Introduction
細菌は、歯周炎、歯髄炎、歯冠周囲炎、蜂巣炎、骨髄炎などの様々な口腔疾患の病因における役割を果たしています。疾患の病因における細菌の役割を理解し、治療の効果を監視するために、組織内の細菌の局在化は重要です。歯周炎患者からの歯肉組織内の細菌の存在は、蛍光-を用いたin situハイブリダイゼーション （FISH）8 の細菌に特異的な抗体3-7、および蛍光を用いて、電子顕微鏡1,2を含む様々な方法を用いて、免疫組織化学および免疫蛍光が示されています16S rRNAのをターゲットに標識されたオリゴヌクレオチドプローブ。それにもかかわらず、これらの方法は広く、技術的制限または困難に使用されていません。抗体と比較して、16SのrRNAを標的とするプローブを生成し、種特異性を達成することは容易です。 FISHはBACTの可視化のための優れたツールであることが証明されましたこのようなプラークバイオフィルムとしての自然環境でERIA。しかし、組織サンプルのFISHの適用は、様々な組織成分の自己蛍光に限定されます。彼らは9出血含むとき、例えば、赤血球の強い自己蛍光は、しばしば、炎症組織への蛍光技術の適用を妨げます。
炎症を起こした歯肉組織内の細菌を局在化するためには、従って、ジゴキシゲニン（DIG）を用いたin situハイブリダイゼーション法での DNAプローブの開発に成功10,11に適用された標識。 Pを使用してパラフィン包埋組織内の細菌の局在化のためここでは詳細なプロトコールジンジバリス特異的およびユニバーサル真正細菌プローブが記載されています。同様の結果は、他の研究室で再現することができるように、これは、特に方法の標準化に焦点を当てています。このプロトコルは、その組織学的コンテキストとRESU内細菌の局在化を可能にしますLTSは非常に再現性があります。説明されたプロトコルのいずれかの様々な組織における種特異的または普遍方法で細菌をローカライズするために使用することができます。ユニバーサルプローブは、多菌性疾患中の細菌を検出すると、特定の細菌の役割は知られていない疾患における細菌の潜在的な役割を研究するために特に有用です。
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Protocol
1.プローブの準備
- プローブのPCR増幅
- Pのジンジバリス特異的プローブは、Pの343 bpのDNA断片を増幅しますPのゲノムDNAを用いたPCRによるジンジバリスの16SrRNA ジンジバリスと以下のプライマー：5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'および5'-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10。 72℃で10,11で5分間の延長が続く1分20秒、30秒、30秒、95℃で35サイクル、60℃、72℃以下のサイクル条件で増幅を行います。
- 70-bpのDNA断片（5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGを使用して、真正細菌のプローブを増幅
TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 'オリゴヌクレオチドおよび以下のプライマーとして合成さ）：5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' '11および5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3。 40サイクル：次のサイクル条件で増幅を行います30秒30秒9、4℃、60℃、1分間72℃11,12で5分間の延長に続く20秒間の72℃で。 - 2時間-20℃でインキュベートし、3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と（：1：2の比率10で）100％エタノールを添加することにより、PCR産物（≥500μl）を沈殿させます。
- 遠心分離機15分間14,000×gで混合物を、100μlのTE緩衝液にペレットを再懸濁し、260 nmでの光学濃度によりDNA濃度を測定します。
- DIG DNA標識および検出キットを用いてDIGは、標識
- 15μlの最終容量まで水でプローブの3μgのを混ぜます。
- 10分間95℃でDNAを変性し、すばやく氷上で冷やします。
- 変性DNAの15μlに10倍のヘキサヌクレオチドミックス2μlの、のdNTP標識ミックス2μlの、およびクレノウ酵素の1μlを添加します。
- 混合し、48時間に24時間、37℃でインキュベートし、65℃で加熱することによって反応を停止させます。
- DIG DNA標識および検出キットを用いてDIG標識プローブの感度を確認し
- 手動で室温で5分間、キットに提供ポジティブコントロールプローブの連続希釈液を1μl、ナイロン膜上のDIG標識プローブ1ngの、乾燥をロードします。
- 簡潔には2×SSC緩衝液（0.3MのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0）中の膜を浸漬し、DNAを固定化するために1時間80℃で膜をインキュベートします。
- 提供ブロッキング溶液6mlに：簡単に言うとマレイン酸バッファー（MAB、0.1 Mマレイン酸、0.15 MのNaCl、pH7.5）で、膜を浸して、抗DIGアルカリホスファターゼ（AP）でインキュベートする抗体希釈（5000 1）抱合30分間、室温でキット中。
- MABT（MABを1％Tween 20を含む）を有する膜を洗浄し、上に2ミリリットルの検出緩衝液（0.1 Mトリス塩酸、0.1 MのNaCl、0.05 MのMgCl 2、pHは9.5）と混合し、NBT / BCIP溶液40μlを適用1分間の膜。標識プローブの感度がある場合1.1.3から1.3.4へのステップを繰り返し、満足しません。
- 標識プローブ（OD260）のDNA濃度を測定し、μlのngの100の濃度に調整-1。
- DIG標識プローブの特異性を確認してください
- 10分間95℃で、特異的プローブによって標的細菌を含む様々な細菌種からのゲノムDNA試料（25ngの3μL-1各サンプルあたり）を変性させ、すぐに氷上で冷やします。
- 手動で室温で20分間、変性ナイロン膜上のDNAと乾燥をロードします。
- 簡単に言うと2×SSC緩衝液中で膜を浸して、DNAを固定化するために80℃で2時間、膜をインキュベートします。
- 1時間室温でブロッキング溶液で膜をブロックします。
- 、ハイブリダイゼーション緩衝液中で-1μlのngの1でプローブを希釈し希釈したプローブを変性させ、膜上に適用されます。
- 1時間45℃で膜をインキュベートします。
- メンブレンを洗浄32×SSC緩衝液で倍。
- 簡単に言うとMABに膜を浸します。
- 室温で1時間ブロッキング溶液6mlに：（2000 1）希釈した抗DIG APコンジュゲート抗体とインキュベートします。
- MABTでメンブレンを洗浄し、2ミリリットルの検出緩衝液を混合し、NBT / BCIP溶液40μlを適用します。
- プローブが予想特異性を達成していない場合の特異性が観察されるまで、ハイブリダイゼーション温度を上昇させます。
in situハイブリダイゼーション 2
注：検体と試薬の乾燥を避けるために、湿ったペーパータオルを敷いた加湿チャンバー内で全てのインキュベーションを行います。
- 組織切片の脱パラフィン除去し、再水和
- パラフィン包埋ブロックから厚さ4μmの組織切片を準備します。ホルマリン、パラホルムアルデヒド、及び亜鉛系固定液は、このプロトコルに対応しています。
- DEPC処理水を用いて、全ての試薬を準備します。
- 30分間60℃で乾燥オーブン中で加熱し、スライドを室温で30分間スライドをインキュベートします。
- 5分間3回、100％キシレンでスライドを浸します。新鮮なキシレンを毎回使用しています。
注：化学ドラフト内でこの脱脂の手順を実行します。 - 新鮮なエタノールを毎回使用して、二回5分間、100％エタノールでスライドを浸し、シリアル、90％、80％、5分間、それぞれ70％エタノール溶液中の試料を再水和。
- 1分間のDEPC処理水にスライドを浸し、6分間DEPC処理PBS（pH7.4）中でスライドを洗浄します。
- 組織切片の前処理
- 20分間0.1 N塩酸でスライドを浸し、30秒間DEPC処理水でスライドを洗浄します。
- ワックスペンを使用して、試験片の周囲の疎水性の障壁を描画します。
注：疎水性の障壁の大きさは、標本の大きさに依存します。したがって、次の手順で使用される試薬の体積は試料のサイズに応じて異なるが、HYを充填する必要がありますdrophobicバリア（小標本と大きな標本のために400μlの50μL）。 - 30分間37℃で乾燥オーブン中でプロテイナーゼKの50〜400μlの（1から10μgのml -1のDEPC処理したPBS中）を用いて検体を処理し、1分間、DEPC処理した1×PBSでスライドを洗浄します。
- 1分間のDEPC処理PBSでスライドを洗浄し、その後、10分間、DEPC処理したPBS中の4％パラホルムアルデヒド中にスライドを浸します。
- 20分間0.5％の無水酢酸を含む0.1Mトリエタノールアミン - 塩酸（pH8.0）でのスライドを浸し、30秒間DEPC処理水でスライドを洗浄します。
- プローブと洗浄とのハイブリダイゼーション
- 20分間、2×SSC緩衝液でスライドを浸し。
- 1 ngのμL-1のハイブリダイゼーション緩衝液（4×SSC、50％[体積/体積]ホルムアミド、1×デンハルト溶液、10％[重量/容量]デキストラン硫酸、0.1％[重量/容量]ドデシル硫酸ナトリウムでプローブを希釈0.4ミリグラムml -1のサケ精子DNA）。陰性対照のために、で標識したプローブをミックス非標識プローブの10倍過剰量。
- 希釈されたプローブを変性させ、組織切片上に50〜400μLを適用します。スライドにカバースリップを置き、マニキュアで密封します。
- 45℃または最適な温度での加湿チャンバーのO / Nで10分間、90℃でのPCR装置内の熱スライドとインキュベートスライドはステップ1.4.11で決定されました。
- 、4℃で30分間スライドを冷却カバースリップを削除し、以下のようなシリアルSSC緩衝液でスライドを浸す：10分間の4×SSC、10のために20分間予熱した（45℃）2×SSC、2×SSC分、および10分間の0.2X SSC。
- 抗DIG AP結合抗体で検出
- 5分間MABTでスライドを洗浄します。
- 20分間、1％Tween 20でブロッキング溶液の50〜400μlのブロック。
- 溶液（1：1,000）をブロックに希釈した抗DIG-AP抗体の50〜400μl添加しanld 37℃で90分間インキュベートします。
- 10分間MABTでスライドを洗浄します。 <Liが> 5分間、1％Tween 20を含む検出緩衝液中でスライドを浸し。
- μ1mMのレバミゾールの内因性アルカリホスファターゼを不活性化するために5分間（1％Tween 20を含む検出緩衝液中で）50〜400で処理します。
- 各試料にと開発された信号が良好になるまで2〜3時間、室温で加湿チャンバー内でスライドをインキュベート：（100 1で検出緩衝液で希釈）予混合NBT / BCIP溶液を50〜400μLを配布します。
- 可視化を停止し、10分間37℃で0.05％カウンター染色として[重量/容量]メチルグリーンの50〜400μLを適用し、脱イオン水でスライドをすすぎます。
- 、脱イオン水でスライドを洗浄し、100％エタノール中で脱水し、キシレン中に浸します。
- 各スライド上に取り付け、溶液の80μLを適用し、カバースリップでカバーしています。
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Representative Results
図1に示すように、それらの感受性を決定するためのキットで提供ポジティブコントロールプローブと比較してDIG標識プローブのドットブロッティング。 343 bpのP.ジンジバリス特異的プローブは、70塩基対真正細菌プローブよりも25倍より敏感である。Pの検出のための慢性歯周炎の患者から得られた歯肉組織のin situハイブリダイゼーション 図2図 ジンジバリスと真正細菌。紫色に示す細菌の信号は、組織の外側に位置する上皮、粘膜固有層、およびバイオフィルム内で検出されました。しかし、Pの分布歯肉組織内ジンジバリスと真正細菌は異なっていました。唯一の棒状の細菌はP.によって検出しながら、高倍率（1,000倍）で、細菌の様々な形状（コッカス、ロッド、紡錘状、毛状の形）は、真正細菌プローブを使用して見ることができましたジンジバリス特異的プローブ。細菌信号の分散形また、観察されました。
Hajishengallis ら 。 P.の開発における共生細菌の重要な役割を実証しましたジンジバリスは、マウス14で実験的歯周炎を誘発しました。歯肉粘膜誘発される歯周炎やマウス13で歯槽骨の損失へのデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の適用、化学を-disruptingタイトジャンクション（TJ）、。真正細菌プローブが正常にPによって検出されなかったDSS群から歯肉組織内の細菌を検出しましたジンジバリス特異的プローブ（ 図3）。
真正細菌プローブは、他の疾患における細菌の関与の可能性を研究するために有用です。私は胃がんのため15発癌物質グレードとしてヘリコバクター·ピロリ指定国際がん研究機関があるため、他の癌の発生における細菌の潜在的な関与が広く研究されています。ときSE扁平上皮癌と診断された肺生検のctionsは真正細菌プローブとハイブリダイズし、その場にいた、細菌はまた、に適用された真正細菌プローブを用いたin situハイブリダイゼーション （ 図4）浸潤細胞/腫瘍細胞内および周囲の間質の間の両方が検出されました口腔扁平苔癬、未知の病因を有する炎症性免疫疾患の病変における細菌の存在を探ります。興味深いことに、細菌信号は上皮内だけでなく、帯状の浸潤が観察された固有層のみならず検出されました。高倍率の下では、細菌の信号は、多くの細胞（ 図5）の核で検出されました。
DIG標識プローブの図1.感度試験。連続希釈カスタム標識プローブと正CONTRキットで提供OLプローブはドット抗DIG-APコンジュゲート抗体でブロットしました。基質を添加した後、Pでブロット真正細菌プローブとブロットを1分間に開発している間にジンジバリス特異的プローブは、30秒のために開発されました。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
慢性歯周炎の患者から得られた歯肉組織内細菌の図2.検出。健全なサイト（A）と歯周炎患者の病変部位（B）から歯肉生検の切片をヘマトキシリン-エオシン（H＆E）に供した染色またはP.のいずれかとのin situハイブリダイゼーションジンジバリス特異的プローブまたは真正細菌プローブ。 Negativ電子制御は、10倍過剰の非標識プローブと混合し、プローブとハイブリダイズさせました。拡大エリアは、正方形のボックスが表示されます。紫色に示す代表的な陽性シグナルは、細い矢印でマークされます。太い矢印は、組織外のプラークバイオフィルムを示しています。 1,000倍の倍率で調べたプラークバイオフィルムを挿入図に示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
検出マウスの歯肉組織内の経口共生細菌の図3実験的歯周炎は、Pの経口接種によってBALB / cマウスにおいて誘導されましたジンジバリス （PG）または歯肉粘膜へのDSSのアプリケーションです。マウスからの歯肉切片をH＆E染色にどちらかとin situハイブリダイゼーションで行いました< em>のP。ジンジバリス特異的プローブまたは真正細菌プローブ。紫色に示す代表的な陽性シグナルは、矢印でマークされます。オリジナルの倍率は400倍である。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
癌病巣内細菌の図4の検出。扁平上皮癌と診断された患者からの肺生検の切片をH＆Eまたはユニバーサル真正細菌プローブまたはネガティブコントロールプローブのいずれかとハイブリダイズインサイチュで染色しました。拡大エリアは、正方形のボックスが表示されます。紫色に示す代表的な陽性シグナルは、矢印でマークされます。腫瘍細胞の境界は点線で示されています。ARGET = "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
口腔扁平苔癬の病変内細菌の図5の検出。口腔扁平苔癬と診断頬粘膜からの生検の切片をH＆Eで、ユニバーサル真正細菌プローブまたはネガティブコントロールプローブのいずれかとハイブリダイズし、その場で染色しました。拡大エリアは四角い箱で示されています。紫色に示す代表的な陽性シグナルは、矢印でマークされている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ここで、DIG標識DNAプローブを用いてパラフィン包埋組織内の細菌をローカライズするためのプロトコルが記載されています。プローブは、細菌の16S rRNA遺伝子のDNAまたはRNA分子を標的とし、16S rRNAの標的プローブは、いずれかの種特異的または普遍として設計することができます。 P.の特異的ハイブリダイゼーションP.ジンジバリスに対する特異的プローブジンジバリスではなく、他の口腔内細菌には、以前に10が示されています。ハイブリダイゼーション効率が12を変化させるが、これとは対照的に、真正細菌プローブは、試験したすべての細菌ゲノムDNA（17異なる種）にハイブリダイズしました。プローブ内のT-ヌクレオチドの数は、DIG標識の効率を決定します。高感度のDIG標識プローブの製造は、記載されたプロトコルの実装を成功させるための最も重要なステップです。塩酸での試料の処理は、タンパク質の抽出及び部分hydrolysi介して信号対雑音比を向上させます標的配列のS。プロテイナーゼKの濃度の増加は、プローブのターゲットアクセシビリティは向上しますが、組織保存を低減します。したがって、組織の種類に応じて、プロテイナーゼKのいくつかの濃度をテストすることをお勧めします。アセチル化工程は、正に荷電したアミノ基をアセチル化することにより、バックグラウンド組織のタンパク質に負に帯電したプローブの結合は減少します。これらの準備ステップの一連の後、組織切片は、従って、容易に引き裂く慎重に取り扱われなければなりません。背景には、魚と比べ最小限です。しかし、このような骨や粘液腺などの高内因性アルカリホスファターゼ活性を有する組織からの信号を批判的に解釈されるべきです。
PCR増幅されたDNAプローブは、RNAプローブに比べて製造が容易かつ安定しています。ハイブリダイズしたプローブの免疫組織化学的検出は、H＆E染色した切片と比較して、組織学的構造の同定を可能にする：上皮を、結合組織、炎症性浸潤、および血管が十分に区別されます。記載されたプロトコルの制限の1つは、同時に複数のプローブを適用することができないことです。また、セクションの表面の細菌汚染物質からの信号の排除が限定されています。
このプロトコルは、組織切片16内の他の細菌の転写物を検出するように適合させることができます。また、このプロトコルは、宿主細胞マーカーの免疫組織化学的検出を用いて二重染色に拡張することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、韓国国立研究財団からの助成金（2013R1A1A3005669）と韓国の医療技術のR＆Dプロジェクト、保健福祉省の補助金（HI13C0016）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
