Introduction
Bacteriën spelen een rol in de etiologie van diverse orale aandoeningen zoals periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis en osteomyelitis. Om de rol van bacteriën in de pathogenese van de ziekte te begrijpen en het effect van behandeling te controleren, lokalisatie van bacteriën in het weefsel van belang. De aanwezigheid van bacteriën in gingivale weefsel van patiënten met periodontitis is aangetoond met behulp van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie 1,2, immunohistochemie en immunofluorescentie middel van bacteriën antilichamen 3-7 en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) 8 met een fluorescentie- gelabelde oligonucleotideprobe gericht op 16S rRNA. Toch zijn deze methoden niet op grote schaal gebruikt vanwege technische beperking of moeilijkheden. Vergeleken met antilichamen, probes gericht 16S rRNA zijn gemakkelijk te produceren en het bereiken species-specificiteit. FISH heeft bewezen een uitstekend hulpmiddel voor de visualisatie van bact zijneria in hun natuurlijke omgevingen zoals plaque biofilm. De toepassing van FISH weefselmonsters is beperkt door autofluorescentie van verschillende weefselcomponenten. Bijvoorbeeld, de sterke autofluorescentie van rode bloedcellen vaak belemmert de toepassing van fluorescentietechnieken ontstoken weefsel wanneer zij omvatten bloeden 9.
Om binnen de ontstoken tandvleesweefsels bacteriën lokaliseren derhalve een in situ hybridisatie onder toepassing van een digoxigenine (DIG) -gemerkte DNA-probe is ontwikkeld en succesvol toegepast 10,11. Hier een gedetailleerd protocol voor de lokalisatie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp P. gingivalis-specifieke en universele eubacteriële probes beschreven. Het is met name gericht op standaardisatie van de werkwijze, zodat vergelijkbare resultaten kunnen worden weergegeven in andere laboratoria. Dit protocol maakt lokalisatie van bacteriën in hun histologische context en de results zijn zeer reproduceerbaar. De beschreven protocol kan worden gebruikt om bacteriën te lokaliseren hetzij een species-specifieke of universele wijze in verschillende weefsels. De universele probe is met name nuttig voor detecteren van bacteriën in polymicrobiële ziekten en een potentiële rol bacteriën bestuderen ziekten waarbij de rol van specifieke bacteriën niet bekend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probe Voorbereiding
- PCR-amplificatie van de probe
- Voor P. gingivalis-specifieke sonde, versterken van een 343 bp DNA-fragment van P. gingivalis 16S rRNA met PCR met gebruik van de genomische DNA van P. gingivalis en de volgende primers: 5'-AAC TGC TTG CCT TAC AGA GG-3 'en 5'-ACT CGT CGT TAT ATC GCC TC-3' 10. Voer amplificaties met de volgende cyclusomstandigheden: 35 cycli bij 95 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min 20 sec gevolgd door een 5 minuten verlenging bij 72 ° C 10,11.
- Versterken de eubacteriële probe onder toepassing van een 70-bp DNA fragment (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') gesynthetiseerd als een oligonucleotide en de volgende primers: 5'- CTG CAG GTR GGY CMT-3' en 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3 '11. Voer amplificaties met de volgende cyclus voorwaarden: 40 cycli9 bij 4 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min 20 s, gevolgd door een 5 minuten verlenging bij 72 ° C 11,12. - Precipiteren van de PCR producten (≥500 pl) door toevoeging 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 100% ethanol (bij een 10: 1: 2 verhouding) en incubatie bij -20 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugeer het mengsel bij 14.000 xg gedurende 15 min, resuspendeer de pellet in 100 ui TE-buffer, en meet de DNA-concentratie optische dichtheid bij 260 nm.
- DIG-labelen met een DIG DNA labeling en detectie kit
- Meng 3 ug van het probe met water tot een eindvolume van 15 pl.
- Denatureren het DNA bij 95 ° C gedurende 10 min en snel koelen op ijs.
- Voeg 2 ui 10X hexanucleotide mix, 2 pl dNTP mix-labeling, en 1 pl Klenow enzym 15 pi van het gedenatureerde DNA.
- Mengen en incuberen bij 37 ° C gedurende 24 uur tot 48 uur en stop de reactie door verwarming bij 65 ° C.
- Controleer de gevoeligheid van de met DIG gemerkte probe onder toepassing van een DIG DNA labeling en detectie kit
- Handmatig laden 1 pl seriële verdunningen van de positieve controle probe in de kit en 1 ng van het met DIG gemerkte probe op nylon membraan en droog gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Kort geniet het membraan in 2 x SSC-buffer (0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitraat, pH 7,0) en incuberen van het membraan bij 80 ° C gedurende 1 uur om het DNA te immobiliseren.
- Kort geniet het membraan maleïnezuur buffer (MAB, 0,1 M maleïnezuur, 0,15 M NaCl, pH 7,5) en geïncubeerd met anti-DIG alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd antilichaam verdund (1: 5000) in 6 ml blokoplossing ontvangen in de kit bij KT gedurende 30 min.
- Was het membraan met MABT (MAB met 1% Tween 20) en 40 pl van het NBT / BCIP oplossing gemengd met 2 ml detectiebuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, pH 9,5) op de toepassing membraan gedurende 1 min. Wanneer de gevoeligheid van de gemerkte probeniet bevredigend, herhaal stappen van 1.1.3 naar 1.3.4.
- Meet de DNA concentratie van de gelabelde probe (OD260) en de concentratie aan te passen aan 100 ng gl -1.
- Controleer de specificiteit van de DIG-gelabelde probe
- Denatureren genomische DNA-monsters (25 ng 3 gl -1 per elk monster) uit verschillende bacteriële species, waaronder de bacterie waarop de specifieke probe bij 95 ° C gedurende 10 min en snel koelen op ijs.
- Handmatig laadt het gedenatureerde DNA op het nylon membraan en droog gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Kort geniet het membraan in 2 x SSC-buffer en incubeer het membraan bij 80 ° C gedurende 2 uur om het DNA te immobiliseren.
- Blokkeer het membraan met een blokkerende oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Verdun de sonde 1 ng gl -1 in hybridisatiebuffer, denatureren de verdunde probes en toepassing op het membraan.
- Incubeer het membraan bij 45 ° C gedurende 1 uur.
- Was het membraan driemaal met 2x SSC buffer.
- Kort weken het membraan in MAB.
- Incubeer met anti-DIG-AP geconjugeerd antilichaam verdund (1: 2000) in 6 ml blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Was het membraan met MABT en 40 pl van het NBT / BCIP oplossing gemengd met 2 ml detectiebuffer toepassing.
- Indien de probe niet de verwachte specificiteit te bereiken, verhoog de hybridisatietemperatuur tot de specificiteit waargenomen.
2. In Situ Hybridization
Opmerking: Om het drogen van de monsters en reagentia te voorkomen, voeren alle incubaties in een vochtige kamer bekleed met natte papieren handdoeken.
- De-paraffinization en rehydratatie van weefselsecties
- Bereid 4 pm dikke coupes van in paraffine ingebedde blokken. Formaline, paraformaldehyde, en zink-gebaseerde fixatief zijn compatibel met dit protocol.
- Bereid alle reagentia met DEPC-behandeld water.
- Verhit objectglaasjes in een droogoven bij 60 ° C gedurende 30 min en incubeer slides bij kamertemperatuur 30 min.
- Dompel glaasjes in 100% xyleen gedurende 5 min driemaal; gebruiken verse xyleen per keer.
Opmerking: Doe dit-de wassende procedure in een chemische zuurkast. - Dompel de glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten tweemaal met verse ethanol telkens en hydrateren specimens in serie 90%, 80% en 70% ethanol oplossing gedurende 5 minuten elk.
- Dompel slides in DEPC-behandeld water gedurende 1 min en was glaasjes in DEPC-behandeld PBS (pH 7,4) gedurende 6 min.
- Voorbehandelingen van weefselsecties
- Dompel slides in 0,1 N zoutzuur gedurende 20 minuten en was glaasjes in DEPC-behandeld water gedurende 30 sec.
- Teken een hydrofobe barrière rondom exemplaren met een wax pen.
Opmerking: De grootte van de hydrofobe barrière afhankelijk van de grootte van specimens. Daarom is de hoeveelheden reagentia die in de volgende stappen afhankelijk van de grootte van monsters maar moeten de hy vullendrophobic barrière (50 ul voor kleine monsters en 400 ul voor grote exemplaren). - Behandel specimens met 50 tot 400 ul proteinase K (1-10 ug ml -1 in DEPC-behandeld PBS) in een droge oven bij 37 ° C gedurende 30 min en was glaasjes in DEPC-behandeld 1x PBS gedurende 1 minuut.
- Geniet slides in 4% paraformaldehyde in DEPC-behandeld PBS gedurende 10 minuten, daarna wassen objectglaasjes in DEPC-behandeld PBS gedurende 1 minuut.
- Geniet slides in 0,1 M triethanolamine-HCl (pH 8,0) bevattende 0,5% azijnzuuranhydride gedurende 20 min en was glaasjes in DEPC-behandeld water gedurende 30 sec.
- Hybridisatie met probe en wassen
- Dompel dia's in 2x SSC buffer gedurende 20 min.
- Verdun de sonde 1 ng gl -1 in hybridisatie buffer (4 x SSC, 50% [vol / vol] formamide, 1 x Denhardt's oplossing, 10% [gewicht / volume] dextraansulfaat, 0,1% [gewicht / volume] natriumdodecylsulfaat, 0,4 mg ml -1 zalmsperma DNA). Voor negatieve controles, meng de gelabelde probe metEen 10-voudige overmaat van niet-gemerkte probe.
- Denatureren de verdunde probes en 50-400 gl toegepast op weefselcoupes. Leg een deksel slip op de dia en afdichting met nagellak.
- Heat slides in PCR machine bij 90 ° C gedurende 10 min en incubeer objectglaasjes in een vochtige kamer O / N bij optimale temperatuur 45 ° C of bepaald bij stap 1.4.11.
- Koel de objectglaasjes bij 4 ° C gedurende 30 minuten, verwijder dekglaasjes en dompel dia op seriële SSC buffer als volgende: 4 x SSC gedurende 10 min, voorverwarmde (45 ° C) 2 x SSC gedurende 20 minuten, 2 x SSC gedurende 10 min en 0,2 x SSC gedurende 10 minuten.
- Detectie met anti-DIG-AP geconjugeerd antilichaam
- Was de glaasjes in MABT gedurende 5 min.
- Blokkeer met 50 tot 400 ul van blokkeeroplossing met 1% Tween 20 gedurende 20 minuten.
- Voeg 50 tot 400 gl anti-DIG-AP-antilichaam verdund in blokkerende oplossing (1: 1000) anld incuberen bij 37 ° C gedurende 90 min.
- Was de glaasjes in MABT gedurende 10 min. <li> Dompel slides detectie buffer die 1% Tween 20 gedurende 5 minuten.
- Behandelen met 50 tot 400 μ van 1 mM levamisol (detectie buffer die 1% Tween 20) gedurende 5 minuten om endogene alkalische fosfatase te inactiveren.
- Verdeel 50 tot 400 ul van de voorgemengde NBT / BCIP oplossing (verdund in detectiebuffer op 1: 100) op elk monster en incubeer objectglaasjes in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 uur totdat het ontwikkelde signaal bevredigend.
- Spoel slides met gedeïoniseerd water visualisatie stoppen en 50-400 gl 0,05% [gewicht / volume] methyl green als teller beits bij 37 ° C gedurende 10 min.
- Spoel de dia's met gedeïoniseerd water, uitdrogen in 100% ethanol, en onder te dompelen in xyleen.
- Breng 80 ul van montage oplossing op elke dia en dek af met dekglaasjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont dot blotting van DIG-gelabelde probes vergeleken met de positieve controle probe in de kit om de gevoeligheid te bepalen. De 343 bp P. gingivalis-specifieke probe is 25 maal gevoeliger dan 70 bp eubacteriële probe. Figuur 2 toont in situ-hybridisatie van gingivale weefsel van patiënten met chronische periodontitis voor detectie van P. gingivalis en eubacteria. De bacteriële signalen getoond in violet, werden gedetecteerd binnen het epitheel, de lamina propria, en biofilm buiten het weefsel bevindt. De verdeling van P. gingivalis en eubacteria binnen de tandvleesweefsel was anders. Bij hoge vergroting (1000x), verschillende vormen (coccus, staaf, spoelvormig, en harige vorm) van bacteriën zichtbaar waren met de eubacteriële sonde, terwijl slechts staafvormige bacteriën werden gedetecteerd door de P. gingivalis -specifieke probe. De gedispergeerde vormen van bacteriële signalenwerden ook waargenomen.
Hajishengallis et al. toonde de essentiële rol van commensale bacteriën in de ontwikkeling van P. gingivalis geïnduceerde experimentele periodontitis bij muizen 14. De toepassing van dextransulfaat natrium (DSS), een tight junction (TJ) -disrupting chemische, op het tandvlees slijmvlies geïnduceerde parodontitis en alveolaire botverlies bij muizen 13. De eubacteriële probe succesvol gedetecteerd bacteriën in de gingivale weefsel van de DSS-groep die niet werden gedetecteerd door de P. gingivalis-specifieke probe (Figuur 3).
De eubacteriële probe is bruikbaar voor het bestuderen van de mogelijke betrokkenheid van bacteriën bij andere ziekten. Aangezien het Internationaal Agentschap voor Onderzoek naar aangewezen Helicobacter pylori als een graad I carcinogeen voor maagkanker 15 Cancer, heeft mogelijke betrokkenheid van bacteriën in de ontwikkeling van andere vormen van kanker uitgebreid bestudeerd. Wanneer seegen long biopsieën diagnose plaveiselcelcarcinoom werden in situ gehybridiseerd met de probe eubacteriële bacteriën werden beide waargenomen in de tumorcellen en tussen de omliggende stroma / infiltrerende cellen (Figuur 4). In situ hybridisatie met de probe eubacteriële werd ook toegepast op onderzoeken van de aanwezigheid van bacteriën in de laesies van orale lichen planus, een inflammatoire immuunziekte met onbekende etiologie. Interessant is dat bacteriële signalen niet alleen binnen het epitheel maar ook in de lamina propria waarbij bandvormige infiltratie waargenomen gedetecteerd. Onder hoge vergroting, werden de bacteriële signalen gedetecteerd in de kernen van vele cellen (Figuur 5).
Figuur 1. Gevoeligheid test van de DIG-gelabelde probes. Serieel verdund custom gelabelde probes en een positieve control probe die in de kit werden dot blot met anti-DIG-AP-geconjugeerd antilichaam. Na toevoeging van het substraat, de blot met P. gingivalis-specifieke probe is ontwikkeld voor 30 sec, terwijl de vlek met de eubacteriële sonde is ontwikkeld voor 1 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Detectie van bacteriën in gingivale weefsel van patiënten met chronische periodontitis. Delen van tandvlees biopten van de gezonde plaats (A) en de zieke plaats (B) van een patiënt met periodontitis werden onderworpen aan hematoxyline-eosine (H & E) kleuring of in situ hybridisatie met hetzij de P. gingivalis-specifieke probe of eubacteriële probe. Negative controles werden gehybridiseerd met de probe gemengd met een 10-voudige overmaat ongelabelde probe. Het vergrote gebied wordt aangegeven met een vierkante doos. Vertegenwoordiger positieve signalen, getoond in violet, zijn gemarkeerd met dunne pijlen. Dikke pijlen geven plaque biofilm buiten het weefsel. De plaquette biofilm bij 1000x onderzocht worden in inzetstukken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Detectie van orale commensale bacteriën in het gingivale weefsel van muis. Experimentele periodontitis werd geïnduceerd in BALB / c muizen door orale inoculatie van P. gingivalis (Pg) of toepassing van DSS op gingivale mucosa. Gingivale secties van muizen werden onderworpen aan H & E-kleuring of in situ hybridisatie met ofwel de < em> P. gingivalis-specifieke probe of eubacteriële probe. Representatieve positieve signalen getoond in violet, zijn aangegeven met pijlen. Originele vergroting x400. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Detectie van bacteriën in kanker laesie. De secties van longen biopten van patiënten met squameus celcarcinoom werden gekleurd met H & E of in situ gehybridiseerd met hetzij de algemene eubacteriële probe of negatieve controleprobe. Het vergrote gebied wordt aangegeven met een vierkante doos. Representatieve positieve signalen getoond in violet, zijn aangegeven met pijlen. Grens van tumorcellen zijn aangegeven met stippellijnen.arget = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Detectie van bacteriën in de laesies van orale lichen planus. De plakjes biopsie van buccale mucosa gediagnosticeerd als orale lichen planus werden gekleurd met H & E of in situ gehybridiseerd met hetzij de algemene eubacteriële probe of negatieve controleprobe. De vergrote gebieden zijn aangeduid met een vierkante doos. Vertegenwoordiger positieve signalen, getoond in violet, zijn gemarkeerd met pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier een protocol bij bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een DIG-gemerkte DNA probe is beschreven lokaliseren. De probe richt de DNA- of RNA-moleculen van bacteriële 16S rRNA-gen en het 16S rRNA-targeting probes worden ontworpen zoals deze species-specifieke of universele. De specifieke hybridisatie van het P. gingivalis -specifieke probe P. gingivalis maar niet met andere orale bacteriën werd aangetoond 10. In tegenstelling, de eubacteriële probe hybridiseerde met elke bacteriële genomische DNA getest (17 andere species), maar hybridisatie-efficiëntie varieerde 12. Het aantal T-nucleotiden in de probe waardoor de doeltreffendheid van DIG-labeling. Productie van een DIG-gelabelde probe met een hoge gevoeligheid is de meest kritische stap voor de succesvolle implementatie van de beschreven protocol. Behandeling van monsters met zoutzuur verbetert de signaal-ruisverhouding door extractie van de proteïnen en gedeeltelijk hydrolysis doelsequenties. Een toename van de concentratie van proteinase K toe doelstelling toegankelijkheid van probes maar vermindert weefsel bewaring. Daarom wordt het aanbevolen om te testen verschillende concentraties van proteinase K, afhankelijk van het type weefsel. De acetylering stap vermindert achtergrondbinding van de negatief geladen probe om de eiwitten van het weefsel door acetyleren de positief geladen aminogroepen. Na een reeks van deze voorbereidende stappen, de weefselcoupes snel scheuren derhalve moeten voorzichtig worden behandeld. De achtergrond is minimaal vergeleken met FISH. Echter, de signalen van weefsels met een hoge endogene alkalische fosfatase activiteit, zoals botten en slijmklieren kritisch geïnterpreteerd.
PCR-geamplificeerd DNA-probes zijn gemakkelijk te produceren en stabiel ten opzichte van RNA probes. Immunohistochemische detectie van gehybridiseerde probes maakt de identificatie van histologische structuren door vergelijking met H & E gekleurde secties: het epitheel,bindweefsel, inflammatoire infiltraten, en bloedvaten zijn goed te onderscheiden. Een van de beperkingen van het beschreven protocol is het onvermogen om meerdere probes passen tegelijk. Bovendien uitsluiting van de signalen van bacteriële verontreinigingen op het oppervlak van onderdelen beperkt.
Dit protocol kan worden aangepast aan andere bacteriële transcripten in weefselcoupes 16. Bovendien kan dit protocol worden uitgebreid tot dubbel kleuren met immunohistochemische detectie van een gastheercel marker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door een subsidie (2013R1A1A3005669) van de National Research Foundation Korea en een subsidie (HI13C0016) van de Koreaanse Health Technology R & D Project, Ministerie van Volksgezondheid en Welzijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
