Introduction
Bakterier spiller en rolle i ætiologien af forskellige orale sygdomme, såsom periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis, og osteomyelitis. For at forstå den rolle bakterier i patogenesen af sygdommen og til at overvåge virkningen af behandlinger, lokalisering af bakterier i vævet er vigtig. Tilstedeværelsen af bakterier i gingival væv fra patienter med parodontitis er blevet vist under anvendelse af forskellige metoder, herunder elektronmikroskopi 1,2, immunhistokemi og immunofluorescens under anvendelse bakterier-specifikke antistoffer 3-7, og fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) under anvendelse af en 8 fluorescence- mærket oligonukleotidprobe målretning 16S rRNA. Ikke desto mindre er disse metoder ikke udbredt på grund af den tekniske begrænsning eller vanskeligheder. Sammenlignet med antistoffer, er nemme at fremstille og opnå artsspecificitet prober rettet mod 16S rRNA. FISH har vist sig at være et fremragende værktøj til visualisering af Bacteria i deres naturlige miljøer såsom plak biofilm. Imidlertid er anvendelse af fisk til vævsprøver begrænset på grund af autofluorescens af forskellige væv komponenter. For eksempel er den stærk autofluorescens af røde blodlegemer ofte hæmmer anvendelsen af fluorescens-teknologi til betændte væv, når de involverer blødning 9.
For at lokalisere bakterier inden for de betændte gingivale væv derfor et in situ-hybridisering metoden i en digoxigenin (DIG) -mærket DNA-probe er blevet udviklet og anvendt med succes 10,11. Her en detaljeret protokol for lokaliseringen af bakterier inden paraffinindlejrede væv ved hjælp af P. gingivalis-specifikke og universelle eubakterielle prober er blevet beskrevet. Det er især fokuseret på standardisering af den metode, således at lignende resultater kan reproduceres i andre laboratorier. Denne protokol muliggør lokalisering af bakterier i deres histologiske sammenhæng og results er meget reproducerbare. Den beskrevne protokol kan anvendes til at lokalisere bakterier enten i en artsspecifik eller universel måde i forskellige væv. Den universelle probe er især nyttig til at detektere bakterier i polymikrobielle sygdomme og til at undersøge en potentiel rolle af bakterier i sygdomme, hvor rollen af specifikke bakterier ikke er kendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Probe Forberedelse
- PCR-amplifikation af proben
- For P. gingivalis-specifik probe, amplificere et 343-bp DNA-fragment af P. gingivalis 16S rRNA ved PCR under anvendelse af genomisk DNA fra P. gingivalis og de følgende primere: 5'TGC AAC TTG FTT TAC AGA GG-3 'og 5'ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3' 10. Udføre amplifikationer med følgende betingelser cyklus: 35 cyklusser ved 95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 1 min 20 sek efterfulgt af en 5 min forlængelse ved 72 ° C 10,11.
- Amplificere eubakterielle probe under anvendelse af en 70-bp DNA-fragment (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') syntetiseret som et oligonukleotid og de følgende primere: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' og 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3 '11. Udfør opformeringer med følgende betingelser cyklus: 40 cyklerved 9 4 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 1 min 20 s efterfulgt af en 5 min forlængelse ved 72 ° C 11,12. - Udfælde PCR-produkterne (≥500 pi) ved tilsætning af 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 100% ethanol (ved et 10: 1: 2-forhold) og inkubering ved -20 ° C i 2 timer.
- Centrifuger blandingen ved 14.000 xg i 15 min, pellet resuspenderes i 100 pi TE-buffer, og måle DNA-koncentration ved optisk tæthed ved 260 nm.
- DIG-mærkning ved hjælp af en DIG DNA-mærkning og detektion kit
- Bland 3 ug af sonden med vand til et slutvolumen på 15 pi.
- Denaturere DNA ved 95 ° C i 10 minutter og hurtigt chill på is.
- Tilsæt 2 pi 10x hexanucleotid mix, 2 pi dNTP-mærkning mix, og 1 pi af Klenow-enzym til 15 pi af den denaturerede DNA.
- Blandes og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer til 48 timer og stop reaktionen ved opvarmning til 65 ° C.
- Check følsomhed DIG-mærkede probe under anvendelse af et DIG DNA-mærkning og påvisning kit
- Manuelt indlæse 1 pi seriefortyndinger af den positive kontrol probe tilvejebragt i kittet og 1 ng af DIG-mærket probe på nylonmembran og tørre i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kort fortalt suge membranen i 2 x SSC puffer (0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitrat, pH 7,0) og inkuberes membranen ved 80 ° C i 1 time for at immobilisere DNA'et.
- Kort fortalt suge membranen i maleinsyre-buffer (MAB, 0,1 M maleinsyre, 0,15 M NaCl, pH 7,5) og inkuberes med anti-DIG alkalisk phosphatase (AP) -konjugeret antistof fortyndet (1: 5000) i 6 ml blokeringsopløsning billede i sættet ved stuetemperatur i 30 min.
- Vask membranen med MABT (MAB indeholdende 1% Tween 20) og anvende 40 pi af NBT / BCIP-opløsning blandet med 2 ml detektion puffer (0,1 M Tris-HCI, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, pH 9,5) på membran i 1 min. Hvis følsomheden af den mærkede probe erikke tilfredsstillende, gentage trin fra 1.1.3 til 1.3.4.
- Måle DNA-koncentrationen af den mærkede probe (OD260), og indstille koncentrationen til 100 ng pi -1.
- Kontroller specificiteten af DIG-mærket probe
- Denaturere genomiske DNA-prøver (25 ng 3 pi -1 per hver prøve) fra forskellige bakteriearter, herunder bakterien målrettet af den specifikke probe, ved 95 ° C i 10 minutter og hurtigt chill på is.
- Manuelt indlæse den denaturerede DNA på nylonmembran og tørre i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Kort fortalt suge membranen i 2 x SSC-buffer og inkuberes membranen ved 80 ° C i 2 timer for at immobilisere DNA'et.
- Blokere membranen med en blokerende opløsning ved stuetemperatur i 1 time.
- Fortynd probe ved 1 ng pi -1 i hybridiseringsbuffer, denaturere de fortyndede prober, og anvende på membranen.
- Inkuber membranen ved 45 ° C i 1 time.
- Vask membranen tregange med 2 x SSC puffer.
- Kortvarigt suge membranen i MAB.
- Inkubere med anti-DIG AP-konjugeret antistof fortyndet (1: 2.000) i 6 ml blokerende opløsning ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask membranen med MABT og anvende 40 pi af NBT / BCIP-opløsning blandet med 2 ml detektion puffer.
- Når proben ikke opnår den forventede specificitet, øge hybridisering temperatur, indtil specificiteten observeres.
2. In situ hybridisering
Bemærk: For at undgå udtørring af de prøver og reagenser, udføre alle inkubationer i et fugtigt kammer foret med våde papirservietter.
- De-paraffinization og rehydrering af vævssnit
- Forbered 4 um tykke vævssnit fra paraffinindlejrede blokke. Formalin, paraformaldehyd, og zink-baserede fiksativ er forenelige med denne protokol.
- Forbered alle reagenser ved hjælp DEPC-behandlet vand.
- Heat glider i en tør ovn ved 60 ° C i 30 minutter og inkuberes slides ved stuetemperatur i 30 min.
- Fordyb dias i 100% xylen i 5 min tre gange; bruge frisk xylen hver gang.
Bemærk: Gør dette de-voksning procedure i stinkskab. - Fordybe objektglassene i 100% ethanol i 5 minutter to gange ved anvendelse af frisk ethanol hver gang og rehydrere prøver i serielle 90%, 80% og 70% ethanolopløsninger i 5 min hver.
- Fordybe objektglassene i DEPC-behandlet vand i 1 min og vask objektglas i DEPC-behandlet PBS (pH 7,4) i 6 min.
- Forbehandlinger af vævssnit
- Fordybe objektglassene i 0,1 N saltsyre i 20 minutter og vask objektglas i DEPC-behandlet vand i 30 sek.
- Tegn en hydrofob barriere omgivende prøver vha en voks pen.
Bemærk: Størrelsen af den hydrofobe barriere afhænger af størrelsen af enheder. Derfor mængderne af reagenser, der anvendes i de følgende trin varierer afhængigt af størrelsen af enheder, men er nødt til at fylde hydrophobic barriere (50 ul for små prøver og 400 pi for store eksemplarer). - Behandle prøver med 50 til 400 pi proteinase K (1 til 10 ug ml -1 i DEPC-behandlet PBS) i en tør ovn ved 37 ° C i 30 min og vask objektglas i DEPC-behandlet 1x PBS i 1 min.
- Soak objektglas i 4% paraformaldehyd i DEPC-behandlet PBS i 10 minutter, vask derefter objektglas i DEPC-behandlet PBS i 1 min.
- Soak objektglas i 0,1 M triethanolamin-HCI (pH 8,0) indeholdende 0,5% eddikesyreanhydrid i 20 minutter og vask objektglas i DEPC-behandlet vand i 30 sek.
- Hybridisering med probe og vask
- Fordybe objektglassene i 2 x SSC puffer i 20 minutter.
- Fortynd probe ved 1 ng pi -1 i hybridiseringsbuffer (4x SSC, 50% [vol / vol] formamid, 1x Denhardts opløsning, 10% [vægt / volumen] dextransulfat, 0,1% [vægt / volumen] natriumdodecylsulfat, 0,4 mg ml -1 laksesperm DNA). For negative kontroller, bland den mærkede probe meden 10-fold overskydende mængde ikke-mærket probe.
- Denaturere de fortyndede prober og anvende 50 til 400 pi på vævssnit. Placer en dækglas på dias og forsegle med neglelak.
- Heat glider i PCR-maskine ved 90 ° C i 10 minutter og inkuberes objektglassene i et fugtigt kammer O / N ved 45 ° C eller optimale temperatur bestemmes ved trin 1.4.11.
- Afkøle objektglassene ved 4 ° C i 30 minutter, fjern dækglas, og fordybe objektglassene i en seriel SSC buffer som followings: 4x SSC i 10 min, foropvarmet (45 ° C) 2x SSC i 20 min, 2x SSC i 10 min, og 0,2 x SSC i 10 min.
- Påvisning med anti-DIG AP-konjugeret antistof
- Vask objektglas i MABT i 5 min.
- Blok med 50 til 400 pi blokerende opløsning med 1% Tween 20 i 20 minutter.
- Tilføje 50 til 400 pi anti-DIG-AP-antistof fortyndet med blokerende opløsning (1: 1.000) anld inkuber ved 37 ° C i 90 minutter.
- Vask objektglas i MABT i 10 min. <li> Fordyb objektglas i detektering puffer indeholdende 1% Tween 20 i 5 minutter.
- Der behandles med 50 til 400 μ af 1 mM levamisol (i detektion puffer indeholdende 1% Tween 20) i 5 minutter for at inaktivere endogen alkalisk phosphatase.
- Fordel 50 til 400 pi af det forblandede NBT / BCIP-opløsning (fortyndet i detektion buffer ved 1: 100) på hver prøve og inkuber objektglassene i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 2 til 3 timer, indtil den udviklede signal er tilfredsstillende.
- Skyl objektglassene med deioniseret vand for at stoppe visualisering og anvende 50 til 400 pi af 0,05% [vægt / volumen] methyl grøn som en tæller plet ved 37 ° C i 10 min.
- Skyl dias med de-ioniseret vand, dehydrere i 100% ethanol, og fordybe i xylen.
- Påfør 80 pi monteringsløsning på hvert dias og dæk med dækglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser dot blotting af DIG-mærkede prober i forhold til den positive kontrol sonde leveret med kittet til bestemmelse af deres følsomhed. Den 343 bp P. gingivalis-specifik probe er 25 gange mere følsom end 70 bp eubakterielle probe. Figur 2 viser in situ-hybridisering af gingivale væv fra patienter med kronisk parodontitis til påvisning af P. gingivalis og eubakterier. De bakterielle signaler, vist i violet, blev påvist i epitel, lamina propria, og biofilm placeret uden vævet. Men fordelingen af P. gingivalis og eubakterier inden for gingival væv var anderledes. Ved stor forstørrelse (1.000X), forskellige former (coccus, stang, fusiform, og behårede form) af bakterier var synlige ved hjælp af den eubakterielle probe, mens kun stavformede bakterier blev detekteret af P. gingivalis-specifik probe. De dispergerede former af bakterielle signalerDer blev også observeret.
Hajishengallis et al. demonstrerede den vigtige rolle, som kommensale bakterier i udviklingen af P. gingivalis induceret eksperimentel parodontitis i mus 14. Anvendelsen af dextransulfat-natrium (DSS), en tight junction (TJ) -disrupting kemiske, onto gingival mucosa induceret parodontitis og alveolært knogletab hos mus 13. Den eubakterielle sonde held opdaget bakterier inden for de gingivale væv fra DSS gruppe, der ikke blev opdaget af P. gingivalis-specifik probe (figur 3).
Den eubakterielle probe er nyttig til undersøgelse af den potentielle involvering af bakterier i andre sygdomme. Da Det Internationale Agentur for Kræftforskning betegnet Helicobacter pylori som en karakter, jeg kræftfremkaldende stof for mavekræft 15, har potentiel inddragelse af bakterier i udviklingen af andre kræftformer blevet bredt undersøgt. Når seKTIONER af lungebiopsier diagnosticeret med pladecellecarcinom var in situ hybridiseret med eubakterielle probe, blev bakterier påvist både i tumorcellerne og blandt de omgivende stromale / infiltrerende celler (figur 4). In situ-hybridisering under anvendelse af eubakterielle probe blev også anvendt på udforske tilstedeværelsen af bakterier i læsioner af oral lichen planus, en inflammatorisk immunsygdom med ukendt ætiologi. Interessant nok blev bakterielle signaler detekteres ikke kun i epitel, men også i lamina propria hvor båndlignende infiltration blev observeret. Under stor forstørrelse blev de bakterielle signaler detekteret i kernerne i mange celler (figur 5).
Figur 1. Følsomhed test af DIG-mærkede prober. Seriefortyndet custom-mærkede prober og en positiv control sonde leveres i sættet blev dot blottet med anti-DIG-AP-konjugeret antistof. Efter tilsætning af substratet, blottet med P. gingivalis-specifik probe blev udviklet til 30 sek, mens blottet med eubakterielle probe blev udviklet til 1 min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Påvisning af bakterier i gingivale væv fra patienter med kronisk parodontitis. Dele af gingivale biopsier fra sunde stedet (A) og det syge sted (B) af en patient med parodontitis blev underkastet hematoxylin-eosin (H & E) farvning eller in situ hybridisering med enten P. gingivalis-specifik probe eller den eubakterielle probe. Negative kontroller blev hybridiseret med proben blandet med 10-fold overskud af umærket probe. Det forstørrede område er angivet med en firkantet kasse. Repræsentative positive signaler, vist i violet, er markeret med tynde pile. Tykke pile angiver plak biofilm uden vævet. Plaque biofilm undersøgt på 1.000X forstørrelse er vist i mellemværker. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Påvisning af orale kommensale bakterier i tandkødet af mus. Eksperimentel parodontitis blev induceret i BALB / c-mus ved oral inokulering af P. gingivalis (Pg), eller anvendelsen af DSS på gingival slimhinde. Gingivale snit fra mus blev udsat for H & E-farvning eller in situ hybridisering med enten < em> P. gingivalis-specifik probe eller den eubakterielle probe. Repræsentative positive signaler, vist i violet, er markeret med pile. Original forstørrelse er x400. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Detektion af bakterier i kræft læsion. De dele af lunge biopsier fra patienter diagnosticeret med pladecellecarcinom blev farvet med H & E eller in situ hybridiseret med enten den universelle eubakteriel probe eller den negative kontrol probe. Det forstørrede område er angivet med en firkantet kasse. Repræsentative positive signaler, vist i violet, er markeret med pile. Border af tumorceller er angivet med stiplede linier.Arget = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Påvisning af bakterier i læsioner af oral lichen planus. De dele af biopsi fra mundslimhinden diagnosticeret som oral lichen planus blev farvet med H & E eller in situ hybridiseret med enten den universelle eubakteriel probe eller den negative kontrol probe. De forstørrede områder er angivet med en firkantet kasse. Repræsentative positive signaler, vist i violet, er markeret med pile. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her en protokol til at lokalisere bakterier i paraffinindlejrede væv under anvendelse af en DIG-mærket DNA-probe er blevet beskrevet. Sonden er rettet mod de DNA eller RNA-molekyler af bakteriel 16S rRNA-genet, og 16S rRNA-målretning prober kan være udformet som enten artsspecifik eller universel. Den specifikke hybridisering af P. gingivalis-specifik probe til P. gingivalis men ikke til andre orale bakterier er tidligere blevet vist 10. I modsætning hertil eubakterielle probe hybridiseret til alle bakterielle genomisk testede DNA (17 forskellige arter), selv om hybridisering effektivitet varierede 12. Antallet af T-nukleotider i proben bestemmer effektiviteten af DIG-mærkning. Produktion af en DIG-mærket probe med høj følsomhed er den mest kritiske skridt for en vellykket gennemførelse af den beskrevne protokol. Behandling af prøver med saltsyre forbedrer signal-til-støj-forhold ved ekstraktion af proteiner og delvis hydrolysis af målsekvenser. En stigning i koncentrationen af proteinase K øger target tilgængelighed af prober men reducerer vævskonservering. Det anbefales derfor, at teste adskillige koncentrationer af proteinase K, afhængigt af de typer af væv. Acetyleringen trin nedsætter baggrund binding af den negativt ladede probe til proteinerne i vævet ved acetylering de positivt ladede aminogrupper. Efter en række af disse fremstillingstrin, vævssnittene rive let således skal håndteres med forsigtighed. Baggrunden er minimal sammenlignet med fisk. Dog bør signalerne fra væv med høj endogen alkalisk phosphatase aktivitet såsom knogler og slim kirtler kritisk fortolkes.
PCR-amplificerede DNA-prober er nemme at fremstille og stabilt i forhold til RNA-prober. Immunohistokemisk påvisning af hybridiserede prober til identifikation af histologiske strukturer gennem sammenligning med H & E-farvede sektioner: epithelet,bindevæv, inflammatoriske infiltrater, og blodkar er godt fornemme. En af begrænsningerne ved den beskrevne protokol er den manglende evne til at anvende multiple prober samtidigt. Derudover udelukkelse af signalerne fra bakterielle forureninger på overfladen af sektioner er begrænset.
Denne protokol kan tilpasses til påvisning af andre bakterielle transkripter inden vævssnit 16. Derudover kan denne protokol udvides til dobbelt farvning med immunhistokemisk detektion af en værtscelle markør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling (2013R1A1A3005669) fra Grundforskningsfonden Korea og et tilskud (HI13C0016) af den koreanske Health Technology R & D Project, Ministeriet for Sundhed og Velfærd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
