Introduction
Les bactéries jouent un rôle dans l'étiologie de diverses maladies orales telles que la parodontite, pulpite, péricoronarite, la cellulite et l'ostéomyélite. Afin de comprendre le rôle des bactéries dans la pathogenèse de la maladie et de suivre l'effet des traitements, la localisation des bactéries dans le tissu est importante. La présence de bactéries dans le tissu gingival de patients atteints de parodontite a été démontré en utilisant divers procédés, notamment la microscopie électronique 1,2, immunohistochimie et immunofluorescence en utilisant des anticorps spécifiques aux bactéries 3-7, et hybridation fluorescente in situ (FISH) 8 par fluorescence en utilisant un sonde oligonucléotidique marquée ciblage ARN ribosomique 16S. Néanmoins, ces méthodes ne sont pas largement utilisés en raison de limitations techniques ou difficultés. Comparé avec des anticorps, des sondes ciblant les ARN ribosomique 16S sont faciles à produire et réaliser spécificité d'espèce. FISH est avéré être un excellent outil pour la visualisation de bacteria dans leurs milieux naturels tels que le biofilm. Cependant, l'application de poissons à des échantillons de tissus est limitée en raison de l'autofluorescence des différentes composantes du tissu. Par exemple, la forte autofluorescence des cellules rouges du sang entrave souvent l'application de la technologie de fluorescence de tissus enflammés lorsqu'ils impliquent le saignement 9.
Afin de localiser les bactéries dans les tissus gingivaux enflammés, par conséquent, un procédé d'hybridation in situ en utilisant une digoxigénine (DIG) sonde d'ADN marqué au a été développée et appliquée avec succès 10,11. Voici un protocole détaillé pour la localisation des bactéries dans les tissus inclus dans la paraffine en utilisant P. gingivalis sondes eubactériennes spécifique de et universels a été décrite. Il se concentre particulièrement sur la normalisation de la méthode de sorte que des résultats similaires peuvent être reproduits dans d'autres laboratoires. Ce protocole permet la localisation des bactéries dans leur contexte histologique et le résuLTS sont hautement reproductibles. Le protocole décrit peut être utilisé pour localiser les bactéries, soit d'une manière spécifique à l'espèce ou universel dans divers tissus. La sonde universelle est particulièrement utile pour détecter les bactéries dans les maladies polymicrobiennes et d'étudier le rôle potentiel des bactéries dans des maladies où le rôle des bactéries spécifiques est pas connue.
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Protocol
1. Préparation de la sonde
- L'amplification par PCR de la sonde
- Pour la P. La sonde de gingivalis, amplifier un fragment d'ADN de 343 pb de P. gingivalis ARNr 16S par PCR en utilisant l'ADN génomique de P. gingivalis et les amorces suivantes: 5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'et 5' AGIR CGT ATC GCC CGT TAT TC-3 '10. Effectuer des amplifications avec les conditions de cycle suivantes: 35 cycles à 95 ° C pendant 30 sec, 60 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 1 min 20 sec, suivie par une extension de 5 minutes à 72 ° C 10,11.
- Amplifier le eubactérienne utilisant un 70 pb fragment d'ADN (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') synthétisé comme un oligonucleotide et les amorces suivantes: 5'-CAG CTG GTR GGY CMT-3' et 5'-AGG GTT GTT GCG CTC-3 '11. Effectuer des amplifications avec les conditions de cycle suivantes: 40 cycles9 à 4 ° C pendant 30 sec, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 min 20 s, suivie d'une prolongation de 5 minutes à 72 ° C 11,12. - Précipiter les produits de PCR (≥500 pi) par addition d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et 100% d'éthanol (à 10: 1: 2) et en incubant à -20 ° C pendant 2 heures.
- Centrifuger le mélange à 14 000 xg pendant 15 min, remettre en suspension le culot dans 100 pl de tampon TE, et de mesurer la concentration d'ADN par densité optique à 260 nm.
- DIG-étiquetage en utilisant un marquage et de détection kit DIG DNA
- Mélanger 3 pg de la sonde avec de l'eau jusqu'à un volume final de 15 ul.
- Dénaturer l'ADN à 95 ° C pendant 10 minutes et refroidir rapidement sur de la glace.
- Ajouter 2 ul de mélange 10x hexanucléotide, 2 ul de dNTP mix-étiquetage, et 1 ul de l'enzyme de Klenow pour 15 ul de l'ADN dénaturé.
- Mélanger et incuber à 37 ° C pendant 24 h à 48 h et arrêter la réaction par chauffage à 65 ° C.
- Vérifiez la sensibilité de la sonde DIG marqué à l'aide d'un marquage et de détection kit DIG DNA
- Charger manuellement 1 pl de dilutions en série de la sonde de contrôle positif fournis dans le kit et 1 ng de la sonde marquée à la DIG sur la membrane en nylon et sec pendant 5 min à température ambiante.
- Brièvement tremper la membrane dans du tampon 2 x SSC (NaCl 0,3 M, citrate de sodium 30 mM, pH 7,0) et on incube la membrane à 80 ° C pendant 1 heure pour immobiliser l'ADN.
- Brièvement tremper la membrane dans du tampon de l'acide maléique (MAB, 0,1 M d'acide maléique, 0,15 M de NaCl, pH 7,5) et on incube avec des anticorps anti-DIG la phosphatase alcaline (AP) conjugué à l'anticorps dilué (1: 5000) dans 6 ml de solution de blocage prévu dans le kit à température ambiante pendant 30 min.
- Laver la membrane avec MABT (MAB contenant 1% de Tween 20) et applique 40 pi de la solution de NBT / BCIP mélangé avec 2 ml de tampon de détection (0,1 M de Tris-HCl, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, pH 9,5) sur le membrane pendant 1 min. Si la sensibilité de la sonde marquée estpas satisfaisante, répétez les étapes 1.1.3 à 1.3.4.
- Mesurer la concentration de l'ADN de la sonde marquée (DO260) et ajuster la concentration de 100 ng -1 ul.
- Vérifier la spécificité de la sonde marquée à la DIG
- Dénaturer les échantillons d'ADN génomique (25 ng 3 ul de chaque échantillon par -1) à partir de différentes espèces bactériennes, y compris la bactérie cible de la sonde spécifique, à 95 ° C pendant 10 minutes et refroidir rapidement sur de la glace.
- Charger manuellement l'ADN dénaturé sur la membrane de nylon et sèche pendant 20 min à TA.
- Tremper brièvement la membrane dans un tampon SSC 2x et incuber la membrane à 80 ° C pendant 2 heures pour immobiliser l'ADN.
- Bloquer la membrane avec une solution de blocage à température ambiante pendant 1 heure.
- Diluer la sonde à 1 ng ul -1 dans un tampon d'hybridation, dénaturer les sondes dilué, et appliquer sur la membrane.
- Incuber la membrane à 45 ° C pendant 1 heure.
- Laver la membrane troisfois avec du tampon SSC 2x.
- Tremper brièvement la membrane dans MAB.
- Incuber avec l'anticorps anti-DIG conjugué AP-dilué (1: 2000) dans 6 ml de solution de blocage à température ambiante pendant 1 heure.
- Laver la membrane avec MABT et appliquer 40 ul de la solution de NBT / BCIP mélangé avec 2 ml de tampon de détection.
- Lorsque la sonde ne permet pas d'obtenir la spécificité attendue, d'augmenter la température d'hybridation jusqu'à ce que la spécificité est observée.
2. Hybridation in situ
Remarque: Pour éviter le séchage des échantillons et les réactifs, effectuer toutes les incubations dans une chambre humidifiée avec des serviettes en papier humide.
- De-paraffinization et réhydratation des coupes de tissus
- Préparer 4 um d'épaisseur des sections de tissu à partir de blocs inclus dans la paraffine. Formaline, le paraformaldéhyde, et fixateur à base de zinc sont compatibles avec ce protocole.
- Préparer tous les réactifs à l'aide d'eau traitée au DEPC.
- Chauffer les lames dans un four sec à 60 ° C pendant 30 min et incuber diapositives à température ambiante pendant 30 min.
- Immerger les lames dans 100% de xylène pendant 5 min à trois reprises; utiliser xylène frais à chaque fois.
Remarque: Effectuez cette procédure de de-cire dans une hotte chimique. - Immerger les lames dans de l'éthanol à 100% pendant 5 min à deux reprises, en utilisant de l'éthanol frais à chaque fois, et de se réhydrater spécimens en série 90%, 80% et des solutions d'éthanol de 70% pendant 5 minutes chacun.
- Immerger les lames dans de l'eau traitée au DEPC pendant 1 min et laver les lames dans du PBS traitée au DEPC (pH 7,4) pendant 6 min.
- Prétraitements de coupes de tissus
- Immerger les lames dans de l'acide chlorhydrique 0,1 N pendant 20 minutes et laver les lames dans de l'eau traitée au DEPC pendant 30 sec.
- Tracez une barrière hydrophobe spécimens en utilisant un stylo de cire environnante.
Remarque: La taille de la barrière hydrophobe dépend de la taille des échantillons. Par conséquent, les volumes de réactifs utilisés dans les étapes suivantes varient en fonction de la taille des échantillons, mais doivent remplir le hybarrière drophobic (50 pi pour les petits spécimens et 400 pi pour les gros spécimens). - Traiter les échantillons avec 50 à 400 ul de proteinase K (1 à 10 pg ml -1 dans du PBS traitée au DEPC) dans un four sec à 37 ° C pendant 30 min et à laver les lames traitée au DEPC 1x PBS pendant 1 min.
- Faire tremper les lames dans 4% de paraformaldehyde dans PBS traitée au DEPC pendant 10 min, puis laver les lames dans du PBS traitée au DEPC pendant 1 min.
- Faire tremper les lames dans 0,1 M triéthanolamine-HCl (pH 8,0) contenant de l'anhydride acétique à 0,5% pendant 20 min et laver les lames dans de l'eau traitée au DEPC pendant 30 sec.
- L'hybridation avec la sonde et de lavage
- Immerger les lames dans un tampon SSC 2x pendant 20 min.
- Diluer la sonde à 1 ng ul -1 dans du tampon d'hybridation (4x SSC, 50% [vol / vol] formamide, solution de Denhardt 1X, 10% [vol poids /] du sulfate de dextrane, 0,1% [vol poids /] du sulfate de sodium dodécyle, 0,4 mg ml -1 d'ADN de sperme de saumon). Pour les contrôles négatifs, mélanger la sonde marquée avecun excédent de 10 fois de la sonde non marquée.
- Dénaturer les sondes diluées et appliquer de 50 à 400 pi sur des coupes de tissus. Placez une lamelle sur la lame et sceller avec du vernis à ongles.
- Chauffer les lames dans la machine PCR à 90 ° C pendant 10 min et incuber les lames dans une chambre humidifiée O / N à 45 ° C ou la température optimale déterminés à l'étape 1.4.11.
- Refroidir les lames à 4 ° C pendant 30 min, retirez lamelles, et plongez les lames dans un tampon SSC série comme suite: 4x SSC pendant 10 min, préchauffé (45 ° C) 2x SSC pendant 20 min, 2x SSC pour 10 min, et 0,2 x SSC pendant 10 minutes.
- Détection avec un anticorps anti-DIG conjugué AP-
- Laver les lames dans MABT pendant 5 min.
- Bloquer avec 50 à 400 ul de solution à 1% de Tween 20 blocage pendant 20 min.
- Ajouter 50 à 400 ul d'anticorps anti-DIG-AP dilué dans une solution de blocage (1: 1000) anld incuber à 37 ° C pendant 90 min.
- Laver les lames dans MABT pendant 10 min. <li> Immerger les lames dans un tampon de détection contenant 1% de Tween 20 pendant 5 min.
- Traiter avec 50 à 400 μ de 1 mM de levamisole (dans un tampon de détection contenant 1% de Tween 20) pendant 5 minutes pour inactiver la phosphatase alcaline endogène.
- Distribuer 50 à 400 ul de la solution prémélangée NBT / BCIP (dilué dans un tampon de détection à 1: 100) sur chaque échantillon et incuber les lames dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 2 à 3 heures jusqu'à ce que le signal développé est satisfaisante.
- Rincer les lames avec de l'eau déminéralisée pour arrêter la visualisation et d'appliquer 50 à 400 pi de 0,05% [poids / volume] vert de méthyle comme contre-colorant à 37 ° C pendant 10 min.
- Rincer les lames avec de l'eau déminéralisée, déshydrater éthanol à 100%, et plongez dans le xylène.
- Appliquer 80 pi de solution de montage sur chaque diapositive et couvrir avec des lamelles.
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Representative Results
La figure 1 montre dot blot de sondes DIG-étiquetés par rapport à la sonde de contrôle positif fourni dans le kit pour déterminer leur sensibilité. Le 343 pb P. La sonde de gingivalis est 25 fois plus sensible que le eubactérienne 70 pb. La figure 2 montre l'hybridation in situ des tissus gingivaux obtenus à partir de patients atteints de parodontite chronique pour la détection de P. dans gingivalis et eubactéries. Les signaux représentés sur bactériennes, violet, ont été détectés à l'intérieur de l'épithélium, le chorion, et le biofilm se trouve à l'extérieur du tissu. Toutefois, la répartition de P. gingivalis et eubactéries dans le tissu gingival était différent. À fort grossissement (1,000X), diverses formes (coccus, tige, fusiforme, et la forme poilue) de bactéries étaient visibles en utilisant le eubactérienne, alors que seulement la tige en forme de bactéries ont été détectées par le P. La sonde de gingivalis. Les formes dispersées de signaux bactériensont également été observées.
Hajishengallis et al. en évidence le rôle essentiel de bactéries commensales dans le développement de P. gingivalis parodontite expérimentale induite chez la souris 14. L'application de sulfate de dextrane sodique (DSS), une jonction serrée (TJ) -disrupting chimique, sur la muqueuse gingivale et la parodontite induite par perte d'os alvéolaire chez des souris 13. La sonde eubactérienne détecté avec succès les bactéries dans les tissus gingivaux du groupe DSS qui ne sont pas détectées par le P. gingivalis sonde spécifique de (Figure 3).
Le eubactérienne est utile pour l'étude de la participation potentielle de bactéries dans d'autres maladies. Depuis le Centre international de recherche sur le cancer désigné Helicobacter pylori comme un cancérogène de catégorie I pour le cancer gastrique 15, la participation potentielle de bactéries dans le développement d'autres cancers a été largement étudiée. Lorsque soictions de biopsies de poumon diagnostiqué un carcinome à cellules squameuses ont été in situ hybride avec la sonde eubactérienne, les bactéries ont été détectées à la fois dans les cellules tumorales et entre le stroma environnant / l'infiltration des cellules (figure 4). L'hybridation in situ en utilisant la sonde eubactérienne a également été appliqué à explorer la présence de bactéries dans les lésions de lichen plan, une maladie immunitaire inflammatoire dont l'étiologie est inconnue. Fait intéressant, les signaux bactériens ont été détectées non seulement dans les epitheliums, mais aussi dans la lamina propria où infiltration en forme de bande a été observée. À fort grossissement, les signaux bactériennes ont été détectés dans les noyaux des cellules de nombreux (Figure 5).
Figure 1. Test de sensibilité des sondes DIG-étiquetés. Sondes marqué sur mesure dilué en série et un contr positifsonde ol fourni dans le kit ont été dot effacé avec un anticorps anti-DIG-AP-conjugué. Après l'addition du substrat, l'empreinte avec la P. La sonde de gingivalis a été développé pendant 30 secondes, tandis que le blot avec la sonde eubactérienne a été développé pendant 1 min. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Détection de bactéries dans les tissus gingivaux obtenus à partir de patients atteints de parodontite chronique. Des sections de biopsies gingivales à partir du site sain (A) et le site de la maladie (B) d'un patient atteint de parodontite ont été soumis à l'hématoxyline-éosine (H & E) coloration ou l'hybridation in situ avec le navigateur en P. gingivalis sonde spécifique de la sonde ou eubactérienne. Negative contrôles ont été hybridées avec la sonde mélangé avec un excès de sonde non marquée de 10 fois. La zone agrandie est indiquée par une boîte carrée. Signaux positifs représentatifs, représentés en violet, sont marqués par des flèches minces. Flèches épaisses indiquent biofilm à l'extérieur du tissu. Le biofilm de la plaque examiné à 1,000X agrandissement sont présentés dans des encarts. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Détection de bactéries commensales orales, dans le tissu gingival de la souris. Parodontite expérimentale a été induite chez les souris BALB / c par inoculation orale de P. gingivalis (Pg) ou l'application du DSS sur la muqueuse gingivale. Gingivales sections de souris ont été soumises à une coloration H & E ou l'hybridation in situ avec le navigateur < em> P. gingivalis sonde spécifique de la sonde ou eubactérienne. Signaux positifs représentatifs, représentés en violet, sont marqués par des flèches. Grossissement x400 est. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Détection de bactéries dans la lésion cancéreuse. Les sections de biopsies de poumons de patients atteints de carcinome à cellules squameuses ont été colorées avec H & E, soit in situ, soit hybride avec la sonde eubactérienne universel ou la sonde de témoin négatif. La zone agrandie est indiquée par une boîte carrée. Signaux positifs représentatifs, représentés en violet, sont marqués par des flèches. Bordure de cellules tumorales sont indiquées par des lignes pointillées.Arget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. La détection de bactéries dans les lésions de lichen plan. Les sections de la biopsie de la muqueuse buccale diagnostiqués comme lichen plan ont été colorées avec H & E ou in situ hybridé soit avec le eubactérienne universel ou la sonde de contrôle négatif. Les zones agrandies sont indiqués par une boîte carrée. Signaux positifs représentatifs, représentés en violet, sont marqués par des flèches. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Voici un protocole de localiser les bactéries dans les tissus inclus dans la paraffine en utilisant une sonde d'ADN marquée au DIG a été décrit. La sonde cible les molécules d'ADN ou d'ARN du gène de l'ARNr 16S bactérien, et les sondes d'ARNr 16S-ciblage peut être conçue soit comme spécifique de l'espèce ou universel. L'hybridation spécifique de la P. La sonde gingivalis de P. gingivalis mais pas à d'autres bactéries orales a été 10 précédemment montré. En revanche, la sonde hybridée à tous eubactérienne ADN génomique bactérienne testée (17 espèces différentes), bien que l'efficacité 12 d'hybridation varie. Le nombre de T-nucleotides dans la sonde détermine l'efficacité de DIG-étiquetage. La production d'une sonde marquée à la DIG avec une sensibilité élevée est l'étape la plus critique pour la mise en œuvre réussie du protocole décrit. Le traitement des échantillons avec de l'acide chlorhydrique permet d'améliorer le rapport signal sur bruit par extraction de protéines et de hydrolysi partielles de séquences cibles. Une augmentation de la concentration en protéinase K augmente l'accessibilité cible de sondes, mais réduit la préservation des tissus. Par conséquent, il est recommandé de tester plusieurs concentrations de la proteinase K, en fonction des types de tissus. L'étape d'acétylation diminue de liaison fond de la sonde de charge négative pour les protéines du tissu par acétylation des groupes amino chargés positivement. Après une série de ces étapes de préparation, les coupes de tissu se déchirer facilement, par conséquent, doivent être manipulés avec précaution. Contexte est minime par rapport aux poissons. Cependant, les signaux provenant de tissus avec une forte activité de la phosphatase alcaline endogène, tels que les os et les glandes muqueuses doivent être interprétés de manière critique.
Des sondes d'ADN amplifiés par PCR sont faciles à produire et stables par rapport à des sondes d'ARN. Détection immunohistochimique des sondes hybridées permet l'identification des structures histologiques par comparaison avec les sections H & E colorées: l'épithélium,tissu conjonctif, infiltrats inflammatoires, et les vaisseaux sanguins sont bien distingués. Une des limitations du protocole décrit est l'incapacité d'appliquer plusieurs sondes en même temps. En outre, l'exclusion des signaux de contaminants bactériens sur la surface des articles est limité.
Ce protocole peut être adapté pour détecter d'autres transcrits de bactéries à l'intérieur des sections de tissu 16. En outre, ce protocole peut être étendu à double coloration immunohistochimique avec détection d'un marqueur de la cellule hôte.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par une subvention (2013R1A1A3005669) de la National Research Foundation de Corée et une subvention (HI13C0016) de la Corée technologies de la santé Projet R & D, Ministère de la Santé et Bien-être.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
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