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Immunology and Infection

अमर छाँटे बी कोशिकाओं से पुनः संयोजक मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का सृजन

Published: June 5, 2015 doi: 10.3791/52830
Automatic Translation
*1,2, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1School for Mental Health and Neuroscience, Maastricht University, 2Department of Neurosciences, Institut d'Investigació Germans Trias i Pujol
* These authors contributed equally

Introduction

इस अनुच्छेद के लक्ष्य में विस्तार से पैदा करते हैं और मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से प्राप्त मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी चिह्नित करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करने के लिए है।

मानव एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए ब्याज अनुसंधान के कई अलग अलग क्षेत्रों में वृद्धि हुई है। विशेष रूप से, कई अनुसंधान समूहों ऑटो एंटीबॉडी 1-3 की वजह से विकृति विज्ञान में रुचि रखते हैं। हम क्लोन और रोगजनक ऑटो एंटीबॉडी 1 विशेषता है। ऑटो एंटीबॉडी के अध्ययन प्रतियोगी एंटीबॉडी 4 का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, अपने लक्ष्य की पहचान करने और चिकित्सीय रणनीति विकसित करने में मदद कर सकते हैं। इसके अलावा, मानव एंटीबॉडी के अध्ययन में यह भी टीकाकरण 5 के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए संपर्क में है और विशिष्ट रोगजनक 6 या अध्ययन करने के लिए प्रतिरोधी बन गया है कि व्यक्तियों के एंटीबॉडी प्रोफाइल चिह्नित करने के लिए, यानी अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों में ब्याज की हो सकती है, जो एंटीबॉडी में हैंप्राकृतिक प्रदर्शनों की सूची 7,12।

कई तकनीकों पुनः संयोजक मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 8-12 उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है; इनमें से सबसे फेज प्रदर्शन और बी सेल अमरता का उपयोग करें। फेज प्रदर्शन का उपयोग बड़े पैमाने पर नई एंटीबॉडी 13 की खोज के लिए लागू किया गया है। हालांकि यह बन मानव इम्युनोग्लोबुलिन की भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़े प्रक्रिया में अलग नाम से है कि, एक बड़ा नुकसान है। मानव बी कोशिकाओं या EBV के परिवर्तन के साथ हाइब्रिडोमास का उत्पादन इस खामी पर काबू।

हम टोल की तरह रिसेप्टर 9 (TLR-9) 6,12 के माध्यम से पॉलीक्लोनल बी सेल उत्तेजना के साथ संयोजन में EBV के साथ Thymic बी कोशिकाओं के संक्रमण का उपयोग करें।

इस पत्र में, हम विस्तार में हम इन विट्रो एंटीबॉडी पीढ़ी के लिए PBMC अलगाव से सभी चरणों की एक पूरी सिंहावलोकन के साथ, आईजीजी मानव एंटीबॉडी के विकास के लिए उपयोग करें कि प्रौद्योगिकी का वर्णन है। इसप्रोटोकॉल मानव आईजीजी प्रोफाइल के किसी भी प्रकार के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, आईजीजी उत्पादन बी कोशिकाओं को सफलतापूर्वक छंटाई के बाद PBMCs के बाकी हिस्सों से अलग हो गया है। पचास के अनुसार क्रमबद्ध बी कोशिकाओं 8 तब बहु अच्छी तरह प्लेटें में चढ़ाया और एकल बी कोशिकाओं की क्लोनल विस्तार के लिए, EBV और TLR-9 सक्रियण द्वारा अमर जा सकता है। फीडर कोशिकाओं के रूप में, मानव भ्रूण फेफड़े के ऊतकों से fibroblasts, अमर बी कोशिकाओं के दृश्य की सुविधा है, जो सेल लाइन wi38, इस्तेमाल किया गया है। इन बी कोशिकाओं से, इम्युनोग्लोबुलिन की भारी और प्रकाश श्रृंखला के दृश्यों पीसीआर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, और एंटीबॉडी 'जीन इम्युनोग्लोबुलिन जी अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन और इन विट्रो में उत्पादन किया। इस तकनीक का उपयोग करना, दाता में पाया वास्तव में एक ही एंटीबॉडी अनुक्रम के साथ एक एंटीबॉडी का अध्ययन किया जा सकता है।

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Protocol

जानकार सहमति अध्ययन के प्रतिभागियों से प्राप्त हुई थी। अध्ययन संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear 1. अलगाव (PBMCs)

  1. अपकेंद्रित्र खून निकालने के बाद जितनी जल्दी हो सके 15 मिनट के लिए 900 XG, पर 'प्रतिभागियों heparinized रक्त का 25 मिलीलीटर। कम खून है, तो तदनुसार अभिकर्मकों नीचे पैमाने। एक डाकू के सभी अगले चरणों का प्रदर्शन।
  2. एक साफ ट्यूब के लिए सीरम स्थानांतरण। यह ऑटो एंटीबॉडी परीक्षण करने के लिए, PBMCs ठंड के लिए या autoimmune रोगियों के मामले में बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. 1640 RPMI मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ खून पतला और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend।
  4. एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब polysucrose और सोडियम diatrizoate (1.077 ग्राम / एमएल) युक्त समाधान के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. धीरे ट्यूब करीब toget के दो उद्घाटन लाकर 1.4 चरण में समाधान के शीर्ष पर खून परतउसके दो तरल पदार्थ के संपर्क में बहुत धीरे से आते हैं, और उसके बाद 50 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर धीरे-धीरे PBMC निलंबन छानना तक। यह कदम PBMCs का एक अच्छा जुदाई के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. 20 मिनट के लिए आरटी पर ब्रेक के बिना 400 XG पर 1.5 कदम में प्राप्त ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  7. Centrifugation के बाद, pipet के साथ PBMCs शामिल है जो ट्यूब, के मध्य भाग में प्रकट होता है कि सफेद अंगूठी ठीक हो।
  8. 1640 RPMI मीडिया के 25 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  9. 10 मिनट के लिए आरटी पर 300 XG अपकेंद्रित्र।
  10. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कदम 1.9 में के रूप में फिर RPMI 1640 अपकेंद्रित्र के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  11. पहले से 14 के रूप में रिपोर्ट एक Neubauer चैम्बर के साथ PBMCs गणना।
  12. खंड 2 के रूप में PBMCs प्रक्रिया या इस प्रकार के रूप में बाद में उपयोग के लिए उन्हें स्टोर: 10 लाख PBMCs 1.2 चरण में प्राप्त 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) और 90% सीरम के 1 मिलीलीटर में पतला cryovial ट्यूब प्रति ठंड के लिए। उत्तरोत्तर और लंबे समय sto के लिए रुकतरल नाइट्रोजन में रोष।

2. धुंधला PBMCs सेल cytometry द्वारा CD22 + और आईजीजी + छंटनी के लिए

  1. (एल glutamine, 10 मिमी HEPES बफर, 50 यू / एमएल पेनिसिलिन, 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और भ्रूण गोजातीय सीरम के 10% के साथ पूरक) पूरा RPMI 1640 मध्यम के 6 मिलीलीटर के साथ एक 25 सेमी 2 सेल संस्कृति फ्लास्क में PBMCs प्लेट और उन्हें 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हे / एन की वसूली करते हैं।
  2. बाँझ 4% एल्बुमिन फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान हे / एन के साथ बाँझ FACS ट्यूबों अवरुद्ध करें। पीबीएस के साथ दो बार ट्यूबों धो लें और पूर्ण 1640 RPMI माध्यम के 500 μl के साथ उन्हें भरने। छंटाई के बाद कोशिकाओं को ठीक करने के लिए इन ट्यूबों का उपयोग करें।
  3. 5 मिनट के लिए आरटी पर 400 XG पर एक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में PBMCs लीजिए।
  4. लेबलिंग बफर में कोशिकाओं (देखें 2.5 और 2.6 कदम) Resuspend और उन्हें 14 गिनती। लेबलिंग बफर बाँझ 2% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) पी में हैबी एस।
  5. 10 5 कोशिकाओं के साथ प्रत्येक 3 प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ट्यूबों को तैयार है और लेबलिंग बफर के 100 μl में resuspend। इन ट्यूबों छँटाई के फाटकों को परिभाषित करने के लिए की सेवा करेंगे।
    1. पहली ट्यूब में तीसरे ट्यूब में दूसरी ट्यूब 20 (निर्माता की datasheet में अनुशंसित) विरोधी आईजीजी पीई के μl, और कुछ भी नहीं है, (निर्माता की datasheet में अनुशंसित) विरोधी CD22 PerCP एंटीबॉडी के 5 μl जोड़ें। 30 मिनट के दौरान बर्फ पर और अंधेरे में सेते हैं।
  6. Resuspend 5 लाख एक FACS ट्यूब में लेबलिंग बफर के 200 μl में कोशिकाओं और विरोधी CD22 PerCP के 10 μl और विरोधी आईजीजी पीई के 40 μl जोड़ें। 30 मिनट के दौरान बर्फ और अंधेरे पर कोशिकाओं को सेते हैं। कोशिकाओं के एक उच्च संख्या की छँटाई वांछित है, सभी अभिकर्मकों तक पैमाने।
  7. आरटी पर 5 मिनट के लिए एक कम ब्रेक के साथ 400 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  8. धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना।
  9. 500 μ में कोशिकाओं Resuspendलेबलिंग बफर के एल। आरटी पर 5 मिनट के लिए एक कम ब्रेक के साथ 400 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। दोहराएँ 2.7 और 2.8 कदमों
  10. धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना और RPMI पूरा मीडिया के 300 μl में कोशिकाओं resuspend।
  11. एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं। प्रकोष्ठों सॉर्ट करने के लिए तैयार हैं।

बी कोशिकाओं CD22 + और आईजीजी 3. छंटनी +

  1. कक्षों की व्यवहार्यता स्थापित करने के लिए 3 नियंत्रण ट्यूब का उपयोग करें। कोई धुंधला के साथ नियंत्रण में, लिम्फोसाइट gating को परिभाषित करने के लिए आगे और आकार तितर बितर साजिश का उपयोग करें। CD22 PerCP और विरोधी आईजीजी पीई के साथ नियंत्रण का फाटक, और छँटाई गेट स्थापित करने के लिए काम करते हैं। जैसा कि पहले बताया डेटा 15 निम्नलिखित प्रदर्शन।
    नोट: एक फाटक एक बड़ा सेट से, हमारे मामले कोशिकाओं में, cytometric घटनाओं के एक विशिष्ट समूह को अलग करने की सेवा है कि मूल्य सीमा (सीमाओं) का एक सेट है। एक छँटाई गेट मूल्य सीमा के मामले में के अंदर कर रहे हैं जो cytometric घटनाओं, कोशिकाओं की वसूली की अनुमति देता हैपरिभाषित सीमाओं: CD22 + और आईजीजी +।
  2. छँटाई में एक संग्रह ट्यूब के रूप में, 2.2 कदम से प्राप्त पूर्ण 1640 RPMI माध्यम के 500 μl, के साथ बंद ट्यूब का उपयोग करें।
  3. डबल सकारात्मक 15 सॉर्ट करने के लिए आगे बढ़ें: CD22 + आईजीजी +। हर हालत में कोशिकाओं की अंतिम संख्या नोट करें। थाली के रूप में जल्द से जल्द फीडर कोशिकाओं के शीर्ष पर कोशिकाओं को हल।

फीडर कोशिकाओं 4. किरणन

नोट: 1 के बीच फीडर कोशिकाओं की तैयारी के प्रदर्शन - छँटाई से पहले 3 दिनों के लिए। कम से कम 5,000 wi38 कोशिकाओं को एक 96 दौर में अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति की जरूरत है। कदम एक हुड में 4.1, 4.2 और 4.4 प्रदर्शन करते हैं।

  1. सेल की वांछित संख्या तक पहुँच रहे हैं जब तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% पूर्ण 1640 RPMI माध्यम में सीओ 2 (PBMCs के लिए के रूप में ही) पर wi38 कोशिकाओं खेती।
  2. 16 से पहले वर्णित एक प्रोटोकॉल के बाद, 50 Grays पर उन्हें चमकाना। Wi38 कोशिकाओं trypsinized और सी में resuspended किया गया है एक बार विकिरण सम्पन्नRPMI मध्यम, या संस्कृति कुप्पी से जुड़ी है और विकिरण के बाद trypsinized wi38 साथ omplete। Wi38 कोशिकाओं के सप्लायर ने संकेत दिया trypsinization के लिए विधि का पालन करें। (कुल PBMC के 1% कदम 1.11 में गिना) आईजीजी + बी चढ़ाना कोशिकाओं के लिए आवश्यक कुओं को कवर करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या चमकाना।
  3. प्लेट 5,000 से युक्त 90 μl 96 दौर में अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में wi38 कोशिकाओं विकिरणित। (वे तेजी से लुप्त हो क्योंकि) खाली थाली के बाहर पंक्ति में कुओं छोड़ दें, और केवल चढ़ाना कोशिकाओं के लिए थाली के बीच में 60 कुओं का उपयोग करें। पीबीएस के 200 μl के साथ थाली तैयार कर रहे हैं कि बाहरी कुओं भरें।
  4. जब तक जरूरत है, 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रखें।

5. चढ़ाना छाँटे PBMCs, EBV के संक्रमण और बढ़ रहा है

  1. 96 दौर में अच्छी तरह से थाली (पहले चढ़ाया बुद्धि में 1640 पूरा मध्यम अच्छी तरह से प्रति RPMI के 50 μl में 50 कोशिकाओं थाली करने के लिए, हल PBMCs पतलाएच wi38 किरणित कोशिकाओं)। EBV के काम के लिए सुसज्जित एक डाकू में चरणों का प्रदर्शन।
    नोट: अच्छी तरह से प्रति 50 कोशिकाओं के संक्रमण से अनुकूलित और एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 8 निर्माण करने के लिए likehood बढ़ जाती है, तथापि, यह 1,6 से पहले के रूप में वर्णित पीसीआर द्वारा यह सत्यापित करने के लिए सिफारिश की है।
  2. अच्छी तरह से 96 के दौर में अच्छी तरह से थाली 17 में से प्रत्येक के लिए - (4 एक्स 10 8 वायरल प्रतियां / एमएल 3 युक्त) EBV के सतह पर तैरनेवाला के 60 μl जोड़ें। चेतावनी EBV के काम के दौरान लिया जाना चाहिए।
  3. CPG के 1 माइक्रोग्राम / एमएल (ODN2006) प्रति अच्छी तरह से जोड़ें।
  4. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को छोड़ दें।
  5. एक सप्ताह के बाद खुर्दबीन के नीचे से बढ़ दिखने पर नजर रखने के क्लोन।
    नोट: बी सेल के विकास के कुछ उदाहरण परिणाम अनुभाग में नीचे देखा जा सकता है। क्लोन की है कि विकास दर अलग-अलग हो सकता है नोटिस, और अतिरिक्त समय में अच्छी तरह से के बीच में बढ़ रही कुछ सेल जन देखने के शुरू करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
  6. 1 सेंट दो सप्ताह के बादप्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे बढ़ रहा है और पहली बार मीडिया का आदान-प्रदान करने के लिए आगे बढ़ना है पर नजर रखने के क्लोन। धीरे-धीरे अच्छी तरह के शीर्ष भाग से मध्यम के 90 μl pipet और एक साफ 96 अच्छी तरह से थाली में इकट्ठा। (बी कोशिकाओं अच्छी तरह से नीचे में झूठ बोलते हैं, इसलिए उन्हें महाप्राण को कोई खतरा नहीं है)।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए CPG (ODN2006) के 1 माइक्रोग्राम / एमएल और IL2 के 50 यू / एमएल के साथ पूरक पूरा RPMI 1640 मीडिया के 100 μl जोड़ें। क्लोन से बढ़ रहे हैं, तो चरण 6 में के रूप में एलिसा द्वारा यह पहली बार मीडिया के आदान-प्रदान का विश्लेषण।
  7. बढ़ रही क्लोन मॉनिटर और 3 और मीडिया के 90 μl ले रही है और CPG (ODN2006) के 1 माइक्रोग्राम / एमएल और 50 यू / एमएल के साथ पूरक पूरा RPMI 1640 मीडिया के 100 μl जोड़कर फिर से बढ़ के 4 वें सप्ताह के बाद मीडिया को बदलने IL2। चरण 6 में के रूप में एलिसा द्वारा आईजीजी उत्पादन की निगरानी करने के लिए एकत्र सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें।
    नोट: बढ़ रही है एक महीने के क्लोन दौर कोशिकाओं के समुच्चय था देख कर स्पष्ट किया जाना चाहिए के बादटी आम तौर पर अच्छी तरह से दौर नीचे के बीच में झूठ बोलते हैं।
  8. इस चरण में, उसी तरह से मीडिया को बदलने कि पिछले सप्ताह लेकिन केवल पूरा RPMI 1640 मीडिया के साथ। एक अच्छा संकेत यह पीले रंग की कोशिकाओं को एक मीडिया आदान-प्रदान की जरूरत बनता जा रहा है अगर मीडिया को बदलने के लिए सही समय है, मीडिया का रंग है पता करने के लिए।
  9. 96 अच्छी तरह प्लेटें बड़ा क्लोन (लगभग 5 x 10 5 कोशिकाओं) से युक्त हों, तो एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक फ्लैट में अच्छी तरह से करने के लिए उन्हें हस्तांतरण। नई अच्छी तरह से पूरा करने के लिए 1640 RPMI मीडिया के 300 μl जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा और homogeneously वितरण नया अच्छी तरह से करने के लिए कई बार, और कोशिकाओं स्थानांतरण, नीचे, 96 अच्छी तरह से बढ़ रही क्लोन Resuspend। जब जरूरत नए मीडिया जोड़ें।
    1. 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं कोशिकाओं (लगभग 5 x 10 6 कोशिकाओं) से भरे हुए हैं, जब 6 अच्छी तरह से थाली के एक फ्लैट में अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण। अच्छी तरह से करने के लिए नई पूर्ण 1640 RPMI मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें। ऊपर pipetting द्वारा और कई बार नीचे 24 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं Resuspend, और उन्हें homoge वितरितneously नए कुएं में।
  10. जब जरूरत मीडिया जोड़ें। कोशिकाओं संस्कृति में बनाए रखा जा करने के लिए नहीं कर रहे हैं, आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर गोली कोशिकाओं। एलिसा परीक्षण के लिए supernatants स्टोर। 5 मिनट के लिए 400 XG पर फिर से 1 एक्स पीबीएस, सेंट्रीफ्यूज के साथ एक बार कोशिकाओं की गोली धोने, और शाही सेना निकासी जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर शुष्क संग्रहीत।
    1. 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं मिला हुआ (लगभग 20 x 10 6 कोशिकाओं) हो जाते हैं, एक 60 मिमी संस्कृति की थाली के लिए स्थानांतरण। नई प्लेट को पूरा 1640 RPMI मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ें। पूर्ण के रूप में है उन्हें 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं Resuspend और हस्तांतरण 5.9 और 5.10 दोहराएँ।
  11. जब जरूरत नए मीडिया जोड़ें। 90% भ्रूण बछड़ा सीरम में 30 लाख / मिलीलीटर और 10% DMSO के - इस चरण में, 10 पर कोशिकाओं फ्रीज। कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में करना चाहता था कर रहे हैं, बड़ा सतह प्लेटों में क्लोन के विस्तार जारी है।

आईजीजी एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए 6. एलिसा

  1. अच्छी तरह से एक एलिसा थाली ओ में 50 μl / बांटनाएफ बकरी एफ (अटल बिहारी) 2 विरोधी मानव एफसी एंटीबॉडी कोटिंग बफर में 1 200 पतला। कोटिंग बफर 50 मिमी ना 2 3 सीओ पीएच 9.6 गये हैं।
  2. एक प्लास्टिक स्टीकर के साथ प्लेटें सील, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं। वैकल्पिक रूप से, 4 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  3. वाशिंग बफर के 200 μl के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 6 बार धोएं। वॉशिंग बफर 0.05% बीच 20 1 एक्स पीबीएस में शामिल हैं। स्पर्श या एंटीबॉडी के लिए बाध्य किया गया है, जहां अच्छी तरह से सतह खरोंच न करें।
  4. बफर अवरुद्ध, 100 μl / अच्छी तरह से साथ ब्लॉक। बफर अवरुद्ध पीबीएस में गैर वसा शुष्क दूध के 4% शामिल हैं। थाली को सील करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं।
  5. धो नहीं। अवरुद्ध बफर त्यागें और अवशिष्ट तरल दूर करने के लिए एक कागज तौलिया पर उल्टा थाली 3 बार थप्पड़।
  6. क्लोन 'supernatants और मानकों को सेते हैं।
    1. एक पहले टेस्ट के लिए, कदम 5.6 या RPMI में 5.7 1/3 में प्राप्त क्लोन supernatants पतला। मानकों RPMI मध्यम मानव आईजीजी समाधान के साथ पतला के लिए प्राप्त करने के लिए: 1,000 एनजी /मिलीलीटर, 500 एनजी / एमएल, 250 एनजी / एमएल, 125 एनजी / एमएल, 62.5 एनजी / एमएल, 31.25 एनजी / एमएल, 15.6 एनजी / एमएल और खाली। अच्छी तरह से / 50 μl का प्रयोग करें और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ऐसे 1/10 या 1/100 के रूप में एंटीबॉडी आत्मीयता का परीक्षण करने के क्लोन 'सतह पर तैरनेवाला के आगे dilutions, विश्लेषण।
  7. कदम 6.3 में पूर्ण के रूप में धो लें।
  8. ऊष्मायन बफर में 20,000: बकरी एफ के 50 μl / अच्छी तरह से उपयोग करें (अटल बिहारी) 2 विरोधी मानव आईजीजी एफसी peroxidase 1 पतला संयुग्मित। ऊष्मायन बफर 1x पीबीएस में 1% BSA और 0.02% बीच 20 शामिल हैं। 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  9. कदम 6.3 में पूर्ण के रूप में धो लें।
  10. 0.1% 3,3 'वाले 100 μl / अच्छी तरह से सब्सट्रेट समाधान जोड़ें, 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)। कुओं में एक स्थिर नीले रंग रूपों तक 10 मिनट के लिए सेते हैं। ध्यान रहे; बहुत लंबा इंतजार नहीं है!
  11. 2 महाराष्ट्र 2 अतः 4 के 50 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो। प्रतिक्रिया को रोकने के बाद 30 मिनट के भीतर, 450 एनएम पर अवशोषण उपाय।
    नोट: सभी क्लोन कीखाली पर 3 मानक विचलन के साथ upernatants आईजीजी मानव एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक विचार किया जाएगा। सकारात्मक क्लोन की पुष्टि के लिए इस एलिसा एक ही क्लोन के विभिन्न supernatants में कम से कम तीन बार दोहराया जाना चाहिए। इसके अलावा unspecific पार जेट की संभावना त्यागने के लिए supernatants uncoated में incubated लेकिन कुओं अवरुद्ध कर रहे हैं जब वहाँ कोई संकेत नहीं है कि आश्वस्त करने के लिए सिफारिश की है। इस चरण में, एक का पता लगाने परख ब्याज की एंटीबॉडी के प्रतिजनी विशिष्टता धारा 7 के लिए आगे बढ़ना करने से पहले किया जा सकता है के लिए स्क्रीन करने के लिए।

निर्माण आईजीजी क्लोन 7. शाही सेना अलगाव और सबसे पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण

  1. आईजीजी के उत्पादन एलिसा द्वारा की पुष्टि की है के रूप में जल्द ही के रूप में, क्लोन की शाही सेना निकालें।
  2. चरणों 5.7 या 5.9 में बढ़ कोशिकाओं से शाही सेना को निकालने के लिए, 10,000 कोशिकाओं से एक सेल करने के लिए डीएनए प्राप्त करने की अनुमति देता है जो अभिलेख तृतीय कोशिकाओं प्रत्यक्ष सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करें।
  3. LAR से शाही सेना निकालने के लिएकोशिकाओं की प्रासंगिकता मात्रा में है, या कदम 5.11 में संग्रहीत गोली से उच्च शुद्ध आरएनए अलगाव किट का उपयोग करें। शाही सेना निकासी की अन्य प्रणालियों को भी इस कदम पर उपयुक्त हो सकता है। निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  4. सेल नंबर के लिए रिवर्स प्रतिलेखन प्रणाली का उपयोग 4 से 10 एक्स 6 से 10 एक्स 1 और 1 के बीच, निर्माता के निर्देश के बाद। पहली कतरा सीडीएनए संश्लेषण के लिए अन्य प्रणालियों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

8. 1 सेंट और हैवी का प्रवर्धन और आईजीजी उत्पादक बी-सेल क्लोन की लाइट श्रृंखला के लिए 2 एन डी पीसीआर

  1. चरण 6 में आईजीजी एलिसा में कदम 5.6 और 5.7 और सकारात्मक में प्राप्त सेल क्लोन के सीडीएनए के साथ, 1 टेबल में सूचीबद्ध प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रदर्शन करते हैं।
  2. प्रत्येक आईजीजी भारी, रूई और लैम्ब्डा श्रृंखला के लिए स्वतंत्र PCRs सेट करें। आगे के साथ एक शेयर समाधान करें और बराबर मात्रा में प्राइमरों रिवर्स। 0.4 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता में प्रतिक्रिया के लिए उन्हें जोड़ने। </ ली>
  3. 1 सेंट पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए सीडीएनए संश्लेषण के 1 μl का प्रयोग करें। यहाँ, TAKARA Taq के निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर 20 μl प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, अन्य पीसीआर का उपयोग करें।
  4. निम्नलिखित चक्र की शर्तों के तहत 1 सेंट पीसीआर रखें: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; (के 50 चक्रों: 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 45 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, और 72 डिग्री सेल्सियस, 72 डिग्री सेल्सियस 7 मिनट के लिए, यह प्रतिक्रिया में 4 डिग्री C.Include एक खाली पर शांत हो जाओ, संभव संदूषण का पता लगाने के लिए।
  5. 1x TBE (89 मिमी Tris-borate और 2 मिमी EDTA) तैयार करें। 1x TBE की 100 मिलीलीटर की एक मात्रा में agarose (1% agarose जेल) की 1 ग्राम जोड़ें। Agarose भंग हो जाता है, जब तक लगभग 1 मिनट के लिए माइक्रोवेव में समाधान हीट। तो 10 मिलीग्राम / एमएल ethidium ब्रोमाइड (या समतुल्य डीएनए डाई) के 4 μl और मिश्रण जोड़ें।
    1. एक ट्रे में सामग्री डालो और polymerized हो जाता है जब तक प्रतीक्षा करें। बैंड कल्पना करने के लिए जेल में पीसीआर मिश्रण के 5 μl चलाएँ। भारी श्रृंखला टुकड़ा400 बीपी - प्रकाश श्रृंखला के आसपास 300 होना चाहिए, जबकि 550 बी पी - एस 400 के आसपास होना चाहिए। बैंड का पता नहीं कर रहे हैं, 2 एन डी पीसीआर को इसी तरह आगे बढ़ना।
  6. 2 एन डी पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए मिश्रण पहले पीसीआर की 1 μl का प्रयोग करें। कदम 8.2 लेकिन प्राइमरों के उपयुक्त मिश्रण का उपयोग करने में (1 टेबल देखें) है कि एक ही अभिकर्मकों का प्रयोग करें। 2 एन डी पीसीआर का उपयोग निम्न स्थितियों के लिए: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; ; (30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 30 सेकंड के लिए 56.5 डिग्री सेल्सियस और 55 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के 50 चक्रों) 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; यह 4 डिग्री सेल्सियस नीचे शांत करते हैं। संभव पीसीआर संदूषण का पता लगाने के लिए प्रतिक्रिया में एक रिक्त, को शामिल करें।
  7. 8.5 में वर्णित के रूप में एक agarose जेल तैयार करें। चरण 9 में क्लोनिंग के लिए सही आकार के टुकड़े होते हैं जो amplifications का प्रयोग करें और चरण 10 में एंटीबॉडी का उत्पादन 8.5.1 के रूप में पीसीआर उत्पाद कल्पना करने के लिए जेल चला।
  8. अनुक्रम युक्त 10 μl प्रतिक्रिया का उपयोग करके डीएनए, 2 एन डी पीसीआर, 0 से 100 एनजी।प्राइमर या प्राइमर मिश्रण, टर्मिनेटर का 1 μl और बफर के 1 μl के 2 माइक्रोन। (:, 5 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 96 डिग्री सेल्सियस और 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्रों:), इन शर्तों के तहत अनुक्रमण प्रतिक्रिया सम्पन्न 7 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस; यह 4 डिग्री सेल्सियस नीचे शांत करते हैं।
  9. निर्माता के निर्देशों का पालन microspin G50 के कॉलम के साथ अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं शुद्ध। 18 से पहले के रूप में वर्णित एक स्वचालित अनुक्रम विश्लेषक में बंधाव के दृश्यों का मूल्यांकन करें। Electropherograms साफ हो सकता है और एक भी इम्युनोग्लोबुलिन अनुक्रम के अनुरूप होना चाहिए।
    नोट: पीसीआर उत्पादों अस्पष्ट या मिश्रित इम्युनोग्लोबुलिन दृश्यों को दिखाने के हैं, अलग दृश्यों को प्राप्त करने और फिर 9 कदम आगे बढ़ना करने के लिए, TopoTA प्रणाली का उपयोग कर उन्हें क्लोन करने पर विचार करें।

9. क्लोनिंग और निर्माण आईजीजी क्लोन की भारी और हल्की चेन का अनुक्रमण

  1. वैक्टर के डीएनए का 1 माइक्रोग्राम pFUSE2ss-CLIg-एच, pFUSE2ss- तैयार करेंCLIg-HL2 और pFUSEss-CHIg-hG1।
  2. उचित प्रतिबंध एंजाइमों के साथ इन वैक्टर डाइजेस्ट। PFUSEss-CHIg-hG1 के लिए इस्तेमाल की पारिस्थितिकी आरआई और pFUSE2ss-CLIg-HL2 के लिए pFUSE2ss-CLIg-एच, पारिस्थितिकी आरआई और AVR द्वितीय के लिए बीएसआई WI, और पारिस्थितिकी आरआई और Nhe मैं। वेक्टर के डीएनए का 1 माइक्रोग्राम के लिए प्रत्येक प्रतिबंध एंजाइम की 3 इकाइयों का प्रयोग करें।
    1. एक एंजाइम के साथ डाइजेस्ट और एक पीसीआर शोधन किट के साथ पचा उत्पाद शुद्ध। दूसरा एंजाइम के साथ डाइजेस्ट और (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) एक जेल निकालना किट के साथ शुद्ध। Agarose जेल से ब्याज का टुकड़ा काटें। कदम 8.5 में के रूप में agarose जेल तैयार करें।
  3. पारिस्थितिकी आरआई और बीएसआई वाई कापा श्रृंखला प्रवर्धन के लिए, पारिस्थितिकी आरआई और AVR द्वितीय लैम्ब्डा श्रृंखला प्रवर्धन के लिए, और पारिस्थितिकी आरआई और Nhe मैं भारी श्रृंखला प्रवर्धन के लिए: उत्पादन आईजीजी क्लोन के 2 एन डी पीसीआर उत्पादों डाइजेस्ट। एक एंजाइम के साथ डाइजेस्ट और एक पी के साथ पचा उत्पाद शुद्धसीआर शोधन किट। दूसरा एंजाइम के साथ डाइजेस्ट और एक पीसीआर शोधन किट के साथ पचा उत्पाद शुद्ध। कदम 9.2 में के रूप में एंजाइमों और डीएनए राशि का एक ही इकाइयों का प्रयोग करें।
  4. टी -4 डीएनए ligase 16 ° सीओ / एन निम्नलिखित निर्माता की सिफारिशों के साथ वैक्टर के अंदर पीसीआर टुकड़े कटी घमनी को बांधना। 1 होना चाहिए इस्तेमाल किया अनुपात: 2 (वेक्टर: डालने)।
  5. DH5α बैक्टीरिया को बदलने के लिए बंधाव के 1 μl का प्रयोग करें। परिवर्तन के लिए DH5α निर्माता की शर्तों का पालन करें। इस्तेमाल किया वेक्टर के प्रकार पर निर्भर करता है, blasticidin या Zeocin प्लेटों में बैक्टीरिया बिखरा हुआ है। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों हे / एन सेते हैं।
  6. निर्माता 'निर्देशों का पालन, एकल कालोनियों बढ़ती है, और एक Miniprep किट के साथ डीएनए निकाल सकते हैं। एकल कॉलोनी के लिए प्रयोग करें बढ़ने और डीएनए डीएनए Miniprep किट से निर्माता की सिफारिशों निष्कर्षण। चरणों 9.2 और 9.3 के रूप में वैक्टर और आवेषण की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया एंजाइमों के साथ पाचन द्वारा उन्हें विश्लेषण।
  7. अनुक्रम डीएनए, usin द्वारावेक्टर के छ 100 एनजी चरणों 8.8 और 8.9 में किया जाता है।

HEK कोशिकाओं में एंटीबॉडी के 10 उत्पादन

  1. एक 150 मिमी सेल संस्कृति की थाली में 75% की एक confluency करने के लिए 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 1% एल ग्लूकोज, 1% पेनिसिलिन / streptavidin (DMEM +) के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में HEK कोशिकाओं को विकसित। एक डाकू में प्रदर्शन 10.1-10.7 कदम।
  2. अभिकर्मक पहले, भ्रूण बछड़ा सीरम के बिना के रूप में, लेकिन इससे पहले मध्यम करने के लिए मध्यम विनिमय।
  3. प्रत्येक भारी, प्रकाश श्रृंखला अभिकर्मक के लिए, (पी (सीरम) के बिना DMEM के 2.5 मिलीलीटर, भारी चेन के साथ वेक्टर के 9 माइक्रोग्राम, प्रकाश श्रृंखला के साथ वेक्टर के 6 माइक्रोग्राम, और polyethylenimine के 100 μl के साथ एक अभिकर्मक मिश्रण तैयार एक 1 माइक्रोग्राम / μl स्टॉक से) समाधान ()। 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. धीरे थाली में HEK कोशिकाओं के लिए कदम 10.3 में तैयार अभिकर्मक मिश्रण के 2.5 मिलीलीटर जोड़ने। Homogeneously वितरित करने के लिए थाली रॉक।
  5. में24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं cubate।
  6. भ्रूण बछड़ा सीरम के बिना मध्यम करने के लिए मध्यम संस्कृति बदलें।
  7. 4 दिन बाद प्लेटों से मध्यम लीजिए।
    नोट: मीडिया में एंटीबॉडी इन विट्रो में और vivo में अपने जेट चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Representative Results

CD22 और आईजीजी सकारात्मक कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद छँटाई gating के चित्र 1 में दिखाया गया है इस छवि में डबल सकारात्मक कोशिकाओं के क्षेत्र -। आईजीजी उत्पादन बी कोशिकाओं - एक अलग ट्यूब में इन सभी कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए चुना गया है। विश्लेषण में, कुल PBMCs का लगभग 1% इस डबल सकारात्मक जनसंख्या के अनुरूप हैं। प्राप्त सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की संख्या धारा 1 में प्राप्त कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करेगा।

EBV के अमरता और CPG (ODN2006) उत्तेजनाओं के 5 हफ्तों के बाद अलग अलग परिणाम चित्रा 2 में दिखाया जाता है बढ़ रही क्लोन का पता लगाने के लिए आसान है। Wi38 फीडर कोशिकाओं एक अधिक लम्बी तंतुप्रसू आकार दिया है, और बी सेल क्लोन दौर नीचे बहु अच्छी तरह से थाली के बीच में क्लस्टर बढ़ के रूप में बहुत छोटे गोल कोशिकाओं दिखाई देते हैं। इस स्तर पर, यह कुछ क्लोन बढ़ शुरू है कि स्पष्ट है। हालांकि, बढ़ती गति कुओं contai के कुछ चर हो और निश्चित रूप से कर सकते हैंनिंग कोशिकाओं में सभी से बढ़ रही किसी भी कोशिकाओं नहीं कर सकते हैं अमर।

बढ़ रही क्लोन की सतह पर तैरनेवाला तालिका 2 में दिखाया गया है आईजीजी का पता लगाने के लिए एक एलिसा में परीक्षण किया है। इस एलिसा में आईजीजी के लिए एक मानक वक्र परीक्षण किया जाता है, एक साथ क्लोन और कारतूस के साथ सतह पर तैरनेवाला। एलिसा में मूल्य रिक्त मूल्य पर 3 मानक विचलन है जब एक सकारात्मक क्लोन माना जाता है। नकारात्मक क्लोन 'मूल्यों को खाली करने के 3 मानक विचलन के तहत कर रहे हैं। पुष्टि के लिए, सकारात्मक क्लोन एक ही क्लोन के विभिन्न supernatants में कम से कम तीन बार एलिसा में सकारात्मक और एक अतिरिक्त स्क्रीनिंग विधि द्वारा सत्यापित यदि संभव हो तो होना चाहिए।

इस पांडुलिपि में वर्णित चरणों को लागू करने से प्राप्त एक मानव आईजीजी एंटीबॉडी का पूरा अनुक्रम में 3 चित्र में दिखाया गया है। यह क्रम एक clonally विस्तारित बी सेल से इम्युनोग्लोबुलिन भारी और लैम्ब्डा श्रृंखला जोड़ी क्लोनिंग के बाद प्राप्त किया गया है। चर एकएन डी भारी और प्रकाश श्रृंखला के लगातार क्षेत्रों में इस तकनीक के साथ लक्षण वर्णन किया जा सकता है। दृश्यों प्राप्त करने के बाद, एंटीबॉडी दृश्यों क्लोन किया जा सकता है और HEK सेल संस्कृतियों में इन विट्रो में उत्पादन किया।

चित्र 1
चित्रा 1. फ्लो CD22 + और ​​आईजीजी मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear से + कोशिकाओं की cytometric विश्लेषण। (ए) जीवित कोशिकाओं की जनसंख्या का चुनाव P1 में दिखाया गया है। (बी) के आगे तितर बितर साजिश है। (सी) का आकार तितर बितर साजिश है। (डी) वाई अक्ष विरोधी CD22-PerCP द्वारा और आईजीजी पीई द्वारा अलग एक्स अक्ष पर अलग कोशिकाओं से पता चलता है। पी 4 वर्ग (CD22 + आईजीजी +) और हल संस्कृति के लिए बरामद किया गया है कि सेल अंश इंगित करता है। इस फाई का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंgure।

चित्र 2
चित्रा बी सेल के 2. प्रतिनिधि छवि संस्कृति के 5 हफ्तों के बाद एक 96 अच्छी तरह से थाली में क्लोन अमर। यह अच्छी तरह से कोई अमरता (क) में 5 हफ्तों के बाद मनाया गया था, लेकिन wi38 विकिरणित फीडर कोशिकाओं मनाया जा सकता है। (बी) के एक धीरे बढ़ रही क्लोन बीच में छोटे दौर समुच्चय के साथ, अच्छी तरह से इस में मनाया गया। (सी) तेजी से बढ़ क्लोन अमर बी कोशिकाओं का समुच्चय दौर दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
एक मानव अमर बी सेल क्लोन, करें F5 से भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़ी की चित्रा 3. मानव एंटीबॉडी दृश्योंवी CDR1, CDR2 और CDR3 दृश्यों का संकेत है .2। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"> Λ
1 सेंट पीसीआर प्राइमरों
फॉरवर्ड (5'-3 ') रिवर्स (3'-5 ')
आईजीजी 5 'एल-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG 3 'Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
5 'एल-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
5 'एल-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
5 'एल-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ 5 'एल Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG 3 'Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
5 'एल Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG 3 'Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
5 'एल Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
5 'पान Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ 5 'एल Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG 3 'Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
5 'एल Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
5 'एल Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
5 'एल Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
5 'एल Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
5 'एल Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
5'एल Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2 एन डी पीसीआर प्राइमरों
फॉरवर्ड (5'-3 ') रिवर्स (3'-5 ')
IGH 5 'EcoRI वीएच 1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG
TGCAG 		3 'NheI झा 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT
GACCAG
5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG करने के लिए 5 'EcoRI वीएच 1
GTGCAG 		3 'NheI झा 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA
CCATTG
5 'EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG
GTGGAG 		3 'NheI झा 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG
ACCGTG
5 'EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT
GTTGGAG
5 'EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT
GCAGGAG
5 'EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC
AGCAGTG
5 'EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT
GGTGCAG
5 'EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT
GGTACAG
5 'EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT
GGTGGAG
5 'EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT
GGTGGAG
5 'EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT
GCAGGAG
5 'EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT
GCAGCAG
κ 5 'EcoRI Vκ 1 से 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA
CCCAGTC 		4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC करने के लिए 3 'BsiWI Jκ 1
5 'EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC
CCAGTCT 		3 'BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACG TTTGATCTCCAG
CTTGGTC
5 'EcoR1 Vκ -1 डी 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA
CCCAGTC 		3 'BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT
TTGGTC
5 'EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA
CCCAGAC
5 'EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG
ACTCAGTC
5 'EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA
CTCAGTC
5 'EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG
ACACAGTC
5 'EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG
ACGCAGTC
5 'EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA
CGCAGTCT
5 'EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG
ACCCAGTC
5 'EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT
GACKCAG 		3 'AvrII Jλ 1 से 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT
TGGTCCC
5 'EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC
TGACTCAG 		3 'AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC
TGGGTTCC
5 'EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC
TGACWCAG 		3 'AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC
TCGGTCCC
5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG करने के लिए 5 'EcoR1 Vλ 4
CTGACTCA 		3 'AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT
GGGTGCC
5 'EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC
TGACTCAG 		3 'AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC
TTGGTCCAT
8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG करने के लिए 5 'EcoR1 Vλ 7
GTGACYCAG
"> तालिका 1. प्राइमर का इस्तेमाल किया।

ईएफटी "> 0.080
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12
ए 0.076 0.077 2.003 0.080 0.138 0.102 0.188 0.338 0.040 2.041 0.051 0.081
बी 2.011 0.085 0.074 0.069 0.081 0.122 0.372 2.133 0.119 0.097 0.072 0.072
सी 0.068 0.179 0.091 0.073 0.077 0.097 0.606 1.882 0.081 2.071 0.094 0.075
डी 0.063 0.070 0.065 0.071 0.082 2.071 0.339 2.089 0.076 0.086 0.066 0.069
ए 1.921 0.077 0.065 0.085 0.095 1.968 1.910 0.122 0.072 0.070 0.065 0.066
एफ 0.113 0.068 0.066 0.082 0.088 0.090 0.460 0.070 0.079 0.952 0.098 0.065
जी 2.041 2.108 1.472 0.665 0.331 0.194 0.123 0.094 0.072 0.070 0.072
एच 2.146 2.132 1.634 0.665 0.341 0.178 0.132 0.094 0.082 0.080 0.074 0.068
मानक एनजी / μl 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.6 7.8 3.9 1.95 0.975 0

एलिसा द्वारा आईजीजी स्क्रीनिंग की तालिका 2. प्रतिनिधि परिणाम है। क्लोन supernatants ए 1-ए 10, बी 1-B10, सी 1-C10, डी 1-D10, ई 1-E10, एफ 1-F10 में हैं। G1-G12 और H1-H12: रिक्तियाँ उ 11, B11, सी 11, D11, E11, F11, ए 12, बी 12, C12, डी 12, E12, F12.Standard वक्र दोहराया गया है में हैं। प्रत्येक दो प्रतियों में इम्युनोग्लोबुलिन की इसी एकाग्रता below.Positive या आईजीजी उत्पादन क्लोन गहरे भूरे रंग में दिखाया गया है दिखाया गया है। नकारात्मक या गैर आईजीजी उत्पादन क्लोन हल्के भूरे रंग में दिखाया गया है

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Discussion

इस पांडुलिपि में, मानव PBMCs से आईजीजी की पीढ़ी के लिए सभी कदम विस्तार से प्रस्तुत कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित तकनीक पर कुछ लाभ भी शामिल है। लाभ में से एक का उत्पादन किया एंटीबॉडी बी सेल क्लोन में मूल जोड़ी के लिए इसी भारी और प्रकाश जंजीरों रहता है। आईजीजी की पहचान मानव दाता के किसी भी प्रकार से किया जा सकता है, और टीकाकरण 5 की वजह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का गहरा लिए कोई जरूरत नहीं है। एक फीडर सेल के रूप में तंतुप्रसू सेल लाइन wi38 का उपयोग करते हैं, वे पहले से काम करता है वर्णित में फीडर सेल के रूप में इस्तेमाल किया PBMCs की तुलना में, आकृति विज्ञान के विभिन्न और अलग करने के लिए बहुत आसान कर रहे हैं के बाद से बढ़ रही है, क्लोन का एक और अधिक तेजी से पता लगाने की अनुमति देता है 1,6- 8। इसके अलावा एक फीडर सेल के रूप में wi38 का उपयोग आसानी से हर प्रयोग से पहले thawed और संवर्धित किया जा सकता है कि सेल aliquots की बड़ी मात्रा की ठंड के पक्ष में है।

Crit में से एकइस प्रोटोकॉल में राजनैतिक चरणों शुरू सामग्री है: PBMCs। रक्त centrifugation के लिए भी लंबे समय से इंतजार कर रहा है, तो या PBMCs की निकासी के बाद, वे उपयुक्त ठंड की स्थिति में संग्रहीत नहीं कर रहे हैं; व्यवहार्य कोशिकाओं की ऐसी संख्या प्राप्त क्लोन उत्पादन बी सेल आईजीजी की संख्या के साथ-साथ कम हो जाएगा के रूप में। कारण यह है कि, एक प्रारंभिक निष्कर्षण और PBMCs का एक अच्छा संरक्षण के लिए एक सफल परिणाम के लिए सिफारिश कर रहे हैं। आईजीजी उत्पादन क्लोन की संख्या प्रयोग की शुरुआत में PBMCs की संख्या सीमित करने के लिए किया जाएगा। PBMCs की उच्च संख्या आईजीजी उत्पादन क्लोन और एक विविध एंटीबॉडी उत्पादन की उच्च संख्या दे देंगे। एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी के प्रकाश और भारी जंजीरों की पीसीआर टुकड़े की क्लोनिंग है। बंधाव कई प्रयासों के बाद सफल नहीं है, तो एक TopoTA प्रणाली में 2 एन डी पीसीआर उत्पाद क्लोनिंग का एक अतिरिक्त कदम की सिफारिश की है। उपयुक्त एंजाइमों के साथ डालने के पाचन के लिए आसान हो सकता हैpFUSEss अभिव्यक्ति वैक्टर में एक बाद बंधाव के लिए TopoTA वेक्टर में।

इस तकनीक को मानव बी कोशिकाओं 3 समृद्ध कर रहे हैं, जिसमें मानव ऊतक के किसी भी प्रकार के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है। यह भी सिर्फ पीसीआर के लिए प्रथम डिजाइन, और व्यक्त वैक्टर (आईजीएम, आईजीई, आईजी ऐ या आईजीडी के खिलाफ एंटीबॉडी) छंटाई के लिए इस्तेमाल किया लेबल वाले एंटीबॉडी बदलकर, इम्युनोग्लोबुलिन के अन्य प्रकार के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है। इन इम्युनोग्लोबुलिन की पढ़ाई दूसरों के बीच में समझने के लिए ब्याज, प्रारंभिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, म्यूकोसा एंटीबॉडी स्राव और एलर्जी प्रोफाइल, के हो सकते हैं।

अंत में, हम मानव इम्युनोग्लोबुलिन की भारी और प्रकाश जंजीरों जोड़े बरकरार छोड़ देता है कि मानव पुनः संयोजक मोनोक्लोनल आईजीजी निर्माण करने के लिए एक तकनीक का वर्णन किया है। तकनीक उपयोगी और एक खून का नमूना से शुरू करने के लिए प्रदर्शन करना आसान है। इस पद्धति के माध्यम से प्राप्त मोनोक्लोनल एंटीबॉडी मानव प्रतिरक्षा पर अध्ययन में संभावित रूप से उपयोगी होते हैंके हिमायती हैं। इसके अलावा, इस विधि के साथ उत्पादन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विभिन्न रोग की स्थिति के लिए इम्युनो-चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

करने के लिए शोध अनुबंध मिगुएल Servet (ISCIII CD14 / 00,032) (जीएन-जी।)। वैज्ञानिक अनुसंधान "translational तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम के स्नातक स्कूल" के लिए नीदरलैंड संगठन (022005019) (सीएच) से फैलोशिप।

Prinses बीट्रिक्स Fonds (परियोजना WAR08-12) और एसोसिएशन Française contre लेस Myopathies करने से अनुदान (पीएम एम।); साथ ही वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन के एक Veni फैलोशिप (916.10.148) नीदरलैंड के ब्रेन फाउंडेशन के एक फैलोशिप द्वारा (FS2008 (1) -28) और एमएल Prinses बीट्रिक्स Fonds (परियोजना WAR08-12) ( )।

हम फ्लो द्वारा छँटाई बी कोशिका में उसकी मदद के लिए Jozien जैस्पर्स धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Histopaque-1077  Sigma-Aldrich 10771 solution containing polysucrose and sodium diatrizoate
FACSAria II cell sorter  BD Biosciences 
96 U-bottom micro well plates  Costar 3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium  Gibco, Life Technologies 12633-020
30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line   ATCC CRL-1612 3.4 x 108 copies/ml
CpG2006  Invivogen ODN 7909
Wi38 cells  Sigma-Aldrich 90020107
Interleukin-2 Roche  10799068001
ELISA plates Greiner Bio-One, Microlon 655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) Jackson ImmunoResearch 109-006-008
4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)  Biorad 170-6404
Human IgG  Sigma I 2511 HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml
Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) Jackson ImmunoResearch 109-036-008
ELISA reader (Perkin Elmer 2030)  Perkin Elmer  2030-0050
Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ  Jackson ImmunoResearch 309-035-095
SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System  Invitrogen  18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 Applied Biosystems
High Pure RNA Isolation Kit  Roche 11828665001
Reverse transcription system kit  Promega A3500
Recombinant Taq DNA Polymerase TAKARA R001A
Primers (2 μl) Sigma
Ultrapure Agarose  Invitrogen 16500-500
100 bp ladder Invitrogen 15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) Biorad 170-8100
QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28106
BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit  Applied Biosystems 4337455
0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) Applied Biosystems 4346906
Genetic analyser ABI300  Applied Biosystems 4346906
DH5α competent cells (E. coli) Invitrogen 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) Invivogen pfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)  Invivogen pfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) Invivogen pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp)  Invivogen pfuse2ss-hcll2
SOC medium Invitrogen 15544-034
LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) Invivogen fas-zn-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) Invivogen fas-zn-l
DNA Miniprep kit  Omega Bio Technology D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) Nanodrop
LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) Invivogen fas-bl-s
Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) Invivogen fas-bl-l
EcoRI New England Biolabs R0101S 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI New England Biolabs R0131S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladder New England Biolabs N3200S 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml
XmaI New England Biolabs R0180S 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
BsiWI New England Biolabs R0553S 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII New England Biolabs R0174S 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer 
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 1 U/µl, in 10x FastAP Buffer
DH5α competent cells  Invitrogen 18263-012
PE Mouse Anti-Human IgG BD Pharmingen 555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 Fisher scientific BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit  QIAGEN 27106
BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystems 4337455

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 100 मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी बी कोशिकाओं एपस्टीन बर्र वायरस टोल की तरह रिसेप्टर 9 स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों
अमर छाँटे बी कोशिकाओं से पुनः संयोजक मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का सृजन
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Nogales-Gadea, G., Saxena, A., Hoffmann, C., Hounjet, J., Coenen, D., Molenaar, P., Losen, M., Martinez-Martinez, P. Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells. J. Vis. Exp. (100), e52830, doi:10.3791/52830 (2015).

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