Introduction
מטרתו של מאמר זה היא לתאר בפירוט המתודולוגיה לייצר ולאפיין נוגדנים חד-שבטיים נוגדנים אנושיים המתקבלים מתאי אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs).
העניין ללמוד נוגדנים אנושיים גדל בתחומים שונים של מחקר. בפרט, קבוצות מחקר רבות מעוניינות בפתולוגיה הנגרמת על ידי נוגדנים עצמיים 1-3. יש לנו משובט ומאופיין אוטומטיים נוגדנים פתוגניים 1. המחקר של נוגדנים עצמיים יכול לעזור לזהות את המטרות שלהם ולפתח אסטרטגיות טיפוליות, למשל, באמצעות נוגדני מתחרה 4. יתר על כן, המחקר של נוגדנים אנושיים יכול להיות גם עניין בתחומים אחרים של מחקר, כלומר, כדי להעריך את התגובה החיסונית לאחר חיסון 5, לאפיין את פרופיל הנוגדן של אנשים שנחשפו והפכו עמידים לפתוגנים ספציפיים 6 או ללמוד ש נוגדנים הם בהרפרטואר הטבעי 7,12.
כמה טכניקות פותחו כדי ליצור נוגדנים חד שבטיים אנושיים רקומביננטי 8-12; רוב אלה להשתמש תצוגת הפאג והנצחת B-תא. השימוש בתצוגת הפאג יושם בהרחבה לגילוי נוגדנים חדשים 13. עם זאת יש לו חסרון גדול, כלומר שהזוגות כבדה וקלת שרשרת של אימונוגלובולינים האדם להיות מנותקים בתהליך. ייצור של hybridomas עם תאי B אנושיים או שינוי EBV מתגבר על חסרון זה.
אנו משתמשים בזיהום של תאי B הרתי עם EBV בשילוב עם גירוי תא polyclonal B באמצעות קולטן-כמו אגרה 9 (TLR-9) 6,12.
במאמר זה, אנו מתארים בפירוט את הטכנולוגיה שאנו משתמשים לפיתוח נוגדנים האנושיים IgG, עם סקירה של כל הצעדים מבידוד PBMC במבחנת דור הנוגדן שלם. זהפרוטוקול יכול לשמש לניתוח של כל סוג של פרופיל נוגדנים אנושי. במעבדה שלנו, תאי B מייצרים נוגדני IgG הופרדו בהצלחה משאר PBMCs לאחר המיון. חמישים B תאים ממוינים 8 אז יכולים להיות מצופים בלוחות רב-היטב והונצחו על ידי EBV וTLR-9 הפעלה, להרחבה המשובט של תאי B יחידים. כתאים מזינים, fibroblasts מרקמת ריאה עוברית אנושית כבר בשימוש, קו תא wi38, המאפשר ההדמיה של תאי B הונצחו. מתאי B אלה, ניתן להשיג הרצפים של כבדות וקלות שרשרות של אימונוגלובולין על ידי PCR, וגני 'הנוגדנים משובטים בוקטורי ביטוי G אימונוגלובולינים ומיוצרים במבחנה. שימוש בטכניקה זו, נוגדנים יחידים עם בדיוק אותו רצף הנוגדן נמצא בתורם ניתן ללמוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הסכמה מדעת שהתקבלה מהמשתתפים במחקר. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית.
1. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs)
- צנטריפוגה 25 מיליליטר של דם heparinized של המשתתפים ב 900 XG במשך 15 דקות, בהקדם האפשרי לאחר מיצוי הדם. אם יש פחות דם, להקטין את ריאגנטים בהתאם. לבצע את כל הצעדים הבאים במכסת מנוע.
- העבר את הסרום לצינור נקי. ניתן להשתמש בו בצעדים מאוחר יותר להקפאת PBMCs או במקרה של חולי אוטואימוניות, כדי לבדוק את הנוגדנים עצמיים.
- לדלל את הדם עם 10 מיליליטר של RPMI 1640 מדיה וresuspend את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- להוסיף 15 מיליליטר של תמיסה המכיל diatrizoate polysucrose ונתרן (1.077 g / מיליליטר) לצינור 50 מיליליטר חדש.
- בעדינות שכבת הדם על גבי הפתרון בשלב 1.4 על ידי הבאת שני הפתחים של toget הקרוב הצינורותשלה עד שני הנוזלים מגיעים לאט מאוד במגע, ולאחר מכן למזוג את ההשעיה PBMC לאט בחלק העליון של צינור 50 מיליליטר. שלב זה הוא קריטי ליש הפרדה טובה של PBMCs.
- צנטריפוגה הצינור שהושג בשלב 1.5 ב 400 XG ללא בלם על RT במשך 20 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, להתאושש עם pipet הטבעת הלבנה שמופיעה בחלק האמצעי של הצינור, המכיל את PBMCs.
- לשטוף את התאים עם 25 מיליליטר של תקשורת RPMI 1640.
- צנטריפוגה XG 300 ב RT במשך 10 דקות.
- בטל supernatant ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של RPMI 1640. צנטריפוגה שוב כמו בשלב 1.9.
- רוזן PBMCs עם תא נויבאואר כפי שדווח בעבר 14.
- לעבד את PBMCs כאמור בסעיף 2 או לאחסן אותם לשימוש מאוחר יותר באופן הבא: 10 מיליון PBMCs להקפאה לכל צינור cryovial המדולל ב 1 מיליליטר של 10% sulfoxide דימתיל (DMSO) ו -90% בסרום שהושג בשלב 1.2. להקפיא בהדרגה ולSTO הארוךזעם בחנקן נוזלי.
2. מכתים PBMCs למיון CD22 + וIgG + על-ידי תא Cytometry
- פלייט PBMCs בבקבוק תרבות 2 תא 25 סנטימטר עם 6 מיליליטר של מדיום השלם RPMI 1640 (בתוספת L- גלוטמין, חיץ 10 מ"מ HEPES, 50 U / פניצילין מיליליטר, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -10% מסרום שור עוברי) ולתת להם להתאושש O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- לחסום צינורות FACS סטרילי עם O סטרילי 4% פוספט אלבומין נאגר מלוח (PBS) פתרון / N. שטוף את הצינורות פעמיים עם PBS ולמלא אותם עם 500 μl של מדיום RPMI 1640 מלא. השתמש צינורות אלה לשחזור התאים לאחר המיון.
- לאסוף את PBMCs בצינור צנטריפוגות ב 400 XG ב RT במשך 5 דקות.
- Resuspend תאי חיץ תיוג (ראה שלבים 2.5 ו -2.6) ולספור אותם 14. חיץ התיוג הוא 2% בסרום סטרילי שור עוברי וחומצת 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) בPBS.
- הכן 3 צינורות הקרינה המופעל תא מיון (FACS) עם 10 5 תאים כל אחד וresuspend אותם במאגר של תיוג 100 μl. צינורות אלה ישמשו להגדרת השערים של המיון.
- בצינור הראשון להוסיף 5 μl של נוגדן אנטי CD22 PerCP (המומלץ בגיליון הנתונים של היצרן), בצינור 20 μl השני של אנטי IgG PE (מומלץ בגיליון הנתונים של היצרן), ושום דבר בצינור השלישי. לדגור על קרח ובכהה במהלך 30 דקות.
- Resuspend 5 מיליון תאים ב200 μl של חיץ תיוג בצינור FACS ולהוסיף 10 μl של אנטי CD22 PerCP ו -40 μl של אנטי IgG PE. דגירה התאים על קרח וכהה במהלך 30 דקות. אם המיון של מספר גבוה יותר של תאים רצוי, בהיקף של עד כל חומרים כימיים.
- תאי צנטריפוגה ב XG 400 עם בלם נמוך במשך 5 דקות ב RT.
- למזוג ברכות supernatant.
- Resuspend התאים 500 μl של חיץ תיוג. תאי צנטריפוגה ב XG 400 עם בלם נמוך במשך 5 דקות ב RT. חזור על שלבים 2.7 ו -2.8
- למזוג ברכות supernatant וresuspend התאים 300 μl של מדיה מלאה RPMI.
- להעביר את התאים דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. תאים מוכנים למיין.
3. מיון של תאי B + CD22 וIgG +
- השתמש 3 צינורות שליטה להקים את הכדאיות של התאים. בשליטה ללא הכתמה, להשתמש בעלילה קדימה ופיזור גודל להגדיר gating הלימפוציטים. הפקדים עם PerCP CD22 ואנטי-IgG PE ישמשו להקמת השערים, ושער המיון. בצע הבא נתונים שדווחו בעבר 15.
הערה: שער הוא סט של גבולות ערך (גבולות), המשמשים לבודד את קבוצה ספציפית של אירועי cytometric, במקרה שלנו התאים, מקבוצה גדולה. במקרה של שער מיון גבולות הערך מאפשר התאוששות של אירועי cytometric, תאים, שהם בתוךהגבולות מוגדרים: CD22 + וIgG +. - כצינור איסוף במיון, להשתמש בצינורות החסומים עם 500 μl של מדיום RPMI 1640 מלא, המתקבל מהשלב 2.2.
- להמשיך למיין כפול 15 חיוביים: CD22 + + IgG. שים לב למספר הסופי של תאים בכל מצב. צלחת מסודרים תאים על גבי תאים מזינים בהקדם האפשרי.
4. הקרנה של תאים מזין
הערה: בצע הכנת התאים המזין בין 1-3 ימים לפני המיון. לפחות 5,000 wi38 תאים נחוצים לכל גם בצלחת גם עגולה 96. בצע את השלבים 4.1, 4.2 ו -4.4 במכסת מנוע.
- לטפח את תאי wi38 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 במדיום RPMI 1640 מלא (זהה לPBMCs) עד המספר הרצוי של תאים הם הגיעו.
- מכשיר אותם ב 50 אפורים, הבאה פרוטוקול המתואר לפני 16. לבצע הקרנה ברגע שתאי wi38 כבר trypsinized וresuspended בגomplete בינוני RPMI, או עם wi38 המצורף לבקבוק התרבות וtrypsinized לאחר ההקרנה. בצע את השיטה לtrypsinization שצוינה על ידי הספק של תאי wi38. מכשיר את מספר התאים דרושים כדי לכסות את הבארות דרושות לציפוי IgG + תאי B (1% מPBMC הכולל נספרו בשלב 1.11).
- צלחת 90 μl המכיל 5,000 מוקרן wi38 תאים בכל טוב של הצלחת גם עגולה 96. השאר את הבארות בשורה מחוץ לצלחת הריקה (כי הם מתאדים מהר יותר), ולהשתמש רק 60 בארות באמצע הצלחת לתאי ציפוי. מלא את הבארות החיצוניות הממסגרות את הצלחת עם 200 μl של PBS.
- למקם אותם בחממה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, עד צורך.
5. ציפוי הממוין PBMCs, זיהום EBV וגידול
- לדלל את PBMCs הממוינים, לצלחת 50 תאים ב -50 μl של RPMI 1640 בינוניים מלא בכל טוב בשנינות 96 צלחת גם עגולה (מצופה בעברwi38 h תאים מוקרנים). בצע את שלבים במכסת מנוע המצוידים לעבודת EBV.
הערה: הזיהום של 50 תאים לכל גם הוא מותאם ומגדיל את likehood לייצר נוגדנים חד שבטי 8, עם זאת, מומלץ לוודא זאת על ידי PCR כפי שתואר קודם 1,6. - הוסף 60 μl של supernatant EBV (המכיל 3 - 4 x 10 8 עותקים נגיפיים / מיליליטר) לכל אחד גם בצלחת גם עגול 96 17. זהירות יש לנקוט במהלך עבודת EBV.
- הוסף 1 מיקרוגרם / מיליליטר של CPG (ODN2006) בכל טוב.
- השאר את התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
- שיבוט צג חזותי גדל תחת מיקרוסקופ לאחר שבוע אחד.
הערה: חלק מהדוגמות של צמיחת תאי B ניתן לראות להלן בסעיף התוצאות. שים לב ששיעורי הצמיחה של השיבוטים עשויים להשתנות, וזמן נוסף עשוי להיות נחוץ כדי להתחיל לראות כמה מסת תאים גדלה באמצע גם. - לאחר שני השבוע 1 stשיבוט צג של גדל תחת מיקרוסקופ האור ולהמשיך לחילופי התקשורת הראשונים. לאט pipet 90 μl של מדיום מהחלק העליון של הבאר ולאסוף בצלחת 96-היטב נקייה. (תאי B לשכב בתחתית הבאר, ולכן אין סיכון ללשאוב אותם).
- הוסף לכל טוב של 1640 מדיה RPMI המלאה בתוספת 1 מיקרוגרם / מיליליטר של CPG (ODN2006) ו -50 U / ml של IL2 100 μl. אם שיבוטים גדלים, לנתח חילופי תקשורת ראשון זה על ידי ELISA כמו בשלב 6.
- צג השיבוט גדל ולשנות תקשורת לאחר 3 ובשבוע של גובר שוב על ידי לקיחת 90 μl של תקשורת והוספה של 1640 מדיה RPMI המלאה בתוספת 1 מיקרוגרם / מיליליטר של CPG (ODN2006) ו -50 U / ml של 100 μl 4 th IL2. השתמש supernatant נאסף כדי לפקח על ייצור נוגדנים על ידי ELISA כמו בשלב 6.
הערה: לאחר שיבוט חודש אחד גובר צריך להיות ברור על ידי התבוננות אגרגטים של תאים עגולים thaבדרך כלל לא לשקר באמצע התחתית העגולה היטב. - בשלב זה, לשנות את התקשורת באותו אופן שבו השבועות הקודמים, אבל רק עם RPMI 1640 מדיה מלאה. אינדיקטור טוב לדעת ברגע הנכון כדי לשנות את התקשורת הוא צבע התקשורת, אם זה הופך להיות תאים צהבהבים צריכים חילופי תקשורת.
- כאשר 96-גם צלחות הם מכילים שיבוטים גדולים (5 x 10 5 תאים כ), להעביר אותם ולשטוח של 24 גם צלחת. להוסיף 300 μl של 1640 מדיה RPMI מלאה לבאר החדשה. Resuspend השיבוט גדל 96-היטב, על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים, ותאי העברה לבאר החדשה, הפצה הומוגנית. הוסף מדיה חדשה בעת צורך.
- כאשר בארות של צלחת 24 גם מלאות בתאים (כ 5 x 10 6 תאים), להעביר ולשטוח של 6-גם צלחת. הוסף 2 מיליליטר של RPMI 1640 מדיה מלאה לחדש גם. Resuspend התאים בצלחת 24 גם על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים, ולהפיץ אותם homogeשלו זמנית בבאר החדשה.
- הוסף מדיה בעת צורך. אם תאים לא להישמר בתרבות, גלולה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות על RT. אחסן את supernatants לבדיקת ELISA. שטוף את הכדור של תאים פעם אחת עם 1 x PBS, צנטריפוגות שוב ב 400 XG במשך 5 דקות, ומאוחסן יבשים ב -80 ° C עד מיצוי RNA.
- כאשר התאים בצלחת 6-גם להיות מחוברות (כ 20 x 10 6 תאים), מעביר לצלחת תרבות 60 מ"מ. הוסף 4 מיליליטר של 1640 מדיה RPMI מלאה לצלחת החדשה. Resuspend תאי צלחת 6 היטב ולהעביר אותם כפי שנעשה הוא על שלבים 5.9 ו5.10.
- הוסף מדיה חדשה בעת צורך. בשלב זה, להקפיא תאים ב10-30,000,000 מיליליטר / 90% בסרום עגל עוברי ושל 10% DMSO. אם כמויות גדולות יותר של תאים רצתה, להמשיך הרחבת השיבוטים בצלחות משטח גדולות יותר.
6. ELISA לנוגדני IgG איתור
- לוותר 50 μl / גם בo צלחת ELISAF העז F (ab) נוגדן Fc 2 אנטי-אנושי בדילול 1 200 במאגר ציפוי. חיץ ציפוי מכיל 50 מ"מ Na 2 CO 3 pH 9.6.
- לאטום את הצלחות עם מדבקה פלסטיק, ודגירת השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לחלופין, דגירה על 4 מעלות CO / N.
- לשטוף היטב כל 6 פעמים עם 200 μl של חיץ כביסה. חיץ כביסה מכיל Tween-20 0.05% ב 1 x PBS. אל תיגעו או לגרד את פני השטח היטב, שבי הנוגדן שקשור.
- לחסום עם חיץ חסימה, 100 μl / טוב. חסימת חיץ מכילה 4% מחלב יבש ללא שומן בPBS. חותם את צלחת דגירה השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- אין לשטוף. בטל חיץ חסימה וסטירת צלחת 3 פעמים במהופך על מגבת נייר כדי להסיר נוזל שיורי.
- דגירה supernatants והסטנדרטים "שיבוטים.
- למבחן ראשון, לדלל supernatants שיבוט שהושג בשלב 5.6 או 5.7 1/3 בRPMI. לסטנדרטים לדלל עם פתרון אנושי בינוני RPMI IgG לקבל: 1,000 ng /מיליליטר, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62.5 ng / ml, 31.25 ng / ml, 15.6 / מיליליטר וריק ng. השתמש 50 μl / טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לנתח דילולים נוספים של supernatant השיבוט "כדי לבחון את זיקת הנוגדן, כגון 1/10 או 1/100.
- לשטוף כפי שנעשה בשלב 6.3.
- השתמש 50 μl / טוב של F העז (ab) 2 peroxidase IgG Fc אנטי אנושי מצומדת בדילול 1: 20,000 במאגר דגירה. חיץ דגירה מכיל BSA 1% ושל 0.02% Tween 20 ב1x PBS. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
- לשטוף כפי שנעשה בשלב 6.3.
- הוספת 100 μl פתרון גם מצע / מכיל 3,3 0.1% ", 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB). דגירה 10 דקות עד לקבלת צבע כחולה יציבה בבארות. היזהר; לא לחכות יותר מדי זמן!
- לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl של 2 MH 2 SO 4. מדוד את הספיגה ב 450 ננומטר, תוך 30 דקות לאחר הפסקת התגובה.
הערה: של כל השיבוטיםupernatants עם 3 סטיות תקן מעל הריק ייחשב חיובי לנוגדני IgG אנושיים. לאישור של השיבוטים החיוביים ELISA זה יש לחזור לפחות שלוש פעמים בsupernatants שונה של אותו השיבוט. גם להשליך את האפשרות של תגובתיות צולבת נוקבים מומלץ כדי להבטיח שאין אות כאשר supernatants מודגרת בציפוי אבל חסם בארות. בשלב זה, assay זיהוי למסך סגוליות אנטיגני של הנוגדנים של עניין יכול להתבצע לפני כדי להמשיך לסעיף 7.
7. בידוד RNA והראשון סטרנד cDNA סינתזה של המשובטים IgG הפקה
- ברגע שהייצור של IgG אושר על ידי ELISA, לחלץ את RNA של השיבוט.
- לחילוץ RNA מהתאים גדלו בצעדים 5.7 או 5.9, השתמש בערכה עילי סינתזת cDNA III תאים ישירה, המאפשר קבלת DNA מ10,000 תאים לתא אחד.
- לחילוץ RNA מLarכמויות ger של תאים, או מהגלולה מאוחסנת בצעד 5.11 להשתמש בערכת בידוד RNA הטהורה הגבוהה. מערכות אחרות להפקת RNA יכולות להיות גם מתאימות בשלב זה. בצע את ההוראות של היצרן.
- למספרים סלולריים בין 1 x 10 6 ו 1 x 10 4 שימוש במערכת השעתוק לאחור, בעקבות ההוראה של היצרן. גם מערכות אחרות לסינתזת cDNA גדיל הראשון ניתן להשתמש.
8. 1 st ו- 2 nd PCR להגברה של הכבד ושרשרות אור של המשובטים תאי B IgG-ייצור
- עם cDNA של השיבוטים התא, שהושגו בשלב 5.6 ו -5.7 וחיובי בELISA IgG בשלב 6, לבצע PCR עם פריימרים מפורטים בטבלה 1.
- הגדרת PCRs העצמאי לכל שרשרת כבדה, קאפה ולמבדה IgG. הפוך פתרון מניות עם קדימה הפוך פריימרים בריכוזים שווים. הוסף אותם לתגובה ב0.4 מיקרומטר ריכוז סופי. </ Li>
- השתמש 1 μl של סינתזת cDNA לבצע ST PCR 1. כאן, לבצע 20 תגובות μl באמצעות הוראות יצרן Takara תקי. לחלופין, להשתמש polymerases אחר.
- מניחים את רח PCR 1 בתנאי המחזור הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; (50 מחזורים של: 94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות, לתת לו להתקרר על 4 מעלות C.Include ריק בתגובה, כדי לזהות זיהומים אפשריים.
- הכן TBE 1x (89 מ"מ טריס-borate ו -2 מ"מ EDTA). בהיקף של של 1x TBE 100 מיליליטר להוסיף 1 גרם של agarose (1% agarose ג'ל). מחממים את הפתרון במיקרוגל במשך כ 1 דק ', עד agarose מקבל מומס. לאחר מכן להוסיף 4 μl של 10 מ"ג / מיליליטר ethidium ברומיד (או צבע DNA שווה ערך) ולערבב.
- יוצקים את התוכן במגש ולחכות עד שמקבל polymerized. הפעל 5 μl של תערובת PCR בג'ל לדמיין את הלהקות. בר שרשרת כבדים צריך להיות סביב 400-550 נקודות בסיס, ואילו שרשרת אור צריכה להיות סביב 300-400 נקודות בסיס. אם הלהקות אינן מזוהות, להמשיך גם עד 2 nd PCR.
- השתמש 1 μl של PCR הראשון לערבב לבצע 2 nd PCR. השתמש באותו ריאגנטים שבשלב 8.2, אבל שימוש בתמהיל המתאים של צבעי יסוד (ראו טבלה 1). ל-2 PCR להשתמש בתנאים הבאים: 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; (50 מחזורים של: 94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות; 56.5 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 55 שניות); 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות; לתת לו להתקרר על 4 מעלות צלזיוס. כולל ריק בתגובה, כדי לזהות זיהומי PCR אפשריים.
- הכן agarose ג'ל כפי שתואר ב8.5. הפעל את ג'ל לדמיין את מוצר ה- PCR כמו ב8.5.1 השתמש amplifications המכיל שברי הגודל הנכונים עבור שיבוט בשלב 9 ולייצר את הנוגדנים בשלב 10.
- רצף ה- DNA, באמצעות 10 תגובה μl מכילה: של nd PCR 2, 0 100 ng.2 מיקרומטר של פריימר או תערובת פריימר, 1 μl של שליחות קטלנית ו1 μl למאגר. בצע את תגובת הרצף בתנאים הבאים: (25 מחזורים של: 96 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות; 50 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, ועד 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות); 60 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות; לתת לו להתקרר על 4 מעלות צלזיוס.
- לטהר את תגובות רצף עם עמודות G50 microspin הבאות הוראות יצרן. להעריך את הרצפים של קשירה במנתח רצף אוטומטי כפי שתואר לפני 18. Electropherograms צריך להיות נקי ומתאים לרצף אימונוגלובולינים יחיד.
הערה: אם מוצרי ה- PCR להראות רצפי אימונוגלובולינים ברורים או מעורבים, אנא שקלו לשבטם באמצעות מערכת TopoTA, להשיג רצפים מבודדים ולאחר מכן המשך לשלב 9.
9. שיבוט ורצף של שרשרות כבדות והקלות של השיבוטים הפקת IgG
- הכן 1 מיקרוגרם של ה- DNA של וקטורי pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-HL2 וpFUSEss-CHIg-hG1.
- לעכל וקטורים אלה עם אנזימי ההגבלה המתאימים. השימוש Eco RI וBSI WI לpFUSE2ss-CLIg-hk, אקו RI וAVR השני לpFUSE2ss-CLIg-HL2, ואקו RI וNhe אני לpFUSEss-CHIg-hG1. השתמש 3 יחידות של כל אנזים הגבלה ל1 מיקרוגרם של ה- DNA של וקטור.
- לעכל עם אנזים אחד ולטהר את המוצר מתעכל עם ערכת טיהור PCR. לעכל עם האנזים השני ולטהר עם ערכת חילוץ ג'ל (על פי הפרוטוקול של היצרן). חותך את הקטע של ריבית מagarose ג'ל. הכן ג'ל agarose כמו בשלב 8.5.
- לעכל 2 nd PCR מוצרים של שיבוט IgG הפקה: Eco RI וBSI WI להגברת שרשרת קאפה, אקו RI וAVR השני להגברת שרשרת למבדה, ואקו RI וNhe אני להגברת שרשרת כבדה. לעכל עם אנזים אחד ולטהר את המוצר מתעכל עם Pערכת טיהור CR. לעכל עם האנזים השני ולטהר את המוצר מתעכל עם ערכת טיהור PCR. השתמש באותה יחידות של אנזימים וכמות ה- DNA כמו בשלב 9.2.
- ולקשור את שברי PCR הפנימיים של הווקטורים עם המלצות האנזים 16 ° CO / N של היצרן הבא T4 DNA. היחס משמש צריך להיות 1: 2 (וקטור: הוספה).
- השתמש 1 μl של קשירה להפוך חיידקי DH5α. עקוב תנאי 'יצרן DH5α לשינוי. מורחים חיידקים בצלחות blasticidin או Zeocin, תלוי בסוג של וקטור בשימוש. דגירה צלחות O / N על 37 מעלות צלזיוס.
- לגדול מושבות אחת, ולחלץ DNA עם ערכת miniprep, בעקבות הוראות יצרן ". השתמש למושבה אחת לגדול והפקת DNA של היצרן, המלצות מערכת miniprep DNA. לנתח אותם על ידי עיכול עם האנזימים המשמשים להכנת וקטורים ומוסיף כבצעדי 9.2 ו -9.3.
- רצף ה- DNA, על ידי usinשל הווקטור ז 100 ng כפי שנעשה בשלבים 8.8 ו -8.9.
10. ייצור של נוגדנים בתאי HEK
- לגדל תאי HEK בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, 1% L-גלוקוז, פניצילין 1% / streptavidin (DMEM +) לconfluency של 75% בצלחת תרבית תאי 150 מ"מ. לבצע במכסת מנוע צעדים 10.1-10.7.
- לפני transfection, להחליף את המדיום למדיום כמו קודם, אבל ללא סרום עגל עוברי.
- לכל transfection הכבד, שרשרת אור, להכין תערובת transfection עם 2.5 מיליליטר של DMEM (ללא סרום), 9 מיקרוגרם של הווקטור עם השרשרת הכבדה, 6 מיקרוגרם של הווקטור עם שרשרת האור, ושל polyethylenimine 100 μl (PEI פתרון) (ממניות / μl 1 מיקרוגרם). לדגור על RT במשך 15 דקות.
- בעדינות להוסיף 2.5 מיליליטר של תערובת transfection מוכנה בשלב 10.3 לתאי HEK בצלחת. רוק הצלחת להפיץ הומוגנית.
- בcubate התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות.
- לשנות את התרבות בינונית עד בינוני ללא סרום עגל עוברי.
- לאסוף הבינוני מהצלחות 4 ימים לאחר מכן.
הערה: הנוגדנים בתקשורת יכולים לשמש כדי לאפיין תגובתיות שלהם במבחנת in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gating המיון לאחר מכתים תאים חיוביים CD22 וIgG מוצג באיור 1 בתמונה זו השטח של התאים כפולים החיוביים -. תאי B מייצרים נוגדני IgG - נבחר כדי למיין את כל תאים אלה בצינור נפרד. בניתוח, כ -1% מכלל PBMCs מתאים לאוכלוסייה החיובית הכפולה הזה. מספר התאים ממוינים המתקבלים יהיה תלוי במספר התאים המתקבלים בסעיף 1.
התוצאות השונות לאחר 5 שבועות של ההנצחה EBV וCPG גירויים (ODN2006) מוצגות באיור 2 זיהוי של השיבוטים גדלו קל.; יש תאים מזינים Wi38 צורת פיברובלסטים מוארכת יותר, ושיבוטי תא B מופיעים תאים עגולים כקטנים מאוד מתיישנים התקבצו באמצע הצלחת רב גם תחתית העגולה. בשלב זה, ניתן לראות כי כמה שיבוטים להתחיל לגדול. עם זאת, המהירות הגוברת יכולה להיות משתנה וכמובן חלק מcontai הבארותנינג הנציח תאים לא יכולים להיות כל תאים גדלו בכל.
Supernatant של השיבוטים גדלו נבדק בELISA לזיהוי נוגדנים כפי שמוצג בטבלה 2. בELISA זה עקומה סטנדרטית עבור IgG נבדקה, יחד עם supernatant של השיבוטים ואת החסר. שיבוט חיובי נחשב כאשר הערך בELISA הוא 3 סטיות תקן מעל הערך הריק. הערכים 'השיבוטים שליליים נמצאים תחת 3 סטיות תקן של ריק. לאישור, שיבוטים חיוביים צריכים להיות חיוביים בELISA לפחות שלוש פעמים בsupernatants שונה של אותו השיבוט ואם אפשר אומת על ידי שיטת הקרנה נוספת.
הרצף של נוגדן IgG אנושי הושג יישום השלבים המתוארים בכתב היד הזה מלא מוצג באיור 3. רצף זה הושג לאחר שיבוט זוג שרשרת כבדה ומבדה אימונוגלובולינים מתא B מורחב clonally. משתנהND אזורים קבועים של השרשרת הכבדה וקלה יכולים להיות מאופיינים בטכניקה זו. לאחר קבלת הרצפים, ניתן לשכפל רצפי נוגדנים ומיוצרים במבחנה בתרביות תאי HEK.
איור 1. ניתוח תזרים cytometric של CD22 + וIgG + תאים מתאי הדם היקפיים mononuclear אנושיים. (א) בחירה של האוכלוסייה של תאי חיים מוצג בP1. עלילת פיזור קדימה (B). עלילת פיזור (C) גודל. (ד) ציר Y תערוכות תאים מופרדים באנטי-CD22-PerCP ועל ציר X מופרד על ידי IgG-PE. כיכר P4 מציינת את חלק התא שכבר מסודרים (CD22 +, IgG +) והתאושש לתרבות. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זהדמות.
איור 2. תמונת נציג תא B הונצחה שיבוטים ב96-גם צלחת לאחר 5 שבועות של התרבות. (א) ובשום הנצחה זה נצפה לאחר 5 שבועות, אבל יכולים להיות שנצפו wi38 מוקרן תאים מזינים. (ב) שיבוט גדל לאט נצפה בזה היטב, עם אגרגטים עגולים זעירים באמצע. שיבוט (C) גדל במהירות מראה עגול אגרגטים של תאי B הונצחו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. רצפי הדמות אנושיים נוגדנים של זוג כבד ושרשרת קלה משיבוט B תא אנושי הנציח, F5.2, המציין V CDR1, CDR2 ורצפי CDR3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| 1 פריימרים st PCR | ||
| קדימה (5'-3 ") | הפוך (3'-5 ') | |
| IgG | 5 'ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG 1 L-VH | 3 'Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC |
| '5 L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG | ||
| 5 'CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG L-VH 4/6 | ||
| '5 L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG | ||
| κ | ATGAGGSTCCCYG 5 'L Vκ 1/2CTCAGCTGCTGG | 3 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA 'Cκ 543 |
| 5 'L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG | 3 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT 'Cκ 494 | |
| 5 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG 'L Vκ 4 | ||
| 5 'פאן Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG | ||
| λ | 5 'L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG | 3 'Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG |
| 5 'L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG | ||
| 5 'L Vλ GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG 3 | ||
| GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG 5 'L Vλ 4/5 | ||
| 5 'L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG | ||
| 5 'L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG | ||
| 5"L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG | ||
| 2 פריימרים nd PCR | ||
| קדימה (5'-3 ") | הפוך (3'-5 ') | |
| IGH | 5 'EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG | 3 'NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG |
| 5 'EcoRI VH1 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG | 3 'NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG | |
| 5 'EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG | 3 'NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG | |
| 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT 'EcoRI VH3 23 GTTGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI 4 VH 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG | ||
| 5 'EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG | ||
| 5 'EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG | ||
| 5 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT 'EcoRI VH3 33 GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT 'EcoRI VH4 39 GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG | ||
| κ | CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA 5 'EcoRI Vκ 1 5 CCCAGTC | 3 'BsiWI 1 Jκ 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC |
| 5 'EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT | 3 GCCACCGTACG 'BsiWI Jκ 2 TTTGATCTCCAG CTTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC | 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT 'BsiWI Jκ 3 TTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 4 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG 1 ACCCAGTC | ||
| 5 'Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT EcoR1 GACKCAG | 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT 'AvrII Jλ 1 עד 3 TGGTCCC | |
| 5 'Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC EcoR1 TGACTCAG | 3 Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC AvrII ' TGGGTTCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG | 3 'AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 4 Vλ 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA | 3 'AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG | 3 'AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT | |
| 5 'EcoR1 7 Vλ 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| .076 | 0.077 | 2.003 | 0.080 | 0.138 | .102 | 0.188 | .338 | 0.040 | 2.041 | .051 | 0.081 | |
| B | 2.011 | 0.085 | .074 | .069 | 0.081 | 0.122 | 0.372 | 2.133 | 0.119 | .097 | .072 | .072 |
| ג | .068 | .179 | .091 | .073 | 0.077 | .097 | .606 | 1.882 | 0.081 | 2.071 | .094 | 0.075 |
| D | .063 | 0.070 | 0.065 | 0.071 | 0.082 | 2.071 | .339 | 2.089 | .076 | 0.086 | 0.066 | .069 |
| E | 1.921 | 0.077 | 0.065 | 0.085 | 0.095 | 1.968 | 1.910 | 0.122 | .072 | 0.070 | 0.065 | 0.066 |
| F | .113 | .068 | 0.066 | 0.082 | .088 | 0.090 | .460 | 0.070 | 0.079 | .952 | 0.098 | 0.065 |
| G | 2.041 | 2.108 | 1.472 | .665 | .331 | .194 | 0.123 | .094 | EFT "> 0.080.072 | 0.070 | .072 | |
| H | 2.146 | 2.132 | 1.634 | .665 | .341 | .178 | 0.132 | .094 | 0.082 | 0.080 | .074 | .068 |
| ng תקנים / μl | 1,000 | 500 | 250 | 125 | 62.5 | 31.25 | 15.6 | 7.8 | 3.9 | 1.95 | 0.975 | 0 |
>
2. תוצאות שולחן נציג של IgG הקרנה על ידי ELISA. Clone supernatants נמצאות בA1-A10, B1-B10, C1-C10, D1-D10, E1-E10, F1-F10. כדורי סרק בA11, B11, C11, D11, E11, F11, A12, B12, C12, D12, E12, עקומת F12.Standard משוכפלת: G1-G12 וH1-H12. הריכוז המתאים של נוגדנים בכל כפול מוצג below.Positive או IgG שיבוטים ייצור מוצגים באפור כהה. שיבוטים ייצור שליליים או אי-IgG מוצגים בצבע אפור בהיר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב היד הזה, את כל השלבים לייצור נוגדני IgG מPBMCs האנושי מוצגים בפירוט. פרוטוקול זה כולל כמה יתרונות על פני שיטות שפורסמו בעבר. אחד היתרונות הוא שהנוגדן מיוצר שומר כבדות וקלות הרשתות המתאימות לזוג המקורי בשיבוט תאי B. זיהוי של נוגדני IgG יכול להיעשות בכל סוג של תורם אנושי, ואין צורך בהחרפת התגובה החיסונית עקב חיסון 5. השימוש בwi38 שורת תאי פיברובלסטים כתא מזין, מאפשר זיהוי מהיר יותר של השיבוטים גדלו, שכן הם שונים מורפולוגית וקלים מאוד להבחין, בהשוואה לPBMCs משמש כתא מזין שבתוארה קודם לכן עבודות 1,6- 8. יתר על כן השימוש בwi38 כתא מזין מעדיף את הקפאת כמויות גדולות של aliquots תא שיכול להיות מופשר בקלות ובתרבית לפני כל ניסוי.
אחד Critצעדי iCal בפרוטוקול זה הוא החומר מוצא: PBMCs. אם הדם כבר מחכה יותר מדי זמן לצנטריפוגה, או לאחר המיצוי של PBMCs, הם אינם מאוחסנים בתנאי ההקפאה המתאימים; כמספר כזה של תאי קיימא יופחת, יחד עם מספר IgG תא B ייצור שיבוטים שהתקבלו. מסיבה זו, חילוץ מוקדם ושימור טוב של PBMCs מומלץ לתוצאה מוצלחת. מספר השיבוטים ייצור IgG יהיה מוגבל למספר PBMCs בתחילת הניסוי. מספרים גבוהים יותר של PBMCs ייתן מספרים גבוהים יותר של שיבוטים ייצור IgG וייצור נוגדנים שונים. עוד צעד קריטי הוא השיבוט של שברי PCR של רשתות קלות וכבדות של הנוגדן. אם קשירה היא לא מוצלחת לאחר מספר ניסיונות, צעד נוסף של שיבוט מוצר ה- PCR 2 nd במערכת TopoTA מומלץ. העיכול של הכנס עם האנזימים המתאימים יכול להיות קל יותרבוקטור TopoTA, לקשירה הבאה בוקטורי ביטוי pFUSEss.
טכניקה זו יכולה להיות מועברת לכל סוג של רקמה האנושית שבו תאי B אנושיים מועשרים 3. זה גם יכול להיות מיושם על המחקר של סוגים אחרים של נוגדנים, רק על ידי שינוי הנוגדנים שכותרתו משמשים למיון (נוגדנים נגד IgM, IgE, IgA או IGD), עיצוב פריימר לPCR, והווקטורים להביע. המחקרים של נוגדנים אלה יכולים להיות עניין של להבין, תגובות חיסוניות ראשוניות, הפרשת נוגדן רירית ופרופילי אלרגיה, בין יתר.
לסיכום, יש לנו תארנו טכניקה לייצר נוגדנים חד שבטיים אנושיים רקומביננטי IgG שמשאיר זוגות שרשרות הכבדים וקלים של אימונוגלובולינים האדם שלמים. הטכניקה זו שימושית וקלה לביצוע החל מדגימת דם. הנוגדנים חד-שבטיים שהושגו באמצעות שיטה זו הם שעשוי להיות שימושיים במחקרים על חיסון אנושיתגובות. יתר על כן, נוגדנים חד שבטיים מיוצרים בשיטה זו עשויות להיות נקודת התחלה טובה לפיתוח חיסוני תרופות למצבים פתולוגיים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
חוזה מחקר מיגל סרווט (ISCIII CD14 / 00,032) עד (GN-G.). מלגה מארגון הולנד ל" בית ספר למוסמכים של Translational תכנית Neuroscience "מחקר מדעי (022005019) ל( CH).
מענקים מPrinses יאטריקס חטיבות (פרויקט WAR08-12) וFrançaise אגודת contre les Myopathies ל( PM-M.); כמו גם על ידי מלגת Veni של ארגון הולנד למחקר מדעי (916.10.148) מלגה של קרן המוח של הולנד (FS2008 (1) -28) וPrinses יאטריקס חטיבות (פרויקט WAR08-12) (לML ).
אנו מודים יאספרס Jozien על עזרתה בB-מיון התא על ידי cytometry זרימה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2 μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µl, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
