要定位靠近病灶核心，而活性星形细胞的局部远端从病变芯基本上非增殖（ 图4）。
图1：小鼠头盖骨的示意图，描绘了开颅的面积蓝线描绘的初始标记识别所述区域的边界待钻。顶部和左侧标记为1毫米以下，测量或横向到冠状或矢状缝，分别。在4毫米的冠状面和矢状缝线，底部和右侧的标记测量分别。开颅由钻标记边界内的圆（虚线），创造了开颅手术是大致3毫米的直径（虚线）进行。示意图不是按比例的。
图2：在整个病灶体积的喙-尾程度尼氏染色 。 （A - C）受伤的大脑冠状切片后1周损伤，表现为同侧半球的病变。插图放大描划，在盒装区域的图像。叶片轨道是在病灶的中心最为突出，〜从囟（箭头B）的 2.5毫米。请注意，打乱了皮质细胞结构（插图）的部分前（A），后（C）到病灶中心。比例尺500微米，插图，250微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： STRONG> 继前脑锐器伤明场免疫组化GFAP 1周 。 （A - B）GFAP染色对侧（A）和同侧（B）相同的组织切片的半球从受伤的动物低倍率的图像。病灶部位示于（B）中 ，并在未受伤的对侧半球的相应区域示于（A）中。比例尺，100微米。 （C - D）中分别正常（C）和从对侧和同侧半球反应（D）中星形胶质细胞，高放大率的图像。注意细胞体和反应性星形胶质细胞的过程中的戏剧性肥大（D）中 ，相对于（C）。比例尺，10微米。
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图4：无功星形胶质细胞增殖继前脑锐器伤 。 （A - B）免疫荧光染色的BrdU（红色）和GFAP（绿色）没有受伤，对照组（A）和受伤（B）的大脑，每周1次以下锐器伤。 （C - D）Immunofluroescent染色的BrdU（红色）和星形细胞标志物S100β（绿色）未受伤（C）和受伤（D）半球，1周以下锐器伤。动物接受过的BrdU 3-5天伤后。请注意，许多星形胶质细胞增殖是在病变部位在大脑皮层损伤（B和D，插图，箭头），而在未损伤皮层星形胶质细胞的增殖没有（A和C，插图）。复染用DAPI（蓝色）。比例尺为100μm，插图，25微米。
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Discussion
该颅骨或底层硬脑膜的钻井过程中不被损坏，这一点至关重要。使用轻的压力，同时钻探，以保证头骨不刺破。另外，应注意同时抬起头骨片，以确保硬脑膜不解除了与骨。
这里的前脑锐器伤描述模型穿透伤到中枢神经系统。虽然比TBI模型如FPI或CCI少临床翻译，前脑病变刺模型充当了广泛的研究，旨在通过调查离散的中枢神经系统损伤引发的各种生化，细胞，分子或事件的有用工具。虽然认知缺陷已报道的大鼠，在双边刺伤11之后，应该指出3周的单方面刺病变模型中，如这里描述的，是最适合于研究解决损伤的细胞应答。各种神经病理过程的基本方面，如重积极胶质增生和瘢痕的形成可以很容易地观察和研究。相反，FPI或CCI而产生弥漫性和广泛的神经病理学，局部神经胶质激活和病理，有利于内部的动物比较，受伤和未受伤半球之间。此外，脑膜细胞进入CNS在病变部位的浸润提供了一个机会来研究这些细胞，并局部活性星形细胞之间的相互作用。事实上，这种相互作用在瘢痕组织的形成至关重要的，并且已经显示出活性星形细胞的宽容性轴索再生12负调控。
在这里，我们使用标准的免疫程序，以演示一些反应星形胶质细胞增生的主要功能，如肥大细胞机构和流程，提高GFAP表达，损伤诱导的增殖。注意，尽管空腔小鼠在1-2周内未观察FOL降脂此过程中，使用老鼠的研究报告空洞形成，3周后的损伤11。在小鼠和大鼠神经病理学之间的差异也观察到脊髓损伤。而老鼠经过脊髓损伤展览囊肿或空洞形成在病灶部位，这样的空腔不形成在小鼠13,14。
手续简单，可靠，容易复制，并且需要最少的设备。它可以很容易地修改以执行大鼠或小鼠的研究。特别是，使用这种模式与各种转基因小鼠系或在药理学研究可以提供新颖的洞察调节中枢神经系统损伤反应的机制。病变大小和严重性可以通过调整立体臂保持叶片，以产生离散的穿刺而不是纵向的机械损伤的叶片和移动距离的深度进行修改。因此，前脑刺损伤模型可以作为优良experimenta升平台来研究各种病理反应特定方面的伤害。
损伤的中枢神经系统触发一个复杂的反应，是动态的，多细胞6。除了 活性星形细胞，小胶质细胞动员迅速吞噬碎片和发起既亲和抗炎信号级联15-18。激活小胶质细胞和巨噬细胞侵入产生细胞因子和趋化因子，从而为正常细胞的功能和存活19-21一个充满敌意的环境。细胞外基质（ECM）分子，如硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG），由各种细胞类型中，包括反应性星形胶质细胞和成纤维细胞的产生，并创造存活的神经元22,23的再生和结构重组一个恶劣的环境。在这里，我们展示了一些反应的星形胶质细胞增生之后发生前脑锐器伤的主要特征。中间体F上调ilaments如GFAP，星形胶质细胞增殖和胶质瘢痕的形成，接着进行组织重构使用标准免疫组化方法很容易评估。
应当指出，虽然反应性神经胶质增生的某些特征在这里强调，反应性神经胶质增生是高度依赖于环境，具有不同的特性，并且冒出取决于具体触发器24基因的表达谱。尽管如此，一些有关的中枢神经系统损伤反应，并尝试修复基本属性可以建模和研究脑损伤刺伤组织中。事实上，已经显示以下一个前脑刺伤导致增加白细胞浸润到CNS和增加的神经元变性，有针对性增殖活性星形细胞的消融，表明活性星形细胞2的神经保护性质。最近，星形胶质细胞反应后分离穿透病变刺，BUT不是一种非侵入性损伤，表明在体外 25,26神经干细胞的潜力。因此，前脑刺是一个功能强大的损伤模型为研究范围广泛的损伤至CNS触发生物化学，细胞和分子事件。这种损伤模型的便利性和简易性将有助于进一步研究，可导致新的见解进入CNS响应损伤和修复机制。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
References
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