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Immunology and Infection

-16 RRNA लक्ष्य निर्धारण एक Digoxin लेबल डीएनए जांच का उपयोग आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर जीवाणुओं की सीटू का पता लगाने में

Published: May 21, 2015 doi: 10.3791/52836
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Oral Microbiology and Immunology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University

Introduction

जीवाणु ऐसे periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis, और अस्थिमज्जा का प्रदाह के रूप में विभिन्न मौखिक रोगों के एटियलजि में एक भूमिका निभाते हैं। रोग के रोगजनन में जीवाणुओं की भूमिका को समझने के लिए और उपचार के प्रभाव पर नजर रखने के क्रम में, ऊतक के भीतर बैक्टीरिया के स्थानीयकरण महत्वपूर्ण है। periodontitis के साथ रोगियों से मसूड़े ऊतक के भीतर बैक्टीरिया की उपस्थिति एक fluorescence- का उपयोग करते हुए सीटू संकरण (मछली) 8 में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 1,2, immunohistochemistry और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर बैक्टीरिया विशिष्ट एंटीबॉडी 3-7, और फ्लोरोसेंट सहित विभिन्न तरीकों का उपयोग कर दिखाया गया है -16 rRNA को लक्षित में लेबल oligonucleotide जांच। फिर भी, इन तरीकों में व्यापक रूप से की वजह से तकनीकी सीमा या कठिनाइयों के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं। एंटीबॉडी के साथ तुलना में, -16 rRNA को लक्षित कर जांच के लिए उत्पादन और प्रजाति विशिष्टता प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं। मछली BACT के दृश्य के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण साबित हो गया हैऐसे पट्टिका बायोफिल्म के रूप में उनके प्राकृतिक वातावरण में eria। हालांकि, ऊतकों के नमूनों के लिए मछली के आवेदन की वजह से विभिन्न ऊतकों के घटकों के autofluorescence तक सीमित है। वे 9 खून बह शामिल करते हैं, उदाहरण के लिए, लाल रक्त कोशिकाओं की मजबूत autofluorescence अक्सर सूजन के ऊतकों को प्रतिदीप्ति प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग बाधित।

सूजन मसूड़ों के ऊतकों के भीतर बैक्टीरिया स्थानीयकरण करने के लिए आदेश में, इसलिए, एक digoxigenin का उपयोग कर एक बगल में संकरण विधि (डीआईजी) लेबल डीएनए जांच विकसित किया गया है और सफलतापूर्वक 10,11 लागू होता है। पी का उपयोग कर आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर बैक्टीरिया के स्थानीयकरण के लिए यहाँ एक विस्तृत प्रोटोकॉल gingivalis -specific और सार्वभौमिक eubacterial जांच वर्णित किया गया है। यह विशेष रूप से इसी तरह के परिणाम अन्य प्रयोगशालाओं में reproduced किया जा सकता है, ताकि विधि का मानकीकरण पर केंद्रित है। इस प्रोटोकॉल उनके ऊतकीय संदर्भ और resu के भीतर बैक्टीरिया का स्थानीयकरण की अनुमति देता हैएलटीएस अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं। वर्णित प्रोटोकॉल या तो विभिन्न ऊतकों में एक प्रजाति-विशेष या सार्वभौमिक तरीके से बैक्टीरिया स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यूनिवर्सल जांच polymicrobial रोगों में बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए और विशिष्ट जीवाणुओं की भूमिका नहीं जाना जाता है, जहां रोगों में बैक्टीरिया का एक संभावित भूमिका का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।

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Protocol

1. जांच तैयारी

  1. जांच की पीसीआर प्रवर्धन
    1. पी के लिए gingivalis -specific जांच, पी के 343-बीपी डीएनए टुकड़ा बढ़ाना पी के जीनोमिक डीएनए का उपयोग पीसीआर द्वारा gingivalis -16 rRNA gingivalis और निम्न प्राइमरों: 5'- टी जी सी एएसी टीटीजी सी सी टी टीएसी आगा सीजी-3 'और 5'- अधिनियम CGT एटीसी जीसीसी CGT बुनना टीसी-3' 10। निम्नलिखित चक्र शर्तों के साथ amplifications प्रदर्शन करना: 35 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 72 डिग्री पर एक 5 मिनट के विस्तार के द्वारा पीछा किया 1 मिनट 20 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस सी 10,11 के लिए।
    2. एक 70-बीपी डीएनए टुकड़ा (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG का उपयोग कर eubacterial जांच बढ़ाना
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC -3 'एक oligonucleotide और निम्न प्राइमरों के रूप में संश्लेषित): 5'-कैग जीटीआर CTG CMT GGY -3' '11 और 5'-AGG GTT GCG सीटीसी GTT-3। निम्नलिखित चक्र शर्तों के साथ amplifications प्रदर्शन करना: 40 चक्र30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए 9 4 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट 72 डिग्री सेल्सियस 11,12 में एक 5 मिनट के विस्तार के द्वारा पीछा किया 20 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. और 2 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर incubating 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) और (: 1 2 अनुपात एक 10 पर) 100% इथेनॉल जोड़कर पीसीआर उत्पादों (≥500 μl) वेग।
    4. अपकेंद्रित्र मिश्रण 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर, ते बफर के 100 μl में गोली resuspend, और 260 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व द्वारा डीएनए एकाग्रता को मापने।
  2. एक डीआईजी डीएनए लेबलिंग और पहचान किट का उपयोग कर डीआईजी लेबलिंग
    1. 15 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी के साथ जांच के 3 माइक्रोग्राम मिलाएं।
    2. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए denature और जल्दी से बर्फ पर शांत रहो।
    3. 10x hexanucleotide मिश्रण के 2 μl, dNTP लेबलिंग मिश्रण के 2 μl, और विकृत डीएनए के 15 μl के लिए Klenow एंजाइम की 1 μl जोड़ें।
    4. मिक्स और 48 घंटा के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 65 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो।
  3. एक डीआईजी डीएनए लेबलिंग और पहचान किट का उपयोग कर डीआईजी लेबल जांच की संवेदनशीलता की जाँच करें
    1. मैन्युअल आरटी पर 5 मिनट के लिए किट में दिए गए सकारात्मक नियंत्रण जांच के धारावाहिक dilutions के 1 μl और नायलॉन झिल्ली पर डीआईजी लेबल जांच के 1 एनजी और सूखी लोड।
    2. संक्षेप में 2x एसएससी बफर (0.3 एम NaCl, 30 मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच 7.0) में झिल्ली लेना और डीएनए को स्थिर करने के लिए 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली सेते हैं।
    3. संक्षेप में Maleic एसिड बफर में (एमएबी, 0.1 एम Maleic एसिड, 0.15 एम NaCl, पीएच 7.5) झिल्ली लेना और विरोधी डीआईजी alkaline फॉस्फेट संयुग्मित एंटीबॉडी पतला (एपी) के साथ सेते हैं: प्रदत्त अवरुद्ध समाधान के 6 मिलीलीटर में (1 5,000) 30 मिनट के लिए आरटी पर किट में।
    4. MABT (एमएबी 1% के बीच 20 से युक्त) के साथ झिल्ली धो लें और पर 2 मिलीलीटर का पता लगाने के बफर (0.1 एम Tris-एचसीएल, 0.1 एम NaCl, 0.05 एम 2 MgCl, पीएच 9.5) के साथ मिश्रित एनबीटी / BCIP समाधान के 40 μl लागू होते हैं 1 मिनट के लिए झिल्ली। लेबल जांच की संवेदनशीलता हैसंतोषजनक नहीं, 1.1.3 से 1.3.4 के लिए चरणों को दोहराएँ।
    5. लेबल जांच (OD260) के डीएनए एकाग्रता उपाय और μl एनजी 100 करने के लिए एकाग्रता समायोजित -1।
  4. डीआईजी लेबल जांच की विशिष्टता जाँचें
    1. जीनोमिक डीएनए नमूनों denature 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर, विशिष्ट जांच द्वारा लक्षित जीवाणु सहित विभिन्न बैक्टीरियल प्रजातियों से (25 3 μl -1 प्रत्येक नमूना प्रति एनजी) और जल्दी से बर्फ पर शांत रहो।
    2. मैन्युअल आरटी पर 20 मिनट के लिए विकृत नायलॉन झिल्ली पर डीएनए और सूखी लोड।
    3. संक्षेप में 2x एसएससी बफर में झिल्ली लेना और डीएनए को स्थिर करने के लिए 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली सेते हैं।
    4. 1 घंटे के लिए आरटी पर एक अवरुद्ध समाधान के साथ झिल्ली अवरुद्ध करें।
    5. संकरण बफर में, पतला जांच denature, और झिल्ली पर लागू होते हैं μl -1 1 एनजी पर जांच पतला।
    6. 1 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली सेते हैं।
    7. झिल्ली धो तीन2x एसएससी बफर के साथ कई बार।
    8. संक्षेप में एमएबी में झिल्ली लेना।
    9. 1 घंटे के लिए आरटी पर अवरुद्ध समाधान के 6 मिलीलीटर में: (2,000 1) पतला विरोधी डीआईजी एपी संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
    10. MABT साथ झिल्ली धो लें और 2 मिलीलीटर का पता लगाने के बफर के साथ मिश्रित एनबीटी / BCIP समाधान के 40 μl लागू होते हैं।
    11. जांच की उम्मीद है और विशिष्टता हासिल नहीं करता है जब विशिष्टता मनाया जाता है, जब तक संकरण तापमान में वृद्धि।

स्वस्थानी संकरण में 2.

नोट:, नमूनों और अभिकर्मकों के सूखने से बचने गीला कागज तौलिये के साथ लाइन में खड़ा एक humidified कक्ष में सभी incubations करने के लिए।

  1. डी-paraffinization और ऊतक वर्गों के रिहाइड्रेशन
    1. आयल एम्बेडेड ब्लॉक से 4 माइक्रोन मोटी ऊतक वर्गों तैयार करें। Formalin, paraformaldehyde, और जस्ता-आधारित लगानेवाला इस प्रोटोकॉल के साथ संगत कर रहे हैं।
    2. DEPC इलाज पानी का उपयोग कर सभी अभिकर्मकों तैयार करें।
    3. 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी ओवन में हीट स्लाइड और 30 मिनट के लिए आरटी पर स्लाइड सेते हैं।
    4. 5 मिनट के लिए तीन बार 100% xylene में स्लाइड को विसर्जित कर दिया; ताजा xylene हर बार का उपयोग करें।
      ध्यान दें: एक रासायनिक धूआं हुड में इस डे-वैक्सिंग प्रक्रिया है।
    5. दो बार 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित हर बार नए सिरे से इथेनॉल का उपयोग, और 5 मिनट प्रत्येक के लिए धारावाहिक 90% में नमूनों, 80% और 70% इथेनॉल समाधान rehydrate।
    6. 1 मिनट के लिए DEPC इलाज पानी में स्लाइड को विसर्जित कर दिया और 6 मिनट के लिए DEPC इलाज पीबीएस (7.4 पीएच) में स्लाइड्स धो लें।
  2. ऊतक वर्गों के pretreatments
    1. 20 मिनट के लिए 0.1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड में स्लाइड को विसर्जित कर दिया और 30 सेकंड के लिए DEPC इलाज पानी में स्लाइड्स धो लें।
    2. एक मोम कलम का उपयोग नमूनों के आस-पास एक हाइड्रोफोबिक बाधा ड्रा।
      नोट: हाइड्रोफोबिक बाधा के आकार के नमूनों के आकार पर निर्भर करता है। इसलिए, निम्न चरणों में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों की मात्रा नमूनों के आकार पर निर्भर करता है, लेकिन हरियाणा भरने के लिए बदलती हैंdrophobic बाधा (छोटे नमूनों के लिए 50 μl और बड़े नमूनों के लिए 400 μl)।
    3. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सूखी ओवन में proteinase कश्मीर (1 से 10 माइक्रोग्राम मिलीलीटर -1 DEPC इलाज पीबीएस में) की 50-400 μl के साथ नमूनों को समझो और 1 मिनट के लिए DEPC इलाज 1X पीबीएस में स्लाइड्स धो लें।
    4. 10 मिनट के लिए DEPC इलाज पीबीएस में 4% paraformaldehyde में स्लाइड्स भिगोएँ, फिर 1 मिनट के लिए DEPC इलाज पीबीएस में स्लाइड्स धो लें।
    5. 0.1 एम triethanolamine-एचसीएल 20 मिनट के लिए 0.5% एसिटिक एनहाइड्राइड युक्त (8.0 पीएच) में स्लाइड्स लेना और 30 सेकंड के लिए DEPC इलाज पानी में स्लाइड्स धो लें।
  3. जांच और कपड़े धोने के साथ संकरण
    1. 20 मिनट के लिए 2x एसएससी बफर में स्लाइड्स विसर्जित कर दिया।
    2. संकरण बफर में μl -1 1 एनजी (4x एसएससी पर जांच पतला, 50% [वॉल / वॉल] Formamide, 1x Denhardt का समाधान, 10% [WT / खंड] dextran सल्फेट, 0.1% [WT / खंड] सोडियम dodecyl सल्फेट, 0.4 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 सामन शुक्राणु डीएनए)। नकारात्मक नियंत्रण के लिए, साथ लेबल जांच मिश्रणगैर लेबल जांच के लिए 10 गुना अधिक राशि।
    3. पतला जांच denature और ऊतक वर्गों पर 50-400 μl लागू होते हैं। स्लाइड पर एक कवर पर्ची प्लेस और नेल पॉलिश के साथ सील।
    4. 45 डिग्री सेल्सियस या अधिकतम तापमान में एक humidified कक्ष हे / एन में 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर मशीन में हीट स्लाइड और सेते स्लाइड कदम 1.4.11 पर निर्धारित की।
    5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड कूल कवर फिसल जाता है निकालने के लिए, और followings के रूप में एक सीरियल एसएससी बफर में स्लाइड्स विसर्जित: 4x एसएससी 10 मिनट, पूर्व गर्म (45 डिग्री सेल्सियस) 2x एसएससी के लिए 20 मिनट के लिए, 2x एसएससी 10 के लिए मिनट और 10 मिनट के लिए 0.2x एसएससी।
  4. विरोधी डीआईजी एपी संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ डिटेक्शन
    1. 5 मिनट के लिए MABT में स्लाइड्स धो लें।
    2. 20 मिनट के लिए 1% के बीच 20 के साथ अवरुद्ध समाधान के 50-400 μl के साथ ब्लॉक।
    3. समाधान (1: 1000) अवरुद्ध में पतला विरोधी डीआईजी एपी एंटीबॉडी की 50-400 μl जोड़ें anld 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. 10 मिनट के लिए MABT में स्लाइड्स धो लें।
      5. <ली> 5 मिनट के लिए 1% के बीच 20 से युक्त पता लगाने के बफर में स्लाइड्स विसर्जित कर दिया।
    5. Μ 1 मिमी levamisole की अंतर्जात alkaline फॉस्फेट निष्क्रिय करने के लिए 5 मिनट के लिए (1% के बीच 20 से युक्त पता लगाने के बफर में) 50-400 साथ समझो।
    6. (1 में पता लगाने के बफर में पतला: 100) premixed एनबीटी / BCIP समाधान की 50-400 μl बांटो प्रत्येक नमूना पर और विकसित संकेत संतोषजनक है जब तक 2 घंटे 3 के लिए आरटी पर एक humidified कक्ष में स्लाइड्स सेते हैं।
    7. दृश्य रोकने के लिए और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% एक काउंटर दाग के रूप में [WT / खंड] मिथाइल हरे रंग की 50-400 μl लागू करने के लिए de-ionized पानी के साथ स्लाइड्स कुल्ला।
    8. 100% इथेनॉल में निर्जलीकरण, de-ionized पानी के साथ स्लाइड्स कुल्ला, और xylene में विसर्जित कर दिया।
    9. प्रत्येक स्लाइड पर बढ़ते समाधान के 80 μl लागू करें और कवर फिसल जाता है के साथ कवर किया।

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Representative Results

चित्रा 1 से पता चलता है अपनी संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए किट में दिए गए सकारात्मक नियंत्रण जांच के साथ तुलना में डीआईजी लेबल जांच के सोख्ता डॉट। 343 बी पी पी gingivalis -specific जांच 70 बीपी eubacterial जांच की तुलना में 25 गुना अधिक संवेदनशील है। पी का पता लगाने के लिए पुरानी periodontitis के साथ रोगियों से प्राप्त मसूड़ों के ऊतकों के स्वस्थानी संकरण में 2 से पता चलता है gingivalis और eubacteria। बैंगनी में दिखाया बैक्टीरियल संकेतों, ऊतक के बाहर स्थित epithelia, लामिना propria, और biofilm के भीतर पाया गया। हालांकि, पी का वितरण gingivalis और मसूड़ों के ऊतकों के भीतर eubacteria अलग था। केवल छड़ी के आकार का जीवाणु पी से पता चला रहे थे, जबकि जीवाणुओं की उच्च वृद्धि (1,000X), विभिन्न आकार (coccus, रॉड, तकली जैसा, और बालों फार्म) में, eubacterial जांच का उपयोग दिखाई दे रहे थे gingivalis -specific जांच। बैक्टीरियल संकेतों के छितरी रूपोंयह भी मनाया गया।

Hajishengallis एट अल। पी के विकास में खानेवाला बैक्टीरिया की अनिवार्य भूमिका का प्रदर्शन gingivalis चूहों 14 में प्रयोगात्मक periodontitis के -induced। dextran सल्फेट सोडियम के आवेदन (डीएसएस), मसूड़ों का म्यूकोसा प्रेरित periodontitis और चूहों 13 में वायुकोशीय हड्डी हानि पर एक तंग जंक्शन (टीजे) -disrupting रासायनिक,। eubacterial जांच सफलतापूर्वक पी द्वारा नहीं पाया गया है कि इस के बारे समूह से मसूड़ों के ऊतकों के भीतर बैक्टीरिया का पता चला gingivalis -specific जांच (चित्रा 3)।

eubacterial जांच अन्य बीमारियों में जीवाणुओं की संभावित भागीदारी के अध्ययन के लिए उपयोगी है। मैं गैस्ट्रिक कैंसर 15 के लिए कैसरजन एक ग्रेड के रूप में हेलिकोबेक्टर नामित कैंसर पर अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय एजेंसी के बाद से, अन्य कैंसर के विकास में बैक्टीरिया की संभावित भागीदारी को व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। जब एसईस्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के साथ का निदान फेफड़ों बायोप्सी के ctions eubacterial जांच के साथ संकरित बगल में थे, बैक्टीरिया भी करने के लिए लागू किया गया था eubacterial जांच का उपयोग स्वस्थानी संकरण में। (चित्रा 4) कोशिकाओं घुसपैठ / ट्यूमर कोशिकाओं के भीतर और आसपास के स्ट्रोमल के बीच दोनों पाया गया मौखिक दाद planus, अज्ञात एटियलजि के साथ एक भड़काऊ प्रतिरक्षा रोग के घावों में जीवाणुओं की उपस्थिति का पता लगाने। दिलचस्प है, बैक्टीरियल संकेतों epithelia के भीतर भी है लेकिन बैंड की तरह घुसपैठ मनाया गया जहां लामिना propria में ही नहीं पाया गया। उच्च वृद्धि के तहत, बैक्टीरियल संकेतों कई कोशिकाओं (चित्रा 5) के नाभिक में पाया गया।

चित्र 1
चित्रा 1. संवेदनशीलता डीआईजी लेबल जांच की कसौटी पर। Serially और पतला कस्टम लेबल जांच और एक सकारात्मक contrकिट में प्रदान की राजभाषा जांच डॉट विरोधी डीआईजी एपी संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ मिट गया। पी के साथ, धब्बा सब्सट्रेट जोड़ने के बाद eubacterial जांच के साथ दाग 1 मिनट के लिए विकसित किया गया था, जबकि gingivalis -specific जांच, 30 सेकंड के लिए विकसित किया गया था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
पुरानी periodontitis के साथ रोगियों से प्राप्त मसूड़ों के ऊतकों के भीतर जीवाणुओं की चित्रा 2. जांच। स्वस्थ साइट (ए) और periodontitis के साथ एक रोगी के रोगग्रस्त साइट (बी) से मसूड़ों बायोप्सी की धारा hematoxylin-eosin के अधीन थे (एच एंड ई) धुंधला या या तो पी के साथ सीटू संकरण में gingivalis -specific जांच या eubacterial जांच। Negativई नियंत्रण 10 गुना अतिरिक्त unlabeled जांच के साथ मिश्रित जांच के साथ संकरित किया गया। आवर्धित क्षेत्र एक चौकोर बॉक्स के साथ संकेत दिया है। बैंगनी में दिखाया प्रतिनिधि सकारात्मक संकेतों, पतली तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं। मोटी तीर ऊतक के बाहर पट्टिका बायोफिल्म संकेत मिलता है। 1,000X बढ़ाई जांच की पट्टिका बायोफिल्म insets में दिखाया जाता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
डिटेक्शन माउस के मसूड़ा ऊतक के भीतर मौखिक खानेवाला जीवाणुओं की चित्रा 3.। प्रायोगिक periodontitis के पी के मौखिक टीका द्वारा BALB / ग चूहों में प्रेरित किया गया था gingivalis (पीजी) या मसूड़ों का म्यूकोसा पर इस के बारे में आवेदन। चूहों से मसूड़ा वर्गों के साथ या तो सीटू संकरण एच एंड ई धुंधला करने के लिए या में किए गए < उन्हें> पी। gingivalis -specific जांच या eubacterial जांच। बैंगनी में दिखाया प्रतिनिधि सकारात्मक संकेतों, तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं। मूल बढ़ाई X400 है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
कैंसर घाव के भीतर जीवाणुओं की चित्रा 4. जांच। स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के साथ का निदान रोगियों से फेफड़ों बायोप्सी के वर्गों एच एंड ई के साथ या सार्वभौमिक eubacterial जांच या नकारात्मक नियंत्रण जांच या तो साथ संकरित बगल में दाग रहे थे। आवर्धित क्षेत्र एक चौकोर बॉक्स के साथ संकेत दिया है। बैंगनी में दिखाया प्रतिनिधि सकारात्मक संकेतों, तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं। ट्यूमर कोशिकाओं की सीमा बिंदीदार लाइनों के साथ संकेत कर रहे हैं।arget = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
मौखिक दाद planus के घावों के भीतर जीवाणुओं की चित्रा 5. जांच। मौखिक दाद planus के रूप में पहचान मुख mucosa से बायोप्सी के वर्गों एच एंड ई के साथ या सार्वभौमिक eubacterial जांच या नकारात्मक नियंत्रण जांच या तो साथ संकरित बगल में दाग रहे थे। बढ़ाया क्षेत्रों में एक वर्ग बॉक्स के साथ संकेत कर रहे हैं। बैंगनी में दिखाया प्रतिनिधि सकारात्मक संकेतों, तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहाँ एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है एक डीआईजी लेबल डीएनए जांच का उपयोग आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर बैक्टीरिया स्थानीय बनाना। जांच बैक्टीरियल -16 RRNA जीन के डीएनए या आरएनए अणुओं को लक्षित करता है, और -16 rRNA-लक्ष्य जांच या तो प्रजाति विशिष्ट या सार्वभौमिक रूप में तैयार किया जा सकता है। पी के विशिष्ट संकरण पी के लिए gingivalis -specific जांच gingivalis नहीं बल्कि अन्य मौखिक बैक्टीरिया को पहले से 10 दिखाया गया है। संकरण दक्षता 12 विविध हालांकि इसके विपरीत, eubacterial जांच, परीक्षण सभी जीवाणु जीनोमिक डीएनए (17 विभिन्न प्रजातियों) संकरित। जांच के भीतर टी न्यूक्लियोटाइड की संख्या डीआईजी लेबलिंग की दक्षता निर्धारित करता है। उच्च संवेदनशीलता के साथ एक डीआईजी लेबल जांच के उत्पादन में वर्णित प्रोटोकॉल के सफल क्रियान्वयन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ नमूनों का उपचार प्रोटीन और आंशिक hydrolysi की निकासी के माध्यम से संकेत करने वाली शोर अनुपात को बेहतर बनाता हैलक्ष्य दृश्यों के एस। Proteinase कश्मीर की एकाग्रता में वृद्धि हुई जांच का लक्ष्य पहुँच क्षमता बढ़ जाती है लेकिन ऊतक संरक्षण कम कर देता है। इसलिए, यह ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है, proteinase कश्मीर के कई सांद्रता का परीक्षण करने की सिफारिश की है। एसिटिलीकरण कदम पृष्ठभूमि सकारात्मक आरोप लगाया एमिनो समूहों acetylating से ऊतक के प्रोटीन के लिए नकारात्मक आरोप लगाया कि जांच के बंधन कम हो जाती है। इन तैयारी कदम की एक श्रृंखला के बाद, ऊतक वर्गों, इस प्रकार, आसानी से आंसू सावधानी के साथ संभाला जाना है। पृष्ठभूमि मछली के साथ तुलना में कम है। हालांकि, इस तरह की हड्डियों और बलगम ग्रंथियों के रूप में उच्च अंतर्जात alkaline फॉस्फेट गतिविधि के साथ ऊतकों से संकेत गंभीर रूप से व्याख्या की जानी चाहिए।

पीसीआर प्रवर्धित डीएनए जांच के शाही सेना जांच की तुलना में उत्पादन करने के लिए आसान और स्थिर हैं। , Epithelia: संकरित जांच के immunohistochemical पता लगाने एच एंड ई दाग वर्गों के साथ तुलना के माध्यम से ऊतकीय संरचनाओं की पहचान के लिए अनुमति देता हैसंयोजी ऊतक, भड़काऊ पैठ, और रक्त वाहिकाओं में अच्छी तरह से प्रतिष्ठित हैं। वर्णित प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक ही समय में कई जांच को लागू करने में असमर्थता है। इसके अतिरिक्त, वर्गों की सतह पर बैक्टीरियल contaminants से संकेतों का बहिष्कार सीमित है।

इस प्रोटोकॉल ऊतक वर्गों 16 के भीतर अन्य बैक्टीरियल टेप का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल एक मेजबान सेल मार्कर के immunohistochemical पता लगाने के साथ धुंधला दोगुना करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन से अनुदान (2013R1A1A3005669) और कोरियाई स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना, स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय के एक अनुदान (HI13C0016) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic anhydride Sigma 6404
50% Dextran sulfate solution Millipore S4030
50X Denhardt’s solution Sigma D2532
DEPC Sigma P159220
DIG DNA labeling and detection kit Roche 11 093 657 910
Formamide Sigma F9037
ImmEdge™ Pen Dako H-400
Levamisole Vector SP-5000
Magnesium chloride Sigma 246964
Maleic acid Sigma M0375
Methyl green Sigma M6776
Paraformaldehyde Sigma P1648
Permount Fisher SP15-500
Salmon sperm DNA solution Invitrogen #15632-011
Sodium chloride Sigma S9625
Sodium citrate Duksan D1420
Sodium dodecyl sulfate Amresco 227
Triethanolamine-HCl Sigma 90279
Tris-HCl Research organics 3098T

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 99 पेरीओदोंतोलोगी मौखिक सूक्ष्म जीव विज्ञान, -16 rRNA बैक्टीरिया आयल एम्बेडेड ऊतक प्रजाति विशिष्ट सार्वभौमिक
-16 RRNA लक्ष्य निर्धारण एक Digoxin लेबल डीएनए जांच का उपयोग आयल एम्बेडेड ऊतकों के भीतर जीवाणुओं की <em>सीटू</em> का पता लगाने <em>में</em>
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Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K.… More

Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836, doi:10.3791/52836 (2015).

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