Introduction
Bakterier spela en roll i etiologin för olika orala sjukdomar, såsom periodontit, pulpitis, pericoronitis, cellulit och osteomyelit. För att förstå rollen av bakterier i patogenesen av sjukdomen och för att övervaka effekterna av behandlingar, är viktig lokalisering av bakterier i vävnaden. Närvaron av bakterier inom tandköttsvävnad från patienter med parodontit har visats med hjälp av olika metoder, bland annat elektronmikroskopi 1,2, immunohistokemi och immunofluorescens med användning av bakteriespecifika antikroppar 3-7, och fluorescent in situ hybridisering (FISH) 8 med en fluorescence- märkt oligonukleotidprob inriktning 16S rRNA. Ändå är dessa metoder inte så vanligt på grund av tekniska begränsningar eller svårigheter. Jämfört med antikroppar, sonder inriktade 16S rRNA är lätta att producera och uppnå arter-specificitet. FISK har visat sig vara ett utmärkt verktyg för visualisering av bactEria i deras naturliga miljöer såsom plack biofilm. Emellertid är tillämpningen av fisk till vävnadsprover begränsad på grund av autofluorescens av olika vävnadskomponenter. Till exempel, den starka autofluorescens av röda blodkroppar ofta försvårar tillämpningen av fluorescensteknik till inflammerade vävnader när de omfattar blödning 9.
För att lokalisera bakterier inom de inflammerade gingivala vävnaderna, därför, en in situ-hybridisering med användning av en digoxigenin (DIG) -märkt DNA-sond har utvecklats och framgångsrikt tillämpats 10,11. Här ett detaljerat protokoll för lokalisering av bakterier inom paraffininbäddade vävnader med hjälp av P. gingivalis specifika och universella eubakteriella sonder har beskrivits. Det är särskilt inriktat på standardisering av metoden så att liknande resultat kan reproduceras i andra laboratorier. Detta protokoll möjliggör lokalisering av bakterier inom sitt histologiska sammanhang och Results är mycket reproducerbar. Det beskrivna protokollet kan användas för att lokalisera bakterier antingen i en artspecifik eller universell sätt i olika vävnader. Universal sond är speciellt användbar för att detektera bakterier i polymikrobiella sjukdomar och för att studera en potentiell roll bakterier i sjukdomar där är inte känt vilken roll specifika bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sond Framställning
- PCR-amplifiering av sonden
- För P. gingivalis specifik sond, förstärka en 343-bp DNA-fragment av P. gingivalis 16S rRNA genom PCR med användning av genomiskt DNA från P. gingivalis och följande primers: 5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'och 5'-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. Utför amplifieringar med följande cykelbetingelser: 35 cykler vid 95 ° C under 30 sek, 60 ° C under 30 sek, och 72 ° C under 1 min 20 sek, följt av en 5 min förlängning vid 72 ° C 10,11.
- Förstärka eubakteriell sonden med hjälp av en 70-bp DNA-fragment (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') syntetiserades som en oligonukleotid och följande primers: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' och 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3 '11. Utför förstärkningar med följande cykelbetingelser: 40 cyklervid 9 4 ° C under 30 sek, 60 ° C under 30 sek och 72 ° C under 1 min 20 s följt av en 5 min förlängning vid 72 ° C 11,12. - Fällning PCR-produkterna (≥500 il) genom tillsats av 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 100% etanol (vid en 10: 1: 2 förhållande) och inkubering vid -20 ° C under 2 h.
- Centrifugera blandningen vid 14.000 xg under 15 minuter, återsuspendera pelleten i 100 | il TE-buffert, och mäta DNA-koncentrationen genom optisk densitet vid 260 nm.
- DIG-märkning med användning av ett DIG-DNA-märkning och detektionskit
- Blanda 3 ug av proben med vatten till en slutlig volym av 15 | il.
- Denaturera DNA: t vid 95 ° C under 10 min och snabbt kyla på is.
- Lägg 2 ul av 10x hexanukleotid blandning, 2 ^ il dNTP-märkningsblandning, och ett pl av Klenow-enzym till 15 ul av den denaturerade DNA: t.
- Blanda och inkubera vid 37 ° C under 24 h till 48 h och stoppa reaktionen genom upphettning vid 65 ° C.
- Kontrollera känslighet DIG-märkta proben med användning av ett DIG-DNA-märkning och detektionskit
- Manuellt ladda en pl av serieutspädningar av den positiva kontrollsonden som tillhandahålls i kitet och en ng av DIG-märkta proben på nylonmembran och torka under 5 min vid RT.
- Kortfattat suga membranet i 2 x SSC-buffert (0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitrat, pH 7,0) och inkubera membranet vid 80 ° C under 1 h för att immobilisera DNA: t.
- Kortfattat suga membranet i maleinsyra buffert (MAB, 0,1 M maleinsyra, 0,15 M NaCl, pH 7,5) och inkubera med anti-DIG alkalisk fosfatas (AP) -konjugerad antikropp utspädd (1: 5000) i 6 ml blockeringslösning tillgänglig i satsen vid RT under 30 minuter.
- Tvätta membranet med MABT (MAB innehållande 1% Tween 20) och applicera 40 pl av NBT / BCIP-lösning blandas med 2 ml buffert detektering (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, pH 9,5) på membran för en minut. Om känsligheten hos den märkta proben ärinte tillfredsställande, upprepa steg från 1.1.3 till 1.3.4.
- Mät DNA-koncentrationen av den märkta proben (OD260) och justera koncentrationen till 100 ng il -1.
- Kontrollera specificiteten av DIG-märkta proben
- Denaturera genomiska DNA-prover (25 ng 3 il -1 per varje prov) från olika bakteriearter, inklusive bakterien är målet för den specifika sonden, vid 95 ° C under 10 min och snabbt kyla på is.
- Ladda manuellt den denaturerade DNA på nylonmembran och torka i 20 minuter vid RT.
- Kortfattat suga membranet i 2 x SSC-buffert och inkubera membranet vid 80 ° C under 2 timmar för att immobilisera DNA: t.
- Blockera membranet med en blockeringslösning vid RT under 1 timme.
- Späd sonden vid 1 ng il -1 i hybridiseringsbuffert, denaturera utspädda sonder, och tillämpas på membranet.
- Inkubera membranet vid 45 ° C under 1 timme.
- Tvätta membranet tregånger med 2 x SSC-buffert.
- Kortfattat blöta membranet i MAB.
- Inkubera med anti-DIG-AP-konjugerad antikropp utspädd (1: 2000) i 6 ml av blockeringslösning vid RT under 1 timme.
- Tvätta membranet med MABT och applicera 40 pl av NBT / BCIP-lösning blandas med 2 ml detekteringsbuffert.
- När sonden inte uppnår förväntad specificitet, öka hybridisering temperatur tills specificiteten observeras.
2. In Situ Hybridisering
Obs! För att undvika uttorkning av prover och reagenser, utföra alla inkubationer i en fuktig kammare fodrad med våta pappershanddukar.
- De-paraffinization och rehydrering av vävnadssnitt
- Förbered 4 pm tjocka vävnadssnitt från paraffininbäddade block. Formalin, paraformaldehyd, och zink-baserade fixativ är förenliga med detta protokoll.
- Förbered alla reagenser som använder DEPC-behandlat vatten.
- Värme glider i en torr ugn vid 60 ° C under 30 minuter och inkubera objektglasen vid RT i 30 min.
- Doppa objektglasen i 100% xylen under 5 minuter tre gånger; använda färsk xylen varje gång.
Obs! Gör detta de-vaxning förfarandet i en kemisk dragskåp. - Doppa objektglasen i 100% etanol under 5 minuter två gånger, med användning av färsk etanol varje gång, och rehydrera exemplar i seriell 90%, 80% och 70% etanollösningar för 5 min vardera.
- Sänk ned objektglasen i DEPC-behandlat vatten under 1 min och tvätta objektglas i DEPC-behandlad PBS (pH 7,4) under 6 min.
- Förbehandlingar av vävnadssnitt
- Doppa objektglasen i 0,1 N klorvätesyra under 20 min och tvätta objektglas i DEPC-behandlat vatten under 30 s.
- Rita en hydrofob barriär som omger prover med ett vax penna.
Obs: Storleken på den hydrofoba barriären beror på storleken av prover. Därför volymerna av reagens som användes i följande steg varierar beroende på storleken på prover utan måste fylla hydrophobic barriär (50 ^ för små prover och 400 pl för stora exemplar). - Behandla prover med 50 till 400 | il proteinas K (1 till 10 ^ g ml -1 i DEPC-behandlad PBS) i en torr ugn vid 37 ° C under 30 min och tvätta objektglas i DEPC-behandlad 1x PBS under 1 minut.
- Blötglasen i 4% paraformaldehyd i DEPC-behandlad PBS under 10 min, därefter tvätta objektglas i DEPC-behandlad PBS under 1 minut.
- Blötglasen i 0,1 M trietanolamin-HCl (pH 8,0) innehållande 0,5% ättiksyraanhydrid under 20 min och tvätta objektglas i DEPC-behandlat vatten under 30 s.
- Hybridisering med sond och tvättning
- Doppa objektglasen i 2 x SSC-buffert under 20 min.
- Späd sonden vid 1 ng il -1 i hybridiseringsbuffert (4x SSC, 50% [volym / volym] formamid, 1 x Denhardts lösning, 10% [vikt / volym] dextransulfat, 0,1% [vikt / volym] natriumdodecylsulfat, 0,4 mg ml -1 laxsperma DNA). För negativa kontroller, blanda den märkta proben meden 10-faldig överskottsmängd av icke-märkt prob.
- Denaturera utspädda prober och tillämpa 50 till 400 pl på vävnadssnitt. Placera ett täckglas på objektglaset och täta med nagellack.
- Värmeglasen i PCR-maskin vid 90 ° C under 10 minuter och Inkubera objektglasen i en fuktkammare O / N vid 45 ° C eller optimal temperatur bestäms i steg 1.4.11.
- Kyl objektglasen vid 4 ° C i 30 minuter, ta bort täckglas, och doppa glasen på ett seriellt SSC-buffert som följande sätt: 4x SSC under 10 minuter, förvärmda (45 ° C) 2x SSC under 20 minuter, 2 x SSC under 10 min och 0,2 x SSC under 10 min.
- Detektion med anti-DIG-AP-konjugerad antikropp
- Tvätta diabilder i MABT under 5 min.
- Blockera med 50 till 400 | il blockeringslösning med 1% Tween 20 under 20 min.
- Lägg 50 till 400 | il av anti-DIG-AP-antikropp utspädd i blockeringslösning (1: 1000) anld inkubera vid 37 ° C under 90 minuter.
- Tvätta diabilder i MABT under 10 minuter. <li> Doppa glasen i detekteringsbuffert innehållande 1% Tween 20 under 5 min.
- Behandla med 50 till 400 μ av 1 mM levamisol (i detekteringsbuffert innehållande 1% Tween 20) under 5 min för att inaktivera endogen alkaliskt fosfatas.
- Fördela 50 till 400 | il av den förblandade NBT / BCIP-lösning (utspädd i buffert detektering vid ett: 100) på varje prov och inkubera objektglasen i en fuktig kammare vid RT under 2 till 3 timmar, tills den utvecklade signalen är tillfredsställande.
- Skölj objektglasen med avjoniserat vatten för att stoppa visualisering och applicera 50 till 400 pl av 0,05% [vikt / volym] metyl grön som en räknare fläck vid 37 ° C under 10 minuter.
- Skölj objektglasen med avjoniserat vatten, torka i 100% etanol, och doppa i xylen.
- Applicera 80 pl monteringslösning på varje bild och täck med täckglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar prickblotting av DIG-märkta sönder jämfört med den positiva kontrollsonden i kitet för att bestämma deras känslighet. Den 343 bp P. gingivalis specifik sond är 25 gånger känsligare än 70 bp eubakteriell sond. Figur 2 visar in situ hybridisering av tandkötts vävnaderna från patienter med kronisk parodontit för detektion av P. gingivalis och eubakterier. Bakterie signaler, som visas i violett, upptäcktes i epitel, lamina propria, och biofilm som ligger utanför vävnaden. Emellertid fördelningen av P. gingivalis och eubakterier inom tandköttsvävnaden var annorlunda. Vid hög förstoring (1,000X), olika former (kock, stång, spolformade, och håriga form) av bakterier var synliga med hjälp av eubakteriell sonden, medan endast stavformade bakterier upptäcktes av P. gingivalis specifik sond. De spridda former av bakterie signalerobserverades också.
Hajishengallis et al., visade den viktiga roll som bakteriefloran i utvecklingen av P. gingivalis -inducerad experimentell periodontit hos möss 14. Tillämpningen av dextransulfat natrium (DSS), en täta fogar (TJ) -disrupting kemiska, på tandköttsslemhinna inducerad parodontit och alveolär benförlust hos möss 13. Den eubakteriell sonden framgångsrikt upptäckt bakterier i tandkötts vävnader från DSS grupp som inte upptäcktes av P. gingivalis specifik prob (Figur 3).
Den eubakteriell sonden är användbar för att studera den potentiella inblandning av bakterier i andra sjukdomar. Eftersom International Agency for Research on Cancer betecknas Helicobacter pylori som en grad I cancerframkallande för magcancer 15, har potential inblandning av bakterier i utvecklingen av andra cancerformer studerats ingående. När SETGÄRDER av lung biopsier diagnostiseras med skivepitelcancer var in situ hybridiserade med eubakteriell sond, var bakterier upptäckts både inom tumörcellerna och bland de omgivande stromaceller / infiltrerande celler (Figur 4). I situ hybridisering använder eubakteriell proben också tillämpas på utforska förekomsten av bakterier i lesioner av oral lichen planus, en inflammatorisk immunsjukdom med okänd etiologi. Intressant nog var bakterie signaler detekterades inte bara inom epitel utan även i lamina propria, där bandliknande infiltrering observerades. Under hög förstoring, ades bakterie signalerna detekteras i kärnorna hos många celler (Figur 5).
Figur 1. Känslighets test av DIG-märkta prober. Serieutspädda special märkta sönder och en positiv control sond i kitet var pricken blottades med anti-DIG-AP-antikropp. Efter tillsats av substratet, blotten med P. gingivalis specifik sond utvecklades under 30 sekunder, medan blot med eubakteriell sonden var utvecklad för 1 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Detektion av bakterier inom tandkötts vävnaderna från patienter med kronisk parodontit. Delar av tandkötts biopsier från den friska webbplatsen (A) och sjuka plats (B) hos en patient med parodontit utsattes för hematoxylin-eosin (H & E) färgning eller in situ-hybridisering med antingen P. gingivalis specifik sond eller eubakteriell sonden. Negative kontroller hybridiserades med proben blandades med 10-faldigt överskott av omärkt sond. Det förstorade området indikeras med en fyrkantig låda. Representativa positiva signaler, som visas i violett, är markerade med tunna pilar. Tjocka pilar indikerar plack biofilm utanför vävnaden. På skylten biofilm undersöktes vid 1,000X förstoring visas i inläggningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Detektion av orala bakteriefloran i den gingivala vävnaden hos mus. Experimentell periodontit inducerades i BALB / c-möss genom oral inokulering av P. gingivalis (PG) eller tillämpningen av DSS på tandköttsslemhinnan. Gingivala sektioner från möss utsattes för H & E-färgning eller in situ hybridisering med antingen < em> P. gingivalis specifik sond eller eubakteriell sonden. Representativa positiva signaler, som visas i violett, är markerade med pilar. Original förstoring är x400. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Upptäckt av bakterier inom cancer skada. De delar av lung biopsier från patienter diagnostiserade med skivepitelcancer färgades med H & E eller in situ hybridiserade med antingen den universella eubakteriell sonden eller negativa kontrollsonden. Det förstorade området indikeras med en fyrkantig låda. Representativa positiva signaler, som visas i violett, är markerade med pilar. Gräns av tumörceller indikeras med streckade linjer.Arget = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Upptäckt av bakterier inom lesioner av oral lichen planus. De delar av biopsi från munslemhinnan diagnosen oral lichen planus färgades med H & E eller in situ hybridiserade med antingen den universella eubakteriell sonden eller negativa kontrollsonden. De förstorade områdena är markerade med en fyrkantig låda. Representativa positiva signaler, som visas i violett, är markerade med pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här ett protokoll för att lokalisera bakterier inom paraffininbäddade vävnader med hjälp av ett DIG-märkt DNA-sond har beskrivits. Sonden riktar de DNA- eller RNA-molekyler av bakteriell 16S rRNA-genen och 16S rRNA-inriktnings sökfragment kan utformas som antingen artspecifika eller universell. Den specifika hybridiseringen av P. gingivalis specifik sond till P. gingivalis men inte andra orala bakterier har tidigare visats 10. Däremot eubakteriell proben hybridiserad till all bakterie testade genomiska DNA (17 olika arter), även om hybridisering effektivitet varierade 12. Antalet T-nukleotider inom sonden avgör effektiviteten i DIG-märkning. Framställning av ett DIG-märkt sond med hög känslighet är det mest kritiska steget för ett framgångsrikt genomförande av det beskrivna protokollet. Behandling av prover med saltsyra förbättrar signal-brusförhållandet genom extraktion av proteiner och partiell hydrolysis av målsekvenser. En ökning i koncentrationen av proteinas K ökar mål-tillgängligheten av prober men reducerar vävnads bevarande. Därför är det rekommenderat att testa flera koncentrationer av proteinas K, beroende på vilka typer av vävnad. Den acetyleringssteget minskar bakgrundsbindning av den negativt laddade sonden till proteinerna hos vävnaden genom acetylering de positivt laddade aminogrupper. Efter en serie av dessa framställningssteg, vävnadssnitt riva lätt, måste sålunda hanteras med försiktighet. Bakgrund är minimal jämfört med fisk. Dock bör signalerna från vävnader med hög endogen alkaliskt fosfatasaktivitet såsom ben och slemkörtlarna kritiskt tolkas.
PCR-amplifierade DNA-sonder är lätta att framställa och stabila jämfört med RNA-prober. Immunhistokemisk detektion av hybridiserade prober medger identifiering av histologiska strukturer genom jämförelse med H & E färgade delar: epitel,bindväv, inflammatoriska infiltrat, och blodkärlen är väl särskiljas. En av begränsningarna i det beskrivna protokollet är oförmågan att applicera multipla sönder samtidigt. Dessutom är begränsad uteslutande av signalerna från bakteriella föroreningar på ytan av sektionerna.
Detta protokoll kan anpassas för att upptäcka andra bakteriella transkript inom vävnadssnitt 16. Dessutom kan detta protokoll utvidgas till att fördubbla färgning med immunhistokemisk detektion av en värdcellmarkör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ett bidrag (2013R1A1A3005669) från National Research Foundation of Korea och ett bidrag (HI13C0016) av den koreanska hälsoteknik FoU-projekt vid hälsovårdsministeriet & Welfare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
