Introduction
Цель этой статьи заключается в описании подробно методику для создания и описания человека IgG моноклональные антитела, полученные из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).
Интерес к изучению человеческих антител вырос в различных областях исследований. В частности, многие исследовательские группы заинтересованы в патологии, вызванной аутоантител 1-3. Мы клонированы и охарактеризованы патогенные аутоантитела 1. Исследование аутоантител может помочь определить свои цели и разработать терапевтические стратегии, например, с использованием антител конкурентов 4. Кроме того, изучение человеческих антител также может представлять интерес в других областях научных исследований, т.е. оценить иммунный ответ после вакцинации 5, чтобы охарактеризовать профиль антител лиц, которые подвергались и стали устойчивыми к определенным возбудителей 6 или исследование, которое антитела вестественно репертуар 7,12.
Некоторые методы были разработаны для создания рекомбинантных человеческих моноклональных антител 8-12; большинство из них используют фага дисплей и В-клеток увековечение. Использование фагах широко применяется для открытия новых антител 13. Однако она имеет существенный недостаток, а именно, что тяжелой и легкой цепи пары иммуноглобулина человека стать диссоциируют в процессе. Производство гибридом с клетками человека или трансформации В EBV преодолевает этот недостаток.
Мы используем инфекции тимуса В-клеток с EBV в сочетании со стимуляцией поликлональные B клеток с помощью Toll-подобных рецепторов (TLR 9-9) 6,12.
В этой статье мы подробно описать технологию, которую мы используем для развития IgG антител человека, с полным обзором всех шагах от изоляции РВМС в пробирке поколения антител в в. Этопротокол может быть использован для анализа любого типа профиля человеческого IgG. В нашей лаборатории, В-клетки, продуцирующие IgG антитела были успешно отделен от остальной части РВМС после сортировки. Пятьдесят упорядоченные B клетки 8, то можно покрыть в несколько луночных планшетах и увековечен ВЭБ и TLR-9 активации для клональной экспансии отдельных клеток В. В питающих клеток, фибробласты из ткани эмбриональных легких человека были использованы, клеточной линии WI38, что облегчает визуализацию иммортализованных В-клеток. Из этих В-клеток, последовательности тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина могут быть получены с помощью ПЦР, и гены антител клонируют в "иммуноглобулина G векторов экспрессии и производится в пробирке. Используя эту технику, одиночные антитела с точно таким же антитела последовательности, найденной в донора могут быть изучены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Информированное согласие было получено от участников исследования. Исследование было одобрено комитетом по этике институциональной.
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)
- Центрифуга 25 мл гепаринизированной крови участников на 900 мкг в течение 15 мин, как можно скорее после экстракции крови. Если есть меньше крови, уменьшать реагентов соответственно. Выполните все следующие шаги в капюшоне.
- Передача сыворотку в чистую пробирку. Он может быть использован на последующих этапах для замораживания РВМС или в случае аутоиммунных пациентов, чтобы проверить аутоантитела.
- Развести крови с 10 мл RPMI 1640 среде и ресуспендирования клеток с помощью пипетки вверх и вниз.
- Добавить 15 мл раствора, содержащего polysucrose и натрия диатризоат (1,077 г / мл) в новую пробирку на 50 мл.
- Осторожно слой кровь в верхней части раствора в шаге 1.4, принося два отверстия трубок тесном togetнее до тех пор, пока две жидкости очень медленно приходят в контакт, а затем сливают суспензию РВМС медленно сверху 50 мл пробирку. Этот шаг очень важно иметь хорошее разделение на МНПК.
- Центрифуга трубки, полученной на стадии 1.5 при 400 х г без тормоза при комнатной температуре в течение 20 мин.
- После центрифугирования восстановления с пипеткой на белое кольцо, которое появляется в средней части трубы, содержащей РВМС.
- Промыть клеток с 25 мл RPMI 1640.
- Центрифуга 300 мкг при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Удалите супернатант и промыть клетки с 10 мл RPMI 1640. Центрифуга снова, как в шаге 1.9.
- Граф МНПК с камеры Neubauer, как сообщалось ранее 14.
- Обработать РВМС, как в разделе 2, или хранить их для последующего использования следующим образом: 10 млн МНПК для замораживания в криопробирку трубки, разведенного в 1 мл 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 90% сыворотки, полученной на стадии 1.2. Замораживание постепенно и в течение длительного СТОярость в жидком азоте.
2. Окрашивание МНПК для сортировки CD22 + и IgG + сотовым цитометрии
- Пластина РВМС в 25 см 2 клеточной культуры колбы с 6 мл полной RPMI 1640 (с добавлением L-глутамина, 10 мМ HEPES буфера, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки) и пусть им восстановиться O / N в инкубаторе при 37 ° С в 5% СО 2.
- Блок стерильные пробирки FACS стерильной 4% альбумина забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) раствора O / N. Вымойте трубы в два раза с PBS и заполнить их с 500 мкл полной RPMI 1640. Используйте эти трубы для восстановления клеток после сортировки.
- Сбор РВМС в трубке и центрифуге при 400 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в буфер маркировки (см шаги 2.5 и 2.6) и считать их 14. Буфер маркировки стерильна 2% фетальной бычьей сыворотки и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в РBS.
- Подготовьте 3 флуоресценции активированных сортировки клеток (FACS) трубы с 10 5 клеток и ресуспендируют каждый их в 100 мкл буфера маркировки. Эти трубы будут служить для определения ворота сортировки.
- В первую пробирку добавляют 5 мкл анти CD22 антитела PerCP (рекомендуется в техническом описании изготовителя), во втором трубки 20 мкл анти IgG PE (рекомендуется в техническом описании изготовителя), и ничего в третьем трубки. Инкубируют на льду и в темноте в течение 30 мин.
- Ресуспендируют 5 миллионов клеток в 200 мкл буфера маркировки в FACS трубы и добавить 10 мкл анти CD22 PerCP и 40 мкл анти IgG PE. Инкубируйте клетки на льду и темноте в течение 30 мин. Если сортировка большим числом клеток желательно, наращивать все реагенты.
- Центрифуга клетки при 400 мкг с низким тормоза в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Декантировать супернатант мягко.
- Ресуспендируют клеток в 500 μл маркировки буфера. Центрифуга клетки при 400 мкг с низким тормоза в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите шаги 2.7 и 2.8
- Декантировать мягко супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл полной среды RPMI.
- Пропускают клеток через фильтр 0,45 мкм. Клетки готовы сортировать.
3. Сортировка В-клеток CD22 + и IgG +
- Используйте 3 Контрольные пробирки, чтобы установить жизнеспособность клеток. В управление без окрашивания, используйте вперед и размер точечный график, чтобы определить лимфоцитов стробирования. Управление с CD22 PerCP и анти-IgG PE служить для установления ворота, и сортировки ворота. Выполните следующие данные, представленные ранее 15.
Примечание: ворота набор предельных значений (границы), которые служат для выделения конкретной группы цитометрических событий, в нашем случае клеток, из большого множества. В случае сортировки ворот пределы значения позволяет извлекать из цитометрических событий, клеток, которые внутриграницы, определенные: CD22 +, и IgG +. - В пробирку в сортировке, использовать блокированные трубы с 500 мкл полной среды RPMI 1640, полученный на стадии 2.2.
- Действуйте для сортировки дважды положительной 15: CD22 + IgG +. Обратите внимание на конечное число клеток в каждой состоянии. Пластина сортируются клетки в верхней части фидерных клеток как можно быстрее.
4. Облучение фидерных клеток
Примечание: Выполните подготовку фидерных клеток между 1 - 3 дней до сортировки. По крайней мере, 5000 WI38 клетки необходимы на лунку в 96 круглой пластины скважины. Выполните шаги 4.1, 4.2 и 4.4 в капюшоне.
- не культивировать WI38 клеток при 37 ° С и 5% CO 2 в полной среде RPMI 1640 (такой же, как для РВМС), пока желаемый номер ячейки достигаются.
- Облучают их в 50 Серых, в соответствии с протоколом, описанным ранее 16 лет. Выполнение облучение после того, как WI38 клетки были трипсином и ресуспендировали в Complete RPMI среда, или WI38, прикрепленной к культуральной колбы и обрабатывают трипсином после облучения. Следуйте способ трипсинизации указанную поставщиком WI38 клеток. Облучать количество клеток, необходимых для покрытия лунок для посева IgG + В-клеток (1% от общего РВМС рассчитывали на шаге 1.11).
- Пластина 90 мкл, содержащие 5,000 облучают WI38 клеток в каждую лунку круглой пластины 96 а. Оставьте скважин во внешнем ряду пластины пустой (потому что они испаряются быстрее), и использовать только 60 скважин в середине пластины для посева клеток. Заполните внешние скважин, которые кадрирования пластину с 200 мкл PBS.
- Поместите их в термостате при 37 ° С в 5% СО 2, до тех пор, пока это необходимо.
5. Покрытие Сортировка МНПК, ВЭБ инфекция и роста
- Развести отсортированные МНПК, к пластине 50 клеток в 50 мкл RPMI 1640 полной среде на лунку в 96 круглой пластины хорошо (ранее покрытием остроумиеч WI38 облученных клеток). Выполните шаги в капюшоне, оборудованной для EBV работы.
Примечание: инфекция 50 клеток на лунку оптимизирован и увеличивает правдоподобия для получения моноклонального антитела 8, однако, рекомендуется, чтобы убедиться в этом с помощью ПЦР, как описано выше 1,6. - Добавить 60 мкл супернатанта (EBV, содержащие 3 - 4 х 10 8 вирусных копий / мл) в каждую лунку в 96-луночный планшет круглые 17. Внимание должно быть принято в течение EBV работы.
- Добавить 1 мкг / мл CpG (ODN2006) на лунку.
- Оставьте клетки в инкубаторе при 37 ° С в 5% СО 2.
- Визуально монитор клон растет под микроскопом после одной недели.
Примечание: Некоторые примеры роста В-клеток можно увидеть ниже в разделе результатов. Обратите внимание, что темпы роста клонов могут отличаться, и дополнительное время может потребоваться, чтобы начать видеть некоторые клетки растущего массу в середине хорошо. - После 1-го две неделис монитора клон растет под световым микроскопом и перейти к первому обмен СМИ. Медленно пипеткой 90 мкл среды из верхней части скважины и собирают в чистую 96-луночного планшета. (В-клетки лежат на дне колодца, так что нет никакого риска для аспирации их).
- Добавить в каждую лунку по 100 мкл полной RPMI 1640 среде с добавлением 1 мкг / мл CpG (ODN2006) и 50 Ед / мл IL-2. Если клоны растут, анализировать этот первый обмен СМИ по ELISA, как в шаге 6.
- Монитор клон растет и изменить СМИ после 3-го и 4-й недели снова растут, принимая 90 мкл СМИ и добавлением 100 мкл полной RPMI 1640 с добавлением 1 мкг / мл CpG (ODN2006) и 50 ед / мл Ил-2. Используйте собранную супернатант контролировать IgG ELISA производство по, как в шаге 6.
Примечание: Через месяц клон растет должно быть очевидно, наблюдая агрегаты круглых клеток Thaт, как правило, лежат в середине круглым дном хорошо. - На этом этапе, изменить носитель таким же образом, что предыдущие недели, но только с полной среде RPMI 1640. Хороший показатель, чтобы узнать правильный момент, чтобы изменить медиа является цвет массовой информации, если она становится желтовато клетки должны обмен СМИ.
- При 96-луночные планшеты, содержащие большие клонов (приблизительно 5 × 10 5 клеток), передавать их на плоской лунку 24-луночного планшета. Добавить 300 мкл полной RPMI 1640 с новой скважины. Ресуспендируют 96-а растущий клон, с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и передачи клеток в новой скважины, распространяющих однородно. Добавить при необходимости новых средств массовой информации.
- Когда скважины пластины 24-луночного полны клеток (примерно 5 х 10 6 клеток), трансфер в плоской лунку 6-луночного планшета. Добавить 2 мл полной RPMI 1640 с новой скважины. Ресуспендируют клеток в 24-луночного планшета с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и распространять их homogeменно в новой скважины.
- Добавить при необходимости средства массовой информации. Если клетки не будут поддерживаться в культуре, осаждения клеток при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Храните супернатантами для тестирования ELISA. Промыть осадок клеток один раз 1 х PBS, центрифугируют снова при 400 х г в течение 5 мин, и хранить в сухом при температуре -80 ° С до экстракции РНК.
- Когда клетки в 6-луночный планшет сливаются (примерно 20 × 10 6 клеток), переносят в 60 мм пластины культуры. Добавить 4 мл полной RPMI 1640 с новой плиты. Ресуспендируют клеток в 6-луночный планшет и передавать их, как это сделано в шагах 5,9 и 5,10.
- Добавить при необходимости новых средств массовой информации. На этом этапе, заморозить клетки на 10 - 30 млн / мл в 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% ДМСО. Если большие количества клеток хотел, продолжают расширение клонов в больших поверхностных пластин.
6. ИФА для выявления антител IgG
- Разлить 50 мкл / лунку в пластины ELISA Oе козел F (аb) 2 анти-Fc-антитела человеческого разбавляют 1 200 в буфере для нанесения покрытия. Покрытие буфер содержит 50 мМ Na 2 CO 3 рН 9,6.
- Уплотнение пластин с пластиковой наклейке, и инкубируют 1 час при 37 ° С. В качестве альтернативы, инкубируют при 4 ° CO / N.
- Промыть каждую лунку 6 раз 200 мкл промывочного буфера. Промывочный буфер содержит 0,05% Твин-20 в 1 х PBS. Не трогайте и не царапайте поверхность а где антитело связанный.
- Блок блокирующим буфером, 100 мкл / лунку. Блокирующий буфер содержит 4% обезжиренным сухим молоком в PBS. Уплотнение пластины и инкубировать 1 час при 37 ° С.
- Не стирать. Откажитесь блокирующий буфер и хлопнуть пластины 3 раза вниз на бумажное полотенце, чтобы удалить остатки жидкости.
- Выдержите супернатантами и стандарты клонов.
- Для первого теста, разбавленные супернатанты клонов, полученных на стадии 5.6 или 5.7 1/3 в среде RPMI. Для стандартов разбавить RPMI решения среднего человека IgG, чтобы получить: 1,000 нг /мл, 500 нг / мл, 250 нг / мл, 125 нг / мл, 62,5 нг / мл, 31,25 нг / мл, 15,6 нг / мл и пустым. Использование 50 мкл / лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 60 мин. Анализ дальнейших разведений клон 'супернатанта, чтобы проверить сродство антител, такие как 1/10 или 1/100.
- Вымойте, как это сделано в шаге 6.3.
- Использование 50 мкл / лунку козьего F (аb) 2 против человеческого IgG, конъюгированное с пероксидазой Fc разводили 1: 20000 в инкубационном буфере. Инкубационный буфер содержит 1% BSA и 0,02% Твин 20 в PBS 1x. Инкубируют при 37 ° С в течение 60 мин.
- Вымойте, как это сделано в шаге 6.3.
- Добавить 100 мкл / лунку раствора субстрата, содержащего 0,1% 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ). Инкубируйте 10 мин до стабильных синих цветовых форм в скважинах. Будь осторожен; не ждать слишком долго!
- Остановить реакцию добавлением 50 мкл 2 М H 2 SO 4. Измерить поглощение при 450 нм в течение 30 мин после остановки реакции.
Примечание: Все клоны "сupernatants с 3 стандартных отклонения над пустой будет считаться положительным для IgG антител человека. Для подтверждения положительных клонов это ИФА следует повторить не менее трех раз в разных супернатантах же клона. Кроме отбрасывать возможность неспецифической перекрестной реактивности рекомендуется, чтобы гарантировать, что нет сигнала, когда супернатанты инкубируют в непокрытыми блокированные лунки. На этом этапе, анализ обнаружения для выявления антигенной специфичности антител, представляющих интерес может быть выполнена до, чтобы перейти к разделу 7.
7. Выделение РНК и первой цепи кДНК Синтез производителях IgG клонов
- Как только производство IgG подтверждается ELISA, извлечь РНК клона.
- Для извлечения РНК из клеток, растущих в шагах 5,7 или 5,9, используйте верхний индекс клетки III прямая комплект синтез кДНК, которая позволяет получить ДНК из 10000 клеток на одну ячейку.
- Для извлечения РНК из LARGER количества клеток, или из осадка сохраненное на шаге 5.11 использовать высокую чистую набор для выделения РНК. Другие системы экстракции РНК также могут быть пригодны на этом шаге. Следуйте инструкциям производителя.
- Для количества клеток от 1 × 10 6 и 1 х 10 4 Использование системы обратного транскрипция, в соответствии с инструкцией производителя. Другие системы для синтеза первой цепи кДНК также могут быть использованы.
8. 1-й и 2-й ПЦР для амплификации тяжелой и легкой цепей IgG-продуцирующих В-клеточных клонов
- С кДНК из клонов клеток, полученных на стадии 5.6 и 5.7 и положительным в IgG ELISA на шаге 6, выполнить ПЦР с использованием праймеров, приведенных в таблице 1.
- Настройка независимых МКП для каждого IgG тяжелые, каппа и лямбда цепи. Сделать исходного раствора с прямого и обратного праймеров в равных концентрациях. Добавьте их в реакции при 0,4 мкМ конечной концентрации. </ LI>
- Используйте 1 мкл кДНК синтеза для выполнения 1-го ПЦР. Вот, выполните 20 мкл реакции, используя инструкции производителя Takara Taq. Кроме того, использование других полимеразы.
- Поместите 1-й ПЦР при следующих условиях цикла: 94 ° С в течение 5 мин; (50 циклов: 94 ° С в течение 30 сек; 58 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 45 сек; 72 ° C в течение 7 мин; дайте ему остыть при 4 ° C.Include пустой в реакции, для выявления возможных загрязнений.
- Приготовьте 1х КЭ (89 мМ Трис-борат и 2 мМ ЭДТА). В объеме 100 мл 1x КЭ добавляют 1 г агарозы (1% агарозном геле). Раствор нагревают в микроволновой печи в течение примерно 1 мин, до тех пор, пока агарозном растворяется. Затем добавить 4 мкл 10 мг / мл этидий бромид (или эквивалент красителя ДНК) и перемешивают.
- Вылейте содержимое в лоток и дождитесь получает полимеризации. Запуск 5 мкл смеси ПЦР в геле для визуализации полос. Тяжелая цепь фрагментс должна быть около 400 - 550 б.п., в то время как легкая цепь должна быть около 300 - 400 б.п.. Если полосы не обнаружены, поступить таким же образом 2-й ПЦР.
- Используйте 1 мкл первой ПЦР смешать выполнить 2-ю ПЦР. Используйте те же реагенты, что на стадии 8.2, но с использованием подходящего сочетания праймеров (таблица 1). Для 2-й ПЦР используют следующие условия: 94 ° С в течение 5 мин; (50 циклов: 94 ° С в течение 30 сек; 56,5 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 55 сек); 72 ° С в течение 7 мин; дайте ему остыть при 4 ° С. Включить пробел в реакции, чтобы обнаружить возможные загрязнения ПЦР.
- Подготовка агарозном геле, как описано в разделе 8.5. Запустите гель для визуализации продукта ПЦР, как в 8.5.1 Используйте уточнения, которые содержат правильные фрагменты размера для клонирования в шаге 9 и производить антитела в шаге 10.
- Последовательность ДНК, с помощью 10 мкл реакционной смеси, содержащей: 100 нг 2-й ПЦР, 0.2 мкМ праймера или праймеров смеси 1 мкл терминатора и 1 мкл буфера. Выполнение реакции секвенирования при следующих условиях: (25 циклов: 96 ° С в течение 10 сек; 50 ° C в течение 5 сек и при 60 ° С в течение 4 мин); 60 ° С в течение 7 мин; дайте ему остыть при 4 ° С.
- Очистить секвенирования реакции с MicroSpin G50 колонок следующие инструкции изготовителя. Оценка последовательности лигирования в автоматическом анализаторе последовательности, как описано выше 18. Электрофореграммы должны быть чистыми и соответствуют одной последовательности иммуноглобулина.
Примечание: Если продукты ПЦР показать неясные или неоднозначные последовательности иммуноглобулина, пожалуйста, рассмотреть клонировать их, используя систему TopoTA, чтобы получить изолированные последовательности, а затем перейдите к шагу 9.
9. Клонирование и секвенирование цепи тяжелой и легкой клонов Производство IgG
- Подготовьте 1 мкг ДНК векторов pFUSE2ss-CLIg-НК, pFUSE2ss-CLIg-HL2 и pFUSEss-Chig-HG1.
- Дайджест эти векторы с соответствующими ферментами рестрикции. Использование Eco RI и Bsi WI для pFUSE2ss-CLIg-HK, Eco RI и Avr II для pFUSE2ss-CLIg-HL2 и Eco RI и Nhe я за pFUSEss-Chig-HG1. Использование 3 единицы каждого фермента рестрикции в течение 1 мкг ДНК вектора.
- Дайджест с одним ферментом и очистить расщеплении с набора для очистки ПЦР. Дайджест с второго фермента и очистить с Gel Extraction Kit (в соответствии с протоколом производителя). Вырезать фрагмент интерес с агарозном геле. Подготовка агарозном геле, как в шаге 8.5.
- Дайджест 2-й ПЦР продукты производящей IgG клона: Eco RI и BSI WI для усиления каппа-цепи, Eco RI и AVR II для усиления лямбда цепи, и Eco RI и Nhe I для усиления тяжелой цепи. Дайджест с одним ферментом и очистить расщеплении с РCR Очистка комплект. Дайджест с вторым ферментом и очистить расщеплении с набора для очистки ПЦР. Используйте те же единицы ферментов и размере ДНК, как в шаге 9.2.
- Перевязывать фрагменты ПЦР внутри векторов с рекомендациями Т4 ДНК-лигазы 16 ° CO / N следующих изготовителя. Отношение используется должно быть 1: 2 (вектор: вставка).
- Используйте 1 мкл перевязки превратить DH5 & бактерии. Следуйте условия DH5 & производителя для трансформации. Распространение бактерий в бластицидин или зеоцину пластин, в зависимости от типа используемого вектора. Инкубируйте пластин O / N при 37 ° С.
- Растут отдельных колоний, и извлечь ДНК с комплектом Miniprep, после производителя инструкции. Используйте для одной колонии расти и ДНК экстракции производителя, рекомендации из комплекта ДНК минипрепаративную. Анализ их расщеплением ферментов, используемых для получения векторов и вставки, как на этапах 9.2 и 9.3.
- Последовательность ДНК, по USINг 100 нг вектора, как это сделано в шагах 8.8 и 8.9.
10. Получение антител в НЕК клеток
- Выращивают клетки HEK в Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% L-глюкозы, 1% пенициллина / стрептавидином (DMEM +) до слияния в 75% в 150 мм культуральный планшет. Выполните в капюшоне шаги 10.1 до 10,7.
- Перед трансфекцией обмена среды к среде, как и прежде, но без фетальной телячьей сыворотки.
- Для каждого тяжелой, легкой цепи трансфекции, подготовить смесь для трансфекции с 2,5 мл среды DMEM (без сыворотки), 9 мкг вектора с тяжелой цепи, 6 мкг вектора с легкой цепи, и 100 мкл полиэтиленимина (PEI ) раствор (от 1 мкг / мкл в наличии). Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Осторожно добавляют 2,5 мл смеси для трансфекции, полученного на стадии 10.3 клетках НЕК в пластине. Рок пластину распространять равномерно.
- Вcubate клетки в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2 в течение 24 ч.
- Изменение культуральной среды к среде без фетальной телячьей сыворотки.
- Сбор среду с пластин 4 дней.
Примечание: Эти антитела в средствах массовой информации может быть использован для характеристики их реактивность в пробирке и в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сортировка стробирования после окрашивания CD22 и IgG-положительных клеток показано на рисунке 1 На этом изображении площадь двойных позитивных клеток -. B клетки, продуцирующие антитела IgG - выбирается сортировать все эти клетки в отдельную пробирку. При анализе, примерно 1% от общего объема РВМС соответствуют этой двойной положительной населения. Количество отсортированных клеток, полученных будет зависеть от числа клеток, полученных в разделе 1.
Различные результаты после 5 недель EBV увековечении и CpG (ODN2006) раздражители показано на рисунке 2 обнаружение растущих клонов легко. WI38 фидерные клетки имеют более удлиненную форму фибробластов, и В-клеточные клоны появляются как очень маленькие круглые клетки, растущие сгруппированы в середине круглым дном нескольких луночного планшета. На этом этапе, очевидно, что некоторые клоны начинают расти. Тем не менее, растет скорость может быть переменной и, конечно, некоторые из колодцев содерНин увековечены клетки не могут иметь каких-либо клеток, растущих на всех.
Супернатант из растущих клонов тестируют в ELISA для определения IgG, как показано в таблице 2. В этом ELISA стандартную кривую для IgG тестируют вместе с супернатантом клонов и пробелы. Положительный клон считается, когда значение в ИФА 3 стандартных отклонения над пустым значением. Отрицательные величины клонов »находятся под 3 стандартных отклонений заготовки. Для подтверждения положительных клонов должен быть положительным в ELISA по крайней мере, три раза в различных супернатантов же клона и, если возможно проверить с помощью дополнительного метода скрининга.
Полная последовательность антитела IgG человека, полученного нанесением шаги, описанные в этой рукописи показано на рисунке 3. Эта последовательность была получена после клонирования тяжелой цепи и лямбда иммуноглобулина пару из расширенного клонально В-клетки. Переменнаяй константные области тяжелой и легкой цепи могут быть охарактеризованы с этой техникой. После получения последовательности, антитела последовательности могут быть клонированы и производятся в пробирке в клеточных культурах НЕК.
Рисунок 1. Цитометрический анализ CD22 + и IgG + клеток от мононуклеарных клеток периферической крови человека. () Выбор населения, живущих клеток показано на Р1. (Б) вперед разброс сюжет. (С) Размер точечный график. (D) Ось Y показывает клетки, разделенных анти-CD22-PerCP и по оси Х, разделенных IgG-PE. Р4 квадрат обозначает клеточной фракции, которая была отсортированный (CD22 +, IgG +) и восстановленной культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого Fiфигура.
Рисунок 2. Представитель образ В-клетки увековечены клонов в 96 луночного планшета через 5 недель культивирования. (А) В этом также не иммортализации наблюдалось после 5 недель, но WI38 облученный фидерные клетки можно наблюдать. (B), медленно растет клон наблюдалось в этой скважине, с маленькими круглыми агрегатов в середине. (С) Быстро растущий клон показывая вокруг агрегатов увековечены В-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Человеческие антитела последовательности тяжелой и легкой цепи пары из человеческого клона увековечены В-клеток, F50,2, что указывает на V CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 1-й ПЦР праймеры | ||
| Форвард (5'-3 ') | Обратный (3'-5 ') | |
| IgG | 5 'L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG | 3 'Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC |
| 5 'L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG | ||
| κ | 5 'L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG | 3 'Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA |
| 5 'L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG | 3 'Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT | |
| 5 'L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG | ||
| 5 'Пан Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG | ||
| λ | 5 'L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG | 3 'Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG |
| 5 'L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG | ||
| 5 'L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG | ||
| 5 'L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG | ||
| 5 'L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG | ||
| 5 'L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG | ||
| 5'L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG | ||
| 2-й ПЦР праймеры | ||
| Форвард (5'-3 ') | Обратный (3'-5 ') | |
| IgH | 5 'EcoRI-VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG | 3 'NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG |
| 5 'EcoRI-VH1 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG | 3 'NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG | |
| 5 'EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG | 3 'NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG | |
| 5 'EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI-VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG | ||
| 5 'EcoRI-VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG | ||
| 5 'EcoRI-VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG | ||
| 5 'EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI-VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG | ||
| κ | 5 'EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jκ 1 до 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC |
| 5 'EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT | 3 'BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACG TTTGATCTCCAG CTTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT | ||
| 5 'EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG | 3 'AvrII Jλ 1 до 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG | 3 'AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG | 3 'AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 4 до 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA | 3 'AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG | 3 'AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT | |
| 5 'EcoR1 Vλ 7 до 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| 0,076 | 0.077 | 2.003 | 0.080 | 0,138 | 0,102 | 0,188 | 0,338 | 0.040 | 2.041 | 0,051 | 0,081 | |
| В | 2.011 | 0,085 | 0,074 | 0,069 | 0,081 | 0,122 | 0,372 | 2.133 | 0,119 | 0,097 | 0,072 | 0,072 |
| С | 0,068 | 0,179 | 0,091 | 0,073 | 0.077 | 0,097 | 0,606 | 1.882 | 0,081 | 2.071 | 0,094 | 0,075 |
| D | 0,063 | 0.070 | 0,065 | 0,071 | 0.082 | 2.071 | 0,339 | 2.089 | 0,076 | 0,086 | 0,066 | 0,069 |
| Е | 1.921 | 0.077 | 0,065 | 0,085 | 0,095 | 1.968 | 1.910 | 0,122 | 0,072 | 0.070 | 0,065 | 0,066 |
| F | 0,113 | 0,068 | 0,066 | 0.082 | 0,088 | 0,090 | 0.460 | 0.070 | 0.079 | 0,952 | 0.098 | 0,065 |
| Г | 2.041 | 2.108 | 1.472 | 0,665 | 0,331 | 0,194 | 0,123 | 0,094 | EFT "> 0,0800,072 | 0.070 | 0,072 | |
| Н | 2.146 | 2.132 | 1.634 | 0,665 | 0,341 | 0,178 | 0,132 | 0,094 | 0.082 | 0.080 | 0,074 | 0,068 |
| Стандарты нг / мкл | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62,5 | 31.25 | 15,6 | 7.8 | 3.9 | 1.95 | 0,975 | 0 |
Таблица 2. Типичные результаты скрининга IgG методом ИФА. Клон супернатанты в A1-A10, B1-B10, C1-C10, D1-D10, E1-E10, F1-F10. Бланки в А11, В11, С11, D11, E11, F11, A12, B12, C12, D12, E12, кривая F12.Standard дублируется: G1-G12 и Н1-Н12. Соответствующая концентрация иммуноглобулинов в каждой экземплярах показано below.Positive или IgG клоны показаны на темно-серый. Негативные или не IgG клоны показаны на светло-серый
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи, все шаги для генерации антител IgG от человека МНПК представлены в деталях. Этот протокол включает в себя несколько преимуществ по сравнению с ранее опубликованными методиками. Одним из преимуществ является то, что антитела, полученные держит тяжелые и легкие цепи, соответствующие исходной пары в В-клеток клона. Выявление IgG антител может быть сделано в любом типе человека-донора, и нет необходимости в обострении иммунного ответа за счет вакцинации 5. Использование фибробластов клеточной линии WI38 как клеток-фидеров, позволяет более быстрое обнаружение растущих клонов, так как они морфологически разные и очень легко отличить по сравнению с РВМС, используемых в качестве клеток-фидеров в ранее описанных работ 1,6 8. Кроме того, использование в качестве WI38 клеток-фидеров способствует замораживание больших количеств клеток аликвоты, которые могут быть легко оттаивают и культивируемых перед каждым экспериментом.
Один из критческие шаги в этом протоколе является исходным материалом: РВМС. Если кровь была ждать слишком долго, центрифугирования или после извлечения МНПК, они не хранятся в надлежащих условиях замораживания; как таковой число жизнеспособных клеток будет снижена, наряду с номером В-клеток IgG клоны, полученные. По этой причине, в начале добычи и хорошей сохранности МНПК рекомендуются для успешного результата. Количество IgG продуцирующих клонов будет ограничено количеством РВМС в начале эксперимента. Более высокие числа МНПК даст более высокие номера IgG клоны и разнообразной продукции антител. Другим важным шагом является клонирование PCR фрагментов легких и тяжелых цепей антитела. Если перевязка не удается после нескольких попыток, дополнительный шаг клонирования 2-й ПЦР-продукта в системе TopoTA рекомендуется. Переваривание вставки с соответствующими ферментами может быть прощев векторе TopoTA, для последующего лигирования в экспрессирующие векторы pFUSEss.
Эта техника может быть передана к любому типу ткани человека, в которых В-клетки человека, обогащенной 3. Он также может быть применен к изучению других типов иммуноглобулинов, просто путем изменения меченых антител, используемых для сортировки (антитела против IgM, IgE, IgA или IgD), конструкции праймеров для ПЦР, и экспрессирующих векторов. Исследования этих иммуноглобулинов может представлять интерес для понимания, начальных иммунных реакций, секреции слизистой оболочки антител и профилей аллергии, среди других.
В заключение, мы описали технику для производства рекомбинантных моноклональных человека IgG антитела, которые оставляет тяжелых и легких цепей пар человеческого иммуноглобулина нетронутыми. Техника полезна и легко выполнять, начиная с образцом крови. Моноклональные антитела, полученные с помощью этого метода потенциально полезны в изучении иммунодефицита человекаответы. Кроме того, моноклональные антитела, продуцируемые с помощью этого метода может быть хорошей отправной точкой для развития иммуно-терапии для различных патологических состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Исследования контракт Мигель Сервет (ISCIII CD14 / 00032), чтобы (GN-G.). Братство от Нидерландской организации научных исследований "Высшей школы трансляционной неврологии программе" (022005019) в (CH).
Субсидии из Принцев Беатрикс Fonds (проект WAR08-12) и Ассоциации Франсез контр ле Миопатии в (ЛС-М.); а также в Вени Братства Нидерландской организации научных исследований (916.10.148) в общении мозга Фонда Нидерландов (FS2008 (1) -28) и Prinses Беатрикс Fonds (Проект WAR08-12) (ОД ).
Мы благодарим Jozien Ясперс за помощь в B-клетки сортировки с помощью проточной цитометрии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2 μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µl, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
