Introduction
البكتيريا تلعب دورا في مسببات الأمراض المختلفة عن طريق الفم مثل اللثة، التهاب لب السن، التهاب حوائط التاج، التهاب النسيج الخلوي، والتهاب العظم والنقي. من أجل فهم دور البكتيريا في التسبب في المرض ورصد تأثير العلاج، وتوطين البكتيريا داخل الأنسجة هو المهم. وقد تبين وجود البكتيريا داخل أنسجة اللثة من المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الإلكترون المجهري 1،2، المناعية والمناعي باستخدام بكتيريا محددة الأجسام المضادة 3-7، وفلوري التهجين في الموقع (FISH) 8 في استخدام fluorescence- وصفت التحقيق النوكليوتيد استهداف 16S الريباسي. ومع ذلك، لا تستخدم هذه الأساليب على نطاق واسع بسبب قيود أو صعوبات التقني. مقارنة مع الأجسام المضادة، تحقيقات تستهدف 16S الريباسي سهلة لإنتاج وتحقيق الأنواع خصوصية. وقد ثبت FISH أن تكون أداة ممتازة لتصور من جرثومةeria في البيئات الطبيعية من قبيل بيوفيلم البلاك. ومع ذلك، تطبيق FISH لعينات الأنسجة محدودة بسبب تألق ذاتي من مختلف مكونات النسيج. على سبيل المثال، وتألق ذاتي قوي من خلايا الدم الحمراء في كثير من الأحيان يعيق تطبيق التكنولوجيا مضان إلى الأنسجة الملتهبة عندما تتضمن نزيفا 9.
من أجل توطين البكتيريا داخل أنسجة اللثة الملتهبة، لذلك، وهو في الموقع أسلوب التهجين باستخدام digoxigenin وقد وضعت (DIG) التحقيق DNA -labeled وتطبيقها بنجاح 10،11. هنا بروتوكول مفصلة لتوطين البكتيريا داخل أنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام P. وقد وصفت اللثوية تحقيقات eubacterial -specific والعالمية. ويركز بشكل خاص على توحيد طريقة بحيث نتائج مماثلة يمكن أن تكون مستنسخة في مختبرات أخرى. هذا البروتوكول يسمح توطين البكتيريا داخل سياقها النسيجي ودورة الفتشوبLTS هي تكرار للغاية. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لتوطين البكتيريا إما بطريقة أنواع محددة أو عالمية في الأنسجة المختلفة. التحقيق الشامل هو مفيدة بشكل خاص للكشف عن البكتيريا في الأمراض متعدد المكروبات ودراسة دور محتمل للبكتيريا في الأمراض التي لا يعرف دور البكتيريا محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحقيق التحضير
- PCR التضخيم لجنة التحقيق
- لP. اللثوية -specific التحقيق، تضخيم جزء DNA 343-BP من P. اللثوية 16S الريباسي بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي الجيني من P. اللثوية والاشعال التالية: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 "و5'- ACT CGT ATC دول مجلس التعاون الخليجي CGT TAT TC-3" (10). أداء التكبير مع الظروف دورة التالية: 35 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 20 ثانية يليه تمديد مدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية 10،11.
- تضخيم التحقيق eubacterial باستخدام 70-BP جزء DNA (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') توليفها باعتبارها قليل النوكليوتيد والاشعال التالية: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3 "و5'-AGG GTT GTT GCG CTC-3" (11). أداء التكبير مع الظروف دورة التالية: 40 دورةفي 9 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة 20 ثانية تليها تمديد مدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية 11،12. - ترسيب المنتجات PCR (≥500 ميكرولتر) وذلك بإضافة 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) والإيثانول بنسبة 100٪ (في 10: 1: 2 نسبة) وتفرخ في -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- الطرد المركزي الخليط في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة، Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من TE العازلة، وقياس تركيز الحمض النووي عن طريق الكثافة البصرية في 260 نانومتر.
- DIG العنونة باستخدام الوسم والكشف عن مجموعة DIG DNA
- مزيج 3 ميكروغرام من التحقيق مع الماء إلى الحجم النهائي من 15 ميكرولتر.
- تفسد الحمض النووي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والبرد بسرعة على الجليد.
- إضافة 2 ميكرولتر من 10X hexanucleotide المزيج، 2 ميكرولتر من dNTP وضع العلامات المزيج، و1 ميكرولتر من Klenow انزيم إلى 15 ميكرولتر من DNA التشويه والتحريف.
- خلط واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة، ووقف رد فعل عن طريق التسخين عند 65 درجة مئوية.
- تحقق من حساسية لجنة التحقيق المسمى DIG باستخدام الوسم والكشف عن مجموعة DIG DNA
- تحميل يدويا 1 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلي للتحقيق السيطرة الإيجابي المنصوص عليها في عدة و1 نانوغرام من التحقيق DIG المسمى على الغشاء النايلون وجاف لمدة 5 دقائق على RT.
- ينقع لفترة وجيزة الغشاء في 2X SSC العازلة (0.3 M كلوريد الصوديوم، و 30 ملي سيترات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0)، واحتضان الغشاء في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لشل حركة DNA.
- ينقع لفترة وجيزة الغشاء في المخزن حمض الماليك (MAB، 0.1 M حمض الماليك، 0.15 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5)، واحتضان مع مكافحة DIG الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) الأجسام المضادة -conjugated المخفف (1: 5000) في 6 مل من محلول حجب المقدمة في المجموعة في RT لمدة 30 دقيقة.
- يغسل الغشاء مع MABT (MAB تحتوي على 1٪ توين 20) وتطبيق 40 ميكرولتر من محلول NBT / BCIP مختلطة مع 2 مل كشف العازلة (0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، 0.1 M كلوريد الصوديوم، 0.05 M MgCl 2، ودرجة الحموضة 9.5) على غشاء لمدة 1 دقيقة. إذا كانت حساسية التحقيق المسمى هولا مرضية، كرر الخطوات من 1.1.3 إلى 1.3.4.
- قياس تركيز الحمض النووي لجنة التحقيق المسمى (OD260) وضبط تركيز إلى 100 نانوغرام ميكرولتر -1.
- تحقق خصوصية لجنة التحقيق المسمى DIG
- تفسد عينات من الحمض النووي الجينومية (25 نانوغرام 3 ميكرولتر -1 في كل عينة) من الأنواع البكتيرية المختلفة، بما في ذلك البكتيريا المستهدفة من قبل لجنة التحقيق الخاصة، في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة والبرد بسرعة على الجليد.
- تحميل يدويا DNA التشويه والتحريف على الغشاء النايلون وجافة لمدة 20 دقيقة في RT.
- ينقع لفترة وجيزة غشاء العازلة في 2X SSC واحتضان الغشاء في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لشل حركة DNA.
- منع الغشاء مع عرقلة الحل في RT لمدة 1 ساعة.
- تمييع التحقيق في 1 نانوغرام ميكرولتر -1 في المخزن التهجين، تفسد تحقيقات الواحد، وتطبيق على الغشاء.
- احتضان الغشاء في 45 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- يغسل الغشاء ثلاثمرات مع العازلة 2X SSC.
- ينقع لفترة وجيزة الغشاء في MAB.
- احتضان مع الأجسام المضادة لمكافحة DIG AP-مترافق المخفف (1: 2000) في 6 مل من عرقلة الحل في RT لمدة 1 ساعة.
- يغسل الغشاء مع MABT وتطبيق 40 ميكرولتر من محلول NBT / BCIP مختلطة مع 2 مل كشف العازلة.
- عندما التحقيق لا يحقق خصوصية المتوقع، وزيادة درجة الحرارة التهجين حتى يتم احترام خصوصية.
2. في الموقع التهجين
ملاحظة: لتجنب تجفيف العينات والكواشف، تنفيذ كافة حضانات في غرفة ترطيب اصطف مع مناشف ورقية مبللة.
- دي paraffinization والإماهة من أقسام الأنسجة
- إعداد 4 ميكرومتر أقسام الأنسجة سميكة من كتل جزءا لا يتجزأ من البارافين. الفورمالين، لامتصاص العرق، وتثبيتي القائم على الزنك متوافقة مع هذا البروتوكول.
- إعداد جميع الكواشف استخدام المياه المعالجة DEPC.
- الشرائح الحرارة في الفرن الجاف عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، واحتضان الشرائح في RT لمدة 30 دقيقة.
- تزج الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة 5 دقائق ثلاث مرات؛ استخدام زيلين جديد في كل مرة.
ملاحظة: هل هذا الإجراء الصبح دي في غطاء الدخان الكيميائي. - تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق مرتين، وذلك باستخدام الإيثانول النقي في كل مرة، وترطيب العينات في مسلسل 90٪، 80٪ و 70٪ حلول الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- تزج الشرائح في المياه DEPC المعاملة لمدة 1 دقيقة، ويغسل الشرائح في DEPC المعاملة PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 6 دقائق.
- المعالجة المسبقة للأقسام الأنسجة
- تزج الشرائح في 0.1 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 20 دقيقة ويغسل الشرائح في المياه DEPC المعاملة لمدة 30 ثانية.
- رسم حاجز مسعور المحيطة العينات باستخدام قلم الشمع.
ملاحظة: حجم حاجز مسعور يعتمد على حجم العينات. ولذلك، فإن حجم الكواشف المستخدمة في الخطوات التالية تختلف تبعا لحجم العينات ولكن لديها لملء HYحاجز drophobic (50 ميكرولتر لعينات صغيرة و 400 ميكرولتر لعينات كبيرة). - علاج العينات مع 50-400 ميكرولتر من بروتين K (1-10 ميكروغرام مل -1 في برنامج تلفزيوني DEPC المعاملة) في فرن جاف عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ويغسل الشرائح في DEPC المعاملة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 1 دقيقة.
- نقع الشرائح في 4٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني DEPC المعاملة لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني DEPC المعاملة لمدة 1 دقيقة.
- نقع الشرائح في 0.1 M ثلاثي إيثانول أمين، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة) التي تحتوي على 0.5٪ أنهيدريد الخل لمدة 20 دقيقة ويغسل الشرائح في المياه DEPC المعاملة لمدة 30 ثانية.
- التهجين مع التحقيق والغسيل
- تزج الشرائح العازلة في SSC 2X لمدة 20 دقيقة.
- تمييع التحقيق في 1 نانوغرام ميكرولتر -1 في المخزن التهجين (4X SSC، 50٪ [المجلد / المجلد] الفورماميد، والحل 1X دينهارت و10٪ [بالوزن / المجلد] كبريتات ديكستران، 0.1٪ [بالوزن / المجلد] كبريتات الصوديوم دوديسيل، 0.4 ملغ مل -1 DNA الحيوانات المنوية السلمون). لضوابط السلبية، مزيج من التحقيق المسمى معكمية زائدة بمقدار 10 أضعاف من التحقيق غير المسمى.
- تفسد تحقيقات المخفف وتطبيق 50-400 ميكرولتر على أقسام الأنسجة. وضع زلة غطاء على الشريحة وختم بطلاء الأظافر.
- الشرائح الحرارة في جهاز PCR في 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة واحتضان الشرائح في غرفة مرطب O / N عند 45 درجة مئوية أو درجة الحرارة المثلى قررت في خطوة 1.4.11.
- تبريد الشرائح في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وإزالة زلات غطاء، وتزج الشرائح في منطقة عازلة SSC المسلسل كما يلي: 4X SSC لمدة 10 دقيقة، قبل تحسنت (45 ° C) 2X SSC لمدة 20 دقيقة، 2X SSC ل10 دقيقة، و0.2x SSC لمدة 10 دقيقة.
- كشف مع الأجسام المضادة لمكافحة DIG AP-مترافق
- تغسل الشرائح في MABT لمدة 5 دقائق.
- منع مع 50-400 ميكرولتر من عرقلة الحل مع 1٪ توين 20 لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 50-400 ميكرولتر من مكافحة DIG-AP الأجسام المضادة المخفف في عرقلة الحل (1: 1000) anld احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
- تغسل الشرائح في MABT لمدة 10 دقيقة. <لى> تزج الشرائح العازلة في الكشف تحتوي على 1٪ توين 20 لمدة 5 دقائق.
- علاج مع 50-400 μ من 1 ملم الليفاميزول (في المخزن كشف تحتوي على 1٪ توين 20) لمدة 5 دقائق لتعطيل الذاتية الفوسفاتيز القلوية.
- توزيع 50-400 ميكرولتر من خلط حل NBT / BCIP (المخفف في المخزن كشف في 1: 100) على كل عينة واحتضان الشرائح في غرفة مرطب على RT لمدة 2 إلى 3 ساعات حتى وضعت إشارة مرضية.
- شطف الشرائح مع دي المتأينة المياه لوقف التصور وتطبيق 50-400 ميكرولتر من 0.05٪ [بالوزن / المجلد] الميثيل الأخضر بمثابة وصمة عار مكافحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- شطف الشرائح مع دي المتأينة المياه، ويذوى في الإيثانول بنسبة 100٪، وتزج في زيلين.
- تطبيق 80 ميكرولتر من محلول متزايدة على كل شريحة، وتغطي مع زلات الغطاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 1 يبين دوت النشاف تحقيقات DIG المسمى مقارنة مع لجنة التحقيق السيطرة الإيجابي المنصوص عليها في عدة لتحديد حساسيتها. 343 شركة بريتيش بتروليوم P. اللثوية -specific التحقيق هو 25 مرات أكثر حساسية من 70 سنة مضت التحقيق eubacterial. ويبين الشكل 2 التهجين الموضعي للأنسجة اللثة التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة المزمن للكشف عن P. في اللثوية وeubacteria. إشارات البكتيرية، كما هو موضح في اللون البنفسجي، تم الكشف داخل ظهائر، الصفيحة المخصوصة، وبيوفيلم تقع خارج الأنسجة. ومع ذلك، فإن توزيع P. كان اللثوية وeubacteria داخل الأنسجة اللثوية مختلفة. في تضخم عالية (1،000X)، مختلف الأشكال (مكورة، ورود، مغزلي، وشكل شعر) من البكتيريا كانت مرئية باستخدام مسبار eubacterial، في حين تم الكشف عن قضيب الوحيد البكتيريا التي شكلتها P. اللثوية -specific التحقيق. والأشكال المتباينة من إشارات البكتيريةوقد لوحظت أيضا.
Hajishengallis وآخرون. أظهر الدور الأساسي للبكتيريا المتعايشة في تطوير P. اللثوية يسببها التهاب اللثة التجريبية في الفئران (14). تطبيق ديكستران سلفات الصوديوم (DSS)، تقاطع ضيق (TJ) -disrupting الكيميائية، على اللثة الغشاء المخاطي الناجم عن التهاب اللثة وفقدان العظم السنخي في الفئران (13). التحقيق eubacterial الكشف عن بنجاح البكتيريا داخل أنسجة اللثة من مجموعة DSS التي لم تكتشف من قبل P. اللثوية التحقيق -specific (الشكل 3).
التحقيق eubacterial مفيد لدراسة احتمال تورط البكتيريا في أمراض أخرى. منذ الوكالة الدولية لبحوث السرطان المعينة هيليكوباكتر بيلوري كدرجة I مسرطنة لسرطان المعدة 15، وقد درس على نطاق واسع تورط محتمل من البكتيريا في تطوير أنواع أخرى من السرطان. عندما ذاتهاوكانت ctions الخزعات الرئة تشخيص سرطان الخلايا الحرشفية في الموقع تهجين مع التحقيق eubacterial، تم الكشف عن البكتيريا داخل الخلايا السرطانية وبين اللحمية المحيطة / تسلل الخلايا (الشكل 4). وفي التهجين الموضعي باستخدام مسبار eubacterial وقد ينطبق أيضا على استكشاف وجود البكتيريا في آفات الحزاز المسطح عن طريق الفم، مرض المناعة التهابات مع مرض غير معروف. ومن المثير للاهتمام، تم الكشف عن إشارات البكتيرية ليس فقط داخل الظهارة ولكن أيضا في الصفيحة المخصوصة التي لوحظ مثل الفرقة التسلل. في ظل تضخم عالية، تم الكشف عن إشارات البكتيرية في نوى العديد من الخلايا (الشكل 5).
الشكل 1. اختبار حساسية للتحقيقات DIG المسمى. تخفيفه بشكل متسلسل تحقيقات المسمى العرف ومقاولات إيجابيالتحقيق رأ المنصوص عليها في عدة ونشف نقطة مع الأجسام المضادة لمكافحة DIG-AP-مترافق. بعد إضافة الركيزة، وصمة عار مع P. وقد وضعت اللثوية -specific التحقيق لمدة 30 ثانية، في حين تم تطوير وصمة عار مع التحقيق eubacterial لمدة 1 دقيقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تعرض الشكل 2. الكشف عن البكتيريا داخل أنسجة اللثة التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة المزمن. أقسام الخزعات اللثة من موقع صحي (A) وموقع المريضة (B) للمريض مع اللثة إلى الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) أو تلطيخ الموقع التهجين إما مع P. في اللثوية التحقيق -specific أو التحقيق eubacterial. Negativتم تهجين التحكم الإلكترونية مع التحقيق مختلطة مع 10 أضعاف التحقيق الخالي من الملصقات الزائد. يشار إلى منطقة تضخيم مع مربع مربع. إشارات إيجابية التمثيلية، كما هو موضح في اللون البنفسجي، يتم وضع علامة مع السهام رقيقة. السهام سميكة تشير بيوفيلم البلاك خارج الأنسجة. وتظهر بيوفيلم وحة فحص في 1،000X التكبير في الأشكال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الكشف عن البكتيريا المتعايشة عن طريق الفم داخل الأنسجة اللثوية من الماوس. وكان المستحث اللثة التجريبية في BALB / ج الفئران عن طريق التلقيح عن طريق الفم من P. اللثوية (خريج) أو تطبيق DSS على الغشاء المخاطي اللثوي. تعرض أقسام اللثة من الفئران لH & E تلطيخ أو في الموقع التهجين إما مع < م> P. اللثوية التحقيق -specific أو التحقيق eubacterial. إشارات إيجابية التمثيلية، كما هو موضح في اللون البنفسجي، يتم وضع علامة مع السهام. التكبير الأصلي X400. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
كانت ملطخة الشكل 4. الكشف عن البكتيريا داخل آفة السرطان. الأقسام الخزعات الرئة من المرضى الذين شخصت إصابتهم بسرطان الخلايا الحرشفية مع H & E أو في الموقع تهجين مع أي لجنة التحقيق eubacterial عالمي أو سيطرة التحقيق سلبي. يشار إلى منطقة تضخيم مع مربع مربع. إشارات إيجابية التمثيلية، كما هو موضح في اللون البنفسجي، يتم وضع علامة مع السهام. يشار إلى الحدود من الخلايا السرطانية مع الخطوط المنقطة.arget = "_ فارغة"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
كانت ملطخة الرقم 5. الكشف عن البكتيريا داخل آفات الحزاز المسطح عن طريق الفم. الأقسام خزعة من مخاطية الشدق تشخيصها على أنها الحزاز المسطح عن طريق الفم مع H & E أو في الموقع تهجين مع أي لجنة التحقيق eubacterial عالمي أو سيطرة التحقيق سلبي. يشار إلى أن المناطق تضخيم مع مربع مربع. إشارات إيجابية التمثيلية، كما هو موضح في اللون البنفسجي، يتم وضع علامة مع السهام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا بروتوكول لتوطين البكتيريا داخل أنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مسبار الحمض النووي المسمى DIG وقد وصفت. التحقيق يستهدف DNA أو RNA الجزيئات من البكتيريا 16S الريباسي الجينات، وتحقيقات 16S الريباسي التي تستهدف يمكن أن تصمم إما أنواع محددة أو عالمية. التهجين محدد من P. اللثوية -specific التحقيق لP. اللثوية ولكن ليس لالبكتيريا عن طريق الفم الأخرى وقد تبين سابقا 10. في المقابل، فإن التحقيق eubacterial المهجنة لجميع الحمض النووي الجيني البكتيرية المختبرة (17 نوعا مختلفا)، على الرغم من كفاءة التهجين تنوعت 12. عدد T-النيوكليوتيدات ضمن التحقيق يحدد كفاءة DIG وضع العلامات. إنتاج التحقيق DIG المسمى مع حساسية عالية هو الخطوة الأكثر أهمية لنجاح تنفيذ البروتوكول وصفها. معالجة العينات مع حمض الهيدروكلوريك يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال استخراج البروتينات وhydrolysi جزئيةالصورة من تسلسل الهدف. زيادة في تركيز بروتين K يزيد هدف الوصول للتحقيقات ولكن يقلل من الحفاظ على الأنسجة. ولذلك، فمن المستحسن لاختبار عدة تركيزات بروتين كاف، وهذا يتوقف على أنواع الأنسجة. يقلل من الخطوة أستلة خلفية ملزمة لجنة التحقيق المشحونة سلبا على البروتينات من الأنسجة من قبل acetylating المجموعات الأمينية موجبة الشحنة. بعد سلسلة من الخطوات إعداد، وأقسام الأنسجة المسيل للدموع بسهولة، وبالتالي، لا بد من التعامل معها بحذر. الخلفية هو الحد الأدنى بالمقارنة مع FISH. ومع ذلك، فإن إشارات من الأنسجة مع ارتفاع الذاتية نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية مثل العظام والغدد المخاطية ينبغي تفسير خطيرة.
تحقيقات DNA PCR تضخيم سهلة لإنتاج ومستقرة بالمقارنة مع تحقيقات RNA. كشف المناعى من تحقيقات المهجنة يسمح تحديد الهياكل النسيجية من خلال المقارنة مع أقسام H & E الملون: وظهائر،النسيج الضام، تتسرب التهابات، والأوعية الدموية هي متميزة أيضا. واحدة من قيود البروتوكول وصفها هو عدم القدرة على تطبيق تحقيقات متعددة في نفس الوقت. بالإضافة إلى ذلك، فإن استبعاد الإشارات من الملوثات البكتيرية على سطح أقسام محدودة.
هذا البروتوكول يمكن تكييفها للكشف عن النصوص البكتيرية الأخرى داخل أقسام الأنسجة 16. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تمديد هذا البروتوكول لمضاعفة تلطيخ مع كشف المناعى من علامة الخلية المضيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة (2013R1A1A3005669) من المؤسسة الوطنية لكوريا البحوث ومنحة (HI13C0016) من الكورية صحة التكنولوجيا R & D المشروع، وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
