Terwijl hoge resolutie smeltende analyse biedt de mogelijkheid om te differentiëren tussen single nucleotide polymorfismen in een heterogene populatie, kunnen mutante allel amplificatie vertekening zijn vermogen allelen aanwezig betrekkelijk lage percentages in een monster te detecteren verhogen. Dit protocol beschrijft verbeteringen die de gevoeligheid van hoge resolutie smeltende analyse te verbeteren.
Ondanks decennia van uitroeiing inspanningen, malaria blijft een wereldwijde belasting. Recente hernieuwde belangstelling voor regionale eliminatie en wereldwijde uitbanning ging gepaard met verhoogde genomische informatie over de parasiet Plasmodium soorten die verantwoordelijk is voor malaria, met inbegrip van de kenmerken van de geografische populatie evenals variaties geassocieerd met een verminderde gevoeligheid voor medicijnen tegen malaria.
Een veel voorkomende genetische variatie, single-nucleotide polymorfismen (SNP's), biedt een aantrekkelijk doelwit voor parasiet genotypering. Deze markers zijn nuttig niet alleen voor het bijhouden drugresistentie markers maar ook voor het volgen parasietenpopulaties behulp markers niet onder geneesmiddel of ander selectiedruk.
SNP genotypering methoden bieden de mogelijkheid om geneesmiddelresistentie te sporen en aan individuele parasieten vingerafdruk voor bewaking bevolking, met name in reactie op malariacontrole inspanningen in gebieden bijna elimination staat.
Terwijl informatieve SNPs geïdentificeerd die agnostische specifieke genotypering technologieën met hoge resolutie samensmelten (HRM) analyse is bijzonder geschikt voor veld-gebaseerde studies. In vergelijking met standaard fluorescentie-probe gebaseerde methoden die individuele SNPs in één gelabelde probe nodig en bieden hoogstens 10% gevoeligheid voor SNPs te detecteren in monsters die meerdere genoom (polygenomic) bevatten, HRM biedt 2-5% sensitiviteit. Wijzigingen aan HRM, zoals geblokkeerde probes en asymmetrische primerconcentraties en optimalisatie van de amplificatie annealing temperaturen voorspanning aan PCR amplificatie van het kleinere allel, verder de gevoeligheid van HRM. Terwijl de verbetering gevoeligheid is afhankelijk van de specifieke test hebben we detectiegevoeligheden steeg tot minder dan 1% van het kleinere allel.
In regio's naderen malaria uitroeiing, vroegtijdige opsporing van nieuwe of geïmporteerde resistentie tegen geneesmiddelen is essentieel voor de prOmpT reactie. Op dezelfde manier kan de mogelijkheid om polygenomic infecties te detecteren en te differentiëren geïmporteerde parasiet soorten van cryptische lokale reservoirs controleprogramma's op de hoogte.
Dit manuscript beschrijft wijzigingen in hoge resolutie smelten technologie verder te verhogen de gevoeligheid voor polygenomic infecties bij patiënten monsters te identificeren.
Ondanks de hernieuwde belangstelling voor malaria bestrijding en uitroeiing, malaria blijft een wereldwijde belasting, met bijna de helft van de wereldbevolking risico op infectie en meer dan 550.000 doden per jaar, met name kinderen in sub-Sahara Afrika 1.
Deze nieuwe bestrijding en uitroeiing programma's zijn ondersteund door de genomische renaissance, met grote aantallen malariaparasieten gesequenced en geanalyseerd voor mutaties geassocieerd met een verminderde gevoeligheid voor drugs, verhoogde virulentie, en voor de kenmerken bevolking 2,3. Single nucleotide polymorfismen (SNP's) behoren tot de meest geïdentificeerde genetische varianten 4-7.
Draagbare SNP genotypering methoden bieden op het terrein en real-time bewaking bevolking en het bijhouden 8. Naast vingerafdrukken individuele parasieten, is de moleculaire streepjescode ook dramatische tijdelijke verschuivingen in allelfrequentie detecterenevenals variantie effectieve populatiegrootte en de complexiteit van de infectie 9.
Hoewel deze reeks informatieve SNP's is eenvoudig aan te passen aan vele genotypering platforms, hoge resolutie smelten (HRM) analyse is bijzonder geschikt om het veld op basis van studies, waar gevoelige en eenvoudige bediening en detectie van nieuwe mutaties tegen lage kosten in vergelijking met sequencing en andere benaderingen zijn aantrekkelijk in resource-arme instellingen.
HRM begint met standaard polymerase-kettingreactie (PCR), die een fluorescerende kleurstof bevat. Post-PCR smelten analyse bepaalt de piek amplicon smelttemperatuur; één SNP verschil in een korte amplicon kan aanzienlijke piek smelttemperatuur (Tm) verschillen.
Diverse verfijningen van deze methode bieden betere genotypering resolutie te SNPs waaronder klasse IV (AT) SNPs differentiëren en detecteren kleine mutante allelen in monsters met meerdere allelen aanwezig (polygenomic infecties). Ten eerste, de assays omvatten korte probes gecentreerd over het gebied SNP naast voorwaartse en reverse primers die aanwezig zijn op verschillende concentraties. Deze geblokkeerde probes worden niet geamplificeerd in PCR, maar bindt aan de streng die boven vanwege asymmetrische primerconcentraties dat de productie van de probe-template product te verhogen. Deze afzonderlijke dubbelstrengs amplicons bestaande uit sonde gebonden aan de overtollige matrijsstreng zijn ~ 20-30 bp; hun lengte significant af vergeleken met de totale amplicon (80-150 bp) leiden tot veel grotere Tm verschillen met enkelvoudige of meervoudige base probe-template komt niet overeen 10.
Tweede, mutant allel versterking vooringenomenheid (Maab) verlaagt de reactie gloeitemperatuur om vertekening van de reactie in de richting van mutante allelen aanwezig bij lage verhoudingen in polygenomic infecties. De annealing temperatuur ligt tussen de Tms van perfect op elkaar afgestemd (wild-type) en mismatched (mutant) probes. Bij deze temperatuur, de binding van de wild-type allel is stabiel genoeg dat amplificatie wordt belemmerd ten opzichte van zijn mismatch equivalent, waardoor voorspannen van het amplificatie richting mutant allel wanneer beide aanwezig zijn in een enkel monster 10 zijn.
Met deze HRM verfijningen is deze technologie volgen van oorsprong en identiteit van parasieten geassocieerd epidemische infecties in Zuid-Amerika 11 en detectie van nieuwe mutaties differentiatie van verschillende SNPs zich direct naast elkaar in de juiste volgorde, en mutaties die aanwezig kunnen zijn op minder dan 1 % van de allelen in polygenomic 10 monsters.
Verhoogde gevoeligheid is vooral belangrijk in gebieden benaderen pre-eliminatie toestand en risicogroepen opkomende resistentie. De mogelijkheid om snel en eenvoudig ingevoerd parasieten en SNPs geassocieerd met verminderde gevoeligheid eigen identificatie informeert surveillance inspanningen en controleprogramma's overde effectiviteit van hun implementaties en identificeert hotspots voor verhoogde malaria uitroeiing en eliminatie inspanningen. Dit protocol beschrijft de methoden voor geblokkeerde-probe-gebaseerde en Maab voor verhoogde HRM genotypering gevoeligheid.
Continu HRM is een post-PCR analyse stap; Daarom monster en test opstelling is vergelijkbaar met standaard PCR-protocollen, met de extra opname van een fluorescerende intercalerende kleurstof gebruikt om de overgang van spoor dubbelstrengs enkelstrengs DNA in de hoge-resolutie smeltstap. De belangrijkste factor voor een succesvolle HRM-analyse is een robuust PCR product. Assay ontwerp is de sleutel, en verschillende tools geoptimaliseerd voor HRM-test design zijn commercieel en online 13 beschikbaar. Amplicon lengte van 80-150 baseparen met bijbehorende ~ 20 basenparen geblokkeerd sondes gecentreerd over de SNP of SNPs van belang het beste werken om SNPs alsmede haplotypes van meerdere SNPs differentiëren binnen de sonde regio. Probes kunnen worden geblokkeerd met behulp van een 3 'C3 spacer of 2 basepaar misparing aan het 3' uiteinde, welke verlenging gedurende amplificatie voorkomen. Probes kunnen worden ontworpen om de Watson Crick of matrijsstreng passen; de keuzeafhankelijk van empirische testen om te bepalen welke probe ontwerpacceptable smeltpieken produceert. Excess forward of reverse primers gebruikt enkelstrengs amplificatieproduct dat versmelt de geblokkeerde probes te produceren. Als de sonde zijn voorwaartse streng sequentie, dan reverse primer in overmaat wordt gebruikt, typisch in een 1: 5-verhouding, en vice-versa te probes die overeenkomen met de omgekeerde streng.
Ook HRM werkt het beste met voldoende en robuuste PCR-product. PCR reactieoptimalisatie vereist gradiënt PCR en agarose gels of Bioanalyzer analyse optimale gloeitemperaturen bepalen. Templateconcentratie kan worden verhoogd onder toepassing van werkwijzen zoals pre-amplificatie voorgespannen multiplex amplificatie van alle doelen gebruikt lage primer concentratie en cyclus nummers om de templateconcentratie 13 verhogen.
Slechts een handvol instrumenten zijn compatibel met Maab. De thermische eigenschappen van de glazen capillairen gebruikte buizen in betrokken systemen deze methode. De kleine inwendige diameter van de capillairen en de snelle warmteoverdracht door glas bieden strengere temperatuurregeling dan standaard PCR plasticware, die langzamere overgang weer tussen denaturatie en annealing cycli als gevolg van de thermische isolerende eigenschappen van de kunststof heeft. Met deze methode kan detectiegevoeligheden worden verlaagd van 2,5% tot minder dan 1% van een mutant allel in een mengsel van wild-type en mutante allelen 10.
HRM is een gemakkelijke, efficiënte en economisch hulpmiddel voor SNP genotypering in een verscheidenheid van instellingen en tal van toepassingen, van infectieziekten surveillance om het scannen voor kanker gen-varianten. Verscheidene andere instrumenten, zoals de Roche Nano en LightCycler systeem (480 en 96) en het Eco real-time PCR systeem maken HRM naast standaardamplificatiemethoden, real-time en aantal kopieën functionaliteit. Met behulp van een hogere doorvoersnelheid machines, HRM barcoding kost less dan $ 0,50 per test in onze handen, met inbegrip van alle reagentia en verbruiksartikelen.
In de hier beschreven context, field-based toepassingen kunt real-time bevolking surveillance voor veranderingen in verband met malaria controle-inspanningen, met inbegrip van verminderde diversiteit bevolking, detectie van geïmporteerde parasiet soorten, en het uiterlijk en de verspreiding van SNPs geassocieerd met een verminderde gevoeligheid drug. Verfijningen aan de methode bieden extra gevoeligheid nuttig voor de ontwikkeling van malaria eliminatie en uitroeiing informeren.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken de Bill en Melinda Gates Foundation voor zijn ondersteuning van de technologie-ontwikkeling en training.
LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
TE | Teknova | T0226 | |
Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
PCR grade water | Teknova | W3330 | |
Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |