Protocol
למבוגרים עכברים (ישנים 3-4 חודשים) גבריים על C57BL / 6 רקע מעורב שמשו בפרוטוקול זה. בעלי חיים הוחזקו בשעתי אור 12 / מחזור כהה, ואפשרו גישה חופשית למזון ומים. כל הפרוצדורות שבוצעו בפרוטוקול זה נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת דרקסל האוניברסיטה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש.
1. הכנת אזור ניתוח
- לחטא שולחן כירורגית עם 70% אתנול, ואז לכסות את הספסל כירורגית כל עם רפידות סופגים ולארגן מכשירי ניתוח בסמוך לstereotaxic.
- הגדר את ציוד stereotaxic ללא זרוע מניפולטור. מסדרים את כרית החימום על stereotaxic ומוגדר 37 מעלות צלזיוס. למנוע התחממות יתר של בעלי החיים על ידי הצבת חתיכה קטנה של נייר מגבת או כרית כירורגית בין בעלי החיים וכרית החימום.
- בעזרת המספריים autoclaved, לחתוך לחתיכות קטנות של gelfoam autoclaved לתוך צלחת פטרי המכילה סטרילי תמיסת מלח 0.9% סטרילי עד Ready לשימוש.
הערה: לשמור על סביבת עבודה סטרילית ידי שימוש במכשירי autoclaved ואספקת ניתוח סטרילי. מחדש לעקר מכשירי ניתוח במהלך ההליך או בבעלי החיים בין על ידי טבילה למעקר חרוז במשך 10-15 שניות, בהתאם לצורך. לשמור על כפפות נקיות לאורך כל ההליך על ידי שפשוף ידיים עם 70% אתנול, במידת צורך, כדי לחטא.
2. prepping עכבר לכירורגיה
- הסר עכבר מכלוב בבית ולשקול (ז).
- עכבר מקום לתא אינדוקציה isoflurane וחמצן מוגדר 2 ליטר / דקה ומאדה isoflurane עד 5 כדי לגרום למטוס של הרדמה כירורגית, כ 3-5 דקות. לפקח על נשימה וחוסר תנועה מואטת. בדוק שהעכבר מסומם באופן מלא באמצעות רפלקס קמצוץ הבוהן.
- כאשר עכבר מסומם לחלוטין, למקם במסגרת stereotaxic, לאבטח את האף בחרטום, אשר מצורף עם צינורות לisoflurane. הכנס ברים אוזן לתוך תעלת אוזן ולהדק, הבטחת הראש היא יציבה.
- לגלח את ראשך מאוזן לאוזן, ומבין העיניים למאחורי האוזניים.
- לעקר את העור עם מגבונים לסירוגין של אלכוהול איזופרופיל ותמיסת יוד בטאדין, 3 פעמים כל אחד.
- החל דמעות מלאכותיות לשתי העיניים כדי למנוע מהם מהתייבשות במהלך ההליך הכירורגי.
3. נוהל כירורגי
- צג עומק ההרדמה על ידי צובט את הבוהן או זנב. העכבר הוא במישור הניתוחי המתאים כאשר אין תגובה, והנשימה איטית ואפילו.
- לעשות חתך בעור parasagittal מרק מאחורי העיניים לכמעט בין האוזניים בתנועה אחת, חברה אחת באמצעות סכין אזמל מס '11. הזז עור בצד וקליפ צד ימין עם hemostat.
- גולגולת ברורה של קרום שמעליה באמצעות הצד הקהה של אזמל מס '11 וכותנה הטתה applicators. לחלופין, למחוק את הגולגולת עם מוליך כותנה שקצהו טבול בשיעור של 0.9% תמיסת מלח. לאפשר לו להתייבש לחלוטין.
- שלנוing שליט קטן, לסמן את הגבול הקדמי של פתיחת הגולגולת בזנב 1 מ"מ לתפר העטרה, והקצה השמאלי של פתיחת הגולגולת ליום 1 במ"מ לרוחב תפר sagittal (איור 1), עם סמן קבע. לאחר מכן לסמן את הזכות וגבולות הזנב של פתיחת הגולגולת ב 4 מ"מ מתפרי sagittal ו עטרה, בהתאמה (איור 1).
- באמצעות מקדח 0.5 מ"מ, מתחיל לעשות craniotomy על ידי קידוח לאט הבא המתווה סמן הקבועה. הקפד שלא לפרוץ את הגולגולת לחלוטין. לחץ בעדינות על פיסת העצם הקודקודית עם מס '5 מלקחיים המבודדים, אזורים של חולשה ייתן דרך הלחץ. כאשר העצם דליל חלש מספיק לאורך ההיקף, חתיכת העצם מוכנה להסרת.
הערה: אם קושי חוויות חוקר הסרת העצם בחתיכה אחת, זה מצביע על כך שהעצם לא היה דליל מספיק במהלך קידוח. שקול קידוח הגולגולת נוספת בבעלי חיים לאחר facilitaהסרה קלה te של חתיכת העצם. - באמצעות מצויד במחט G 23 מזרק 10 מיליליטר, למרוח כמות קטנה של תמיסת מלח 0.9% להשרות את העצם המבודד ואזור שנקדח.
- צרף את זרוע מניפולטור לציוד stereotaxic. צרף להב סכין מנתחים מס '11 חדש לבעל הבדיקה עם הצד החד של הלהב מול rostrally.
הערה: למרות שהרקמות מקורי ואת הזנב לחוות את הקצוות החדים ובוטים של הלהב, בהתאמה, הנזק המכני הנגרם על ידי הפציעה החודרת דומה בכל רחבי היקף הנגע. אנו צופים אין הבדלים משמעותיים במאפיינים עיקריים של דבק תגובה כוללים upregulation ביטוי GFAP או הפצה, בין חלקים מקורי ואת הזנב. - שמירת מהדרך זרוע מניפולטור, להרים בזהירות את העצם המבודד באמצעות 5/45 מלקחיים זווית. הכנס את קצה המלקחיים לצד של העצם והרמה המבודדים, שימוש במינוף למשוך את פיסת העצם שנשארה באחד פולתנועת l.
הערה: היזהר שלא לדקור את המוח או להפריע הדורה מתחת לגולגולת. - קח חתיכה קטנה של קצף ג'ל נספג הספוג ומניח על המוח החשוף כדי למנוע ממנו להתייבש ולספוג את כל דם שעלולה להיות נוכח.
- ברגע שקצף ג'ל הוא במקום, הנדנדה זרוע מניפולטור למקום ולהב להסתגל למרכז craniotomy מעל קצף ג'ל. הסר את קצף ג'ל ולהוריד את הלהב עד הקצה נוגע הדורה ללא ניקוב הדורה. מארק גב / קואורדינטות הגחון תוך שימוש בסולם ורניה על הזרוע האנכית של stereotaxic.
- באמצעות זרוע מניפולטור, לאט לאט להוריד את הלהב 3 מ"מ בדיוק לתוך המוח. זו מושגת על ידי שימוש בסימונים בקנה מידה ורניה על זרוע מניפולטור. לאפשר להב להישאר במקום במשך 5-10 שניות. הזז את זרוע stereotaxic עם קובץ מצורף מקורי להב הזנב שלוש פעמים מאפשרות את הלהב כדי להגיע לגבולות מקורי ואת הזנב של פתיחת הגולגולת, לפני שעברתי לopposiסוף te.
הערה: הדורה לא יוסר לפני החדרת הלהב. בניגוד לדורת החולדה, שהוא ~ 80 מיקרומטר בעובי 7, הדורה העכבר היא משמעותי יותר רזה (רק כמה שכבות תאים עבים) ולא לייצר התנגדות ניכרת ללהב סכין המנתחים בכניסה. השתמש בלהב סכין מנתחים חדש עבור כל עכבר כדי להבטיח שכל חיה מקבלת פגיעה עקבית. - לאט לאט להעלות את זרוע stereotaxic, הסרת הלהב מהמוח. לאחר ההסרה של הלהב, מקום מייד חתיכת gelfoam אחרת על פני השטח של המוח כדי לספוג את כל דם או נוזלים עודפים.
- בינתיים, להסיר את זרוע stereotaxic ולהשליך את להב סכין המנתחים מס '11. ברגע שהדימום נפסק, להסיר את gelfoam.
- לסגור את הפצע על ידי תפירת העור עם תפר שאינו נספג, כגון ethilon או prolene. תפרים יש להסיר 9-10 ימים לאחר ניתוח.
- החזר את העכבר לכלוב בבית שלה, ולאפשר העכבר כדי להתאושש לאט על חימוםכרית גרם ולפקח על כל סימני מצוקה. התאוששות מהרדמה מושרה isofluorane מתרחשת בדרך כלל בתוך 2-5 דקות לאחר ההסרה מisofluorane. אל תשאירו את בעלי החיים ללא השגחה עד שהוא חזר recumbancy sternal.
- לנהל 0.5-1 מיליליטר של תת עורי תמיסה הרטמן כדי להבטיח לחות.
טיפול 4. לאחר ניתוח
- באופן הדוק לפקח בעלי חיים שלאחר ניתוח עד להחלמה מהרדמה לפני ההחזרה למושבה.
- כדי להפחית את הכאב ואי נוחות לאחר ניתוח, לנהל 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות על ידי הזרקת IP ביצוע ההליך באופן מיידי.
- תצפיות על בעלי חיים במשך 2-3 ימים לאחר ניתוח לסימני מצוקה קשים כגון תנועות מוגבלות, חוסר הטיפוח, או ירידה במשקל. להרדים בעלי חיים מפגינים כל סימני מצוקה אלה ולהסיר מהמחקר.
- כדי לבחון histopathology של רקמות פצועות, להרדים בעלי חיים על ידי סטןזלוף intracardial dard.
- בקצרה, להרדים חיות עם מנת יתר של קטמין / xylazine, אז perfused intracardially עם 15-20 מיליליטר של 0.9% NaCl, או עד שהכבד מתנקה מדם, ואחריו 60 מיליליטר של paraformaldehyde 4% בסיומו של הניסוי.
- לנתח את מוח ולאחר תיקון-2-4 שעות בparaformaldehyde 4% לפני העברה לתמיסת סוכרוז 30%. מוח סעיף על cryostat ב40-60 מיקרומטר, ותהליך על ידי נהלים היסטולוגית או immunohistochemical סטנדרטיים, או כפי שמתואר בגרסיה 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בגלל בעלי חיים שעברו הליך זה אינו דורשים תקופות הישרדות מיוחדות טיפול שלאחר ניתוח, קצרות או זמן ארוך טווח משולבים בקלות לתוך המחקר, בהתאם לצורך לחקור פתולוגיה אקוטית או כרונית בעקבות פציעה. תכונות עיקריות של דבק תגובתי, כגון גברת ביטוי של GFAP והיפרטרופיה של סומה, ניתן להבחין כבר ב2-3 ימים בעקבות פציעה. שלב השיא של התפשטות להאסטרוציטים תגובתי הוא בימים 3-5 בעקבות פציעה 10. תוצאות הנציג שמוצגים להלן הן מבעלי החיים שקיבלו נגע דקירת פצע 7 ימים קודם לכן.
המורפולוגיה הכללית וcytoarchitecture של המוח הקדמי הבא פציעת דקירת המוח הקדמי ניתן דמיינו ידי מכתים Nissl (איור 2). למרות שמסלול הלהב הוא בולט ביותר בכל המרכז של הנגע, cytoarchitecture קליפת המוח שיבש חושף את המידה מקורי ואת הזנב של T הפגוםנושא. ניתן לצפות האסטרוציטים תגובה על ידי אימונוהיסטוכימיה לGFAP (איור 3). שים לב שהרבה האסטרוציטים בקליפת המוח אינם מציגים רמות immunohistochemically זיהוי של GFAP בהעדר פציעה. עם זאת, ביטוי GFAP הוא שהוגברו באופן דרמטי בחצי הכדור ipsilateral לפציעה בזמן שנותרו ברמות נמוכות יחסית בחצי הכדור הנגדי (איור 3), המצביע על כך האסטרוציטים תגובה מוגבלים לחץ כדור ipsilateral. שימו לב שבזמן שipsilateral רקמת קליפת המוח לנגע מדגימה upregulation המסומן של GFAP, סמני astrocytic אחרים, כגון S100β לידי ביטוי constitutively בהעדר פציעה (איור 4), ולשמור על רמות ביטוי דומות בעקבות פציעה (איור 4). בנוסף לביטוי GFAP המוגבר, האסטרוציטים תגובתי לעבור היפרטרופיה סלולרית. גופי תא ותהליכים להיות מוגדלים ולהראות צביעה אינטנסיבית לGFAP (איור 3).
ההתפשטות של האסטרוציטים תגובה יכולה להיות שנצפתה על ידי מתן האנלוגי תימידין, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), או על ידי immunostaining לסמני שגשוג Ki67 או PCNA. אנחנו באופן שיגרתי לנהל 200 מ"ג / קילוגרם IP BrdU,, לבעלי חיים בימים 3-5 פציעה הבאה, השיא של דבק תגובתי 10 (איור 3). עם זאת המינון והתזמון המדויקים של BrdU יש לשקול באופן עצמאי לכל מחקר, בשים הלב כי BrdU לצמיתות תווית תאים עוברים שגשוג, כמו גם צאצאיהם, בזמן של ממשל, אבל זה תאים שנכנסים מחזור התא לפני BrdU מתחיל, או לאחר מתן BrdU הוא מלא, לא יהיה מסומן. באיור 4, אנו מציגים שיתוף לוקליזציה נרחבת בין GFAP וBrdU בשבוע שלאחר פציעה 1, מצביע על כך שרבים האסטרוציטים תגובה התרבו במהלך ממשל BrdU הזמן. שים לב שיחסי הציבור האסטרוציטים תגובת oliferating בעיקר הם מקומיים סמוכים לליבת הנגע, ואילו האסטרוציטים תגובה מקומיים דיסטלי מליבת הנגע הם במידה רבה בלתי שגשוג (איור 4).
איור 1:. סכמטי של גולגולת העכבר, המתאר את האזור של פתיחת גולגולת קווים כחולים מתארים את הסימנים הראשוניים זיהוי הגבולות של האזור לקידוח. הציונים הגבוהים ביותר והשאירו נמדדים לפי 1 מ"מ מתחת או לרוחב לתפרי עטרה או sagittal, בהתאמה. הסימנים התחתון ונכונים נמדדים לפי 4 מ"מ מתפרי העטרה ועל sagittal, בהתאמה. פתיחת הגולגולת מבוצעת על ידי קידוח מעגל בתוך הגבולות המסומנים (קו מקווקו), יצירת craniotomy שהוא בערך 3 מ"מ קוטר (קו מקווקו). סכמטי הוא לא בקנה מידה.
"תמיד"> 
איור 2: מכתים Nissl בכל המידה מקורי, הזנב של נפח הנגעים. (- C) פרוסות העטרה של מוח נפגע לאחר פציעה 1 שבוע, מראה את ipsilateral חצי הכדור לנגע. ריבועי מתארים מוגדלת בתמונות של האזורים התאגרפו. מסלול הלהב הוא בולט ביותר במרכז הנגע, ~ 2.5 מ"מ מגבחת (חץ בבוקר). הערה cytoarchitecture שיבש בקליפת המוח (ריבועי) בחלקים קדמי () והאחורי (ג) למרכז הנגע. בר סולם 500 מיקרומטר, הבלעה, 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: strong> אימונוהיסטוכימיה Brightfield לשבוע הבא GFAP 1 פציעת דקירת המוח הקדמי. (- B) תמונות בהגדלה נמוכה של מכתים GFAP בנגדי () וipsilateral (ב) ההמיספרות של אותו קטע הרקמה מחיה פצועה. אתר הנגע מוצג ב( ב '), ובאזור המקביל בחצי הכדור הנגדי וללא כל הפגע מוצג ב(). בר סולם, 100 מיקרומטר. (C - D) תמונות בהגדלה גבוהות של רגיל (C) והאסטרוציטים תגובתי (ד ') מהאונות נגדי וipsilateral, בהתאמה. שים לב להיפרטרופיה הדרמטית של גוף התא ותהליכים של astrocyte תגובה ב( ד '), בהשוואה ל( C). בר סולם, 10 מיקרומטר.
825 / 52825fig4.jpg "/>
איור 4: האסטרוציטים ריאקטיבי להתרבות הבאים פציעת דקירת המוח הקדמי. (- B) מכתים Immunofluorescent לBrdU (אדום) וGFAP (ירוק) ובללא כל פגע, שליטה (א) ומוח נפגע (ב), בשבוע הבא פציעת דקירת 1. (C - D) Immunofluroescent צביעה לBrdU (אדום) וסמן astrocytic S100β (ירוק) בללא פגע (C) וחצי נפצעו (ד '), בשבוע הבא פציעת דקירת 1. בעלי חיים קיבלו BrdU על ימים 3-5 לאחר פציעה. שים לב שהאסטרוציטים רבים מתרבים באתר הנגע בקליפה הפצועה (B ו- D, ריבועי, ראשי חץ), ואילו האסטרוציטים בקליפה וללא כל הפגע לא מתרבים (A ו- C, ריבועי). Counterstaining עם DAPI (כחול). ברים סולם, 100 מיקרומטר, הבלעה, 25 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה קריטי, כי הגולגולת או דורה שבבסיסם לא ניזוקו במהלך הקידוח. השתמש לחץ קל בעת קידוח על מנת להבטיח את הגולגולת לא ניקב. בנוסף, יש להקפיד בעת הרמת חתיכת הגולגולת כדי להבטיח את הדורה לא המריא עם העצם.
פציעת דקירת המוח הקדמי מתוארת כאן דגמי פציעה חודרת למערכת העצבים המרכזית. אם כי פחות מבחינה קלינית לתרגום מאשר דגמי TBI כגון FPI או CCI, מודל נגע דקירת המוח הקדמי משמש ככלי שימושי למגוון רחב של מחקרים שנועדו לבחון אירועים ביוכימיים, סלולריים, או מולקולריים שונים מופעלים על ידי מערכת העצבים המרכזית עלבון בדיד. למרות ליקויים קוגניטיביים דווחו בחולדות, 3 שבועות לאחר פציעת דקירה דו צדדית 11, יש לציין כי מודל נגע הדקירה החד-צדדי, כפי שמתואר כאן, הוא מתאים ביותר ללימודי טיפול בתגובה התאית לפציעה. היבטים בסיסיים של תהליכי נוירו שונים, כגון מחדשדבק פעיל והיווצרות צלקת ניתן להבחין בקלות ולמדו. בניגוד לFPI או CCI אשר מייצר נוירופתולוגיה מפוזרת ונפוצה, הפעלת גליה מקומית ופתולוגיה, לאפשר השוואת פנים-בעלי חיים, בין ההמיספרות נפצעו וללא פגע. בנוסף, החדירה של תאי קרום המוח למערכת העצבים המרכזיים באתר הנגע מהווה הזדמנות לחקור את יחסי הגומלין בין תאים אלה והאסטרוציטים תגובה מקומיים. ואכן, אינטראקציות כאלה הן קריטיות בהיווצרות של רקמת צלקת, וכבר הוכיחו להסדיר לרעה את המאפיינים מתירנית של האסטרוציטים תגובה להתחדשות axonal 12.
כאן אנו משתמשים נהלי immunohistochemical סטנדרטיים כדי להדגים כמה מהתכונות העיקריות של astrogliosis תגובתי כגון היפרטרופיה של גופי תא ותהליכים, ביטוי GFAP מוגבר, וריבוי הנגרם פציעה. שים לב שלמרות שהחללים לא נצפו בעכברים ב1-2 שבועות folגעייה הליך זה, מחקרים באמצעות חולדות לדווח היווצרות חלל, 3 שבועות הבאים הפציעה 11. הבדלים בנוירופתולוגיה בין עכברים וחולדות הם נצפו גם בפגיעות בעמוד השדרה. ואילו חולדות שעוברות ציסטות השדרה פגיעה בחוט תערוכה או היווצרות חלל באתר הנגע, חללים כאלה לא יוצרים בעכברי 13,14.
ההליך הוא פשוט, אמין, לשחזור בקלות, ודורש ציוד מינימאלי. ניתן לשנות אותו בקלות לבצע מחקרי חולדה או עכבר. בפרט, שימוש במודל זה עם קווי עכבר מהונדסים שונים או במחקרים פרמקולוגיים יכול לספק תובנה רומן למנגנונים המסדירים את מערכת העצבים המרכזית התגובה לפציעה. גודל נגע וחומרה יכולים להיות שונה על ידי התאמת עומק מרחק הלהב והנסיעות של זרוע stereotaxic מחזיקה הלהב לייצר דקירות דיסקרטיות ולא נגעים מכאניים אורך. לפיכך, מודל פציעת דקירת המוח הקדמי יכול לשמש Experimenta מצויןפלטפורמת l שבי ללמוד היבטים ספציפיים של תגובות נוירו השונות לפציעה.
פגיעה במערכת העצבים המרכזיים גורמת לתגובה מורכבת שהיא דינמי ורב-תאי 6. בנוסף להאסטרוציטים תגובה, מיקרוגלים לגייס במהירות לphagocytose פסולת וליזום שני מפלי איתות פרו ואנטי דלקתיים 15-18. מיקרוגלים הופעל ומקרופאגים הפולשים לייצר ציטוקינים וכמוקינים, יצירת סביבה עוינת לתפקוד תא רגיל והישרדות 19-21. מולקולות תאי מטריקס (ECM), כגון פרוטאו כונדרואיטין סולפט (CSPG), מיוצרות ממגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאים כוכביים ופיברובלסטים תגובה, וליצור סביבה עוינת להתחדשות ושינוי הארגוני לשרוד נוירונים 22,23. כאן אנו מדגימים כמה מהתכונות העיקריות של astrogliosis תגובה המתרחשות בעקבות פציעת דקירת המוח הקדמי. גברת ביטוי של F בינייםilaments כגון GFAP, התפשטות astrocyte, והיווצרות צלקת גליה, ואחרי שיפוץ רקמות שלאחר מכן הם בקלות הוערך באמצעות נהלי אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים.
יש לציין כי בעוד כמה תכונות של דבק תגובה מודגשות כאן, דבק תגובתי הוא מאוד תלוי בהקשר, עם תכונות שונות ופרופילי ביטוי גנים העולים בהתאם ההדק הספציפי 24. עם זאת, מספר התכונות הבסיסיות בנוגע לתגובה של מערכת העצבים המרכזית לפגיעה וניסיונות תיקון יכול להיות מודל ולמד ברקמת lesioned דקירת המוח הקדמי. ואכן, זה כבר הראה כי ממוקד אבלציה של מתרבים האסטרוציטים תגובה הבאה המוח הקדמי פציעת דקירה מובילה לחדירה מוגברת לויקוציטים למערכת העצבים המרכזית וניוון עצבי מוגבר, הממחיש את תכונות הגנה העצביות של האסטרוציטים תגובה 2. לאחרונה, האסטרוציטים תגובה מבודדים הבאים חודר נגע דקירה, בלא פציעה לא פולשנית ut, להפגין פוטנציאל של תאי גזע עצבי במבחנה 25,26. כך דקירת המוח הקדמי הוא מודל פציעה רב עוצמה ללימוד מגוון רחב של אירועים ביוכימיים, סלולריים, ומולקולריים מופעלים על ידי פגיעה במערכת העצבים המרכזית. הקלות והפשטות של מודל פציעה זה יקל מחקרים נוספים שיכול להוביל לתובנות רומן לתגובה של מערכת העצבים המרכזית למנגנוני פציעה ותיקון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| High speed micro drill | Harvard Apparatus | 724950 | |
| stainless steel scalpel blade, #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anti-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:1,000 (fluorescence) |
| Shp anti-BrdU | Abcam | ab1893 | Dilution - 1:20,000 (bright-field); 1:500 (fluorescence) |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Biotinylated rabbit anti-sheep | Vector Laboratories | BA-6000 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A-11008 | Dilution - 1:400 (bright-field) |
| Alexafluor 568 donkey anti-sheep | Life Technologies | A-21099 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Life Technologies | D3571 | Dilution - 1:1,000 (fluorescence) |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042-10G | Dilution - 1% (bright-field) |
References
- Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders. Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).
- Bush, T. G., et al. Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice. Neuron. 23 (2), 297-308 (1999).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Okada, S., et al. Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury. Nature Medicine. 12 (7), 829-834 (2006).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes during Adaptive Immune Inflammation of the CNS. Journal of Neuroscience. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive Gliosis and the Multicellular Response to CNS Damage and Disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
- Maikos, J. T., Elias, R. A., Shreiber, D. I. Mechanical properties of dura mater from the rat brain and spinal cord. Journal of neurotrauma. 25 (1), 38-51 (2008).
- Garcia, A. D., Doan, N. B., Imura, T., Bush, T. G., Sofroniew, M. V. GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain. Nat Neurosci. 7 (11), 1233-1241 (2004).
- Garcia, A. D., Petrova, R., Eng, L., Joyner, A. L. Sonic hedgehog regulates discrete populations of astrocytes in the adult mouse forebrain. J Neurosci. 30 (41), 13597-13608 (2010).
- Amat, J. A., Ishiguro, H., Nakamura, K., Norton, W. T. Phenotypic diversity and kinetics of proliferating microglia and astrocytes following cortical stab wounds. Glia. 16 (4), 368-382 (1996).
- Hozumi, I., et al. Administration of prosaposin ameliorates spatial learning disturbance and reduces cavity formation following stab wounds in rat brain. Neuroscience letters. 267 (1), 73-76 (1999).
- Ness, R., David, S. Leptomeningeal cells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro. Glia. 19 (1), 47-57 (1997).
- Byrnes, K. R., Fricke, S. T., Faden, A. I. Neuropathological differences between rats and mice after spinal cord injury. Journal of magnetic resonance imaging : JMRI. 32 (4), 836-846 (2010).
- Steward, O., et al. Genetic approaches to neurotrauma research: opportunities and potential pitfalls of murine models. Experimental neurology. 157 (1), 19-42 (1999).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Hanisch, U. -K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2008).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another Barrier to Regeneration in the CNS: Activated Macrophages Induce Extensive Retraction of Dystrophic Axons through Direct Physical Interactions. Journal of Neuroscience. 28 (38), 9330-9341 (2008).
- Ip, C. W. Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes. Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).
- Perry, V. H. Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration. Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).
- McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).
- Silver, J., Miller, J. H.
- Zamanian, J. L., et al.
- Buffo, A., et al. Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected]. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
