Mens høj opløsning Smelteanalyse giver mulighed for at skelne mellem enkelte nukleotidpolymorfismer i en heterogen population, kan mutant allel forstærkning forspænding øge sin evne til at detektere alleler der er til stede ved relativt lave procentdele i en prøve. Denne protokol beskriver forbedringer, der forbedrer følsomheden af høj opløsning smeltepunkt analyse.
Trods årtiers indsats for udryddelse, malaria er fortsat en global byrde. Seneste fornyet interesse for den regionale eliminering og global udryddelse har været ledsaget af øget genomisk information om Plasmodium parasit arter er ansvarlige for malaria, herunder karakteristika ved de geografiske populationer samt variationer forbundet med nedsat følsomhed over for malariamedicin.
En almindelig genetisk variation, single-nukleotid polymorfier (SNP), tilbyder attraktive mål for parasit genotypebestemmelse. Disse markører er ikke kun nyttig til sporing lægemiddel-resistens markører, men også til sporing parasit populationer ved hjælp af markører der ikke hører under lægemiddel eller andre selektive pres.
SNP genotypebestemmelsesmetoder tilbyder muligheden for at spore resistens samt fingeraftryk individuelle parasitter til befolkningen overvågning, især som reaktion på malaria kontrol indsats i regioner nærmer elimination status.
Mens informative SNP'er er blevet identificeret som er agnostiske til specifikke genotype teknologier, høj opløsning smeltning (HRM) analyse er særlig velegnet til felt-baserede undersøgelser. I forhold til standard fluorescerende-probe baserede metoder, der kræver individuelle SNP'er i en enkelt mærket probe og tilbyde i bedste 10% sensitivitet til at opdage SNPs i prøver, der indeholder flere genomer (polygenomic), HRM tilbyder 2-5% følsomhed. Ændringer til HRM, såsom blokerede prober og asymmetriske primerkoncentrationer samt optimering af amplifikation annealeringstemperaturer at forspænde PCR mod amplifikation af den mindre allel, yderligere at øge følsomheden af HRM. Mens følsomhed forbedring afhænger af den specifikke assay, har vi øget afsløring følsomhed til mindre end 1% af den mindre allel.
I regioner nærmer malaria udryddelse, er afgørende for PR tidlig påvisning af nye eller importeret lægemiddelresistensOmpT respons. Ligeledes kan evnen til at opdage polygenomic infektioner og differentiere importerede parasit typer fra kryptiske lokale reservoirer informere kontrolprogrammer.
Dette manuskript beskriver ændringer høj opløsning smeltende teknologi, der yderligere øger følsomheden for at identificere polygenomic infektioner i patientprøver.
Trods fornyet interesse for malaria bekæmpelse og udryddelse, malaria fortsat en verdensomspændende byrde, med næsten halvdelen af verdens befolkning i risiko for infektion og mere end 550.000 dødsfald årligt, især børn i Afrika syd for Sahara 1.
Disse nye kontrol- og udryddelsesprogrammer er blevet støttet af den genomiske renæssance, med et stort antal malariaparasitter sekventeret og analyseret for mutationer forbundet med nedsat narkotika følsomhed, øget virulens, og til befolkningspolitik egenskaber 2,3. Single-nucleotid (SNP'er) er blandt de mest almindeligt identificerede genetiske varianter 4-7.
Bærbare SNP genotypebestemmelsesmetoder tilbyder on-site og real-time befolkning overvågning og sporing 8. Ud over fingeraftryk forskellige parasitter, er den "molekylære stregkode" også anvendes til at detektere dramatiske tidsmæssige forskydninger i allelfrekvenssamt variansen effektiv populationsstørrelse og kompleksitet infektion 9.
Mens dette sæt af informative SNPs let tilpasses til mange genotype platforme, høj opløsning smeltning (HRM) analyse er især velegnet til felt-baserede undersøgelser, hvor følsomme og enkel betjening og påvisning af hidtil ukendte mutationer ved lave omkostninger i forhold til sekventering og andre tilgange er attraktive i ressourcefattige indstillinger.
HRM starter med standard polymerasekædereaktion (PCR), der inkorporerer et fluorescerende farvestof. Post-PCR smelteanalyse bestemmer den maksimale amplicon smeltepunktet; en enkelt SNP forskel i en kort amplikon kan resultere i betydelige peak smeltetemperaturen (Tm) forskelle.
Adskillige raffinementer til denne metode giver bedre genotypning beslutning til differentiere SNPs, herunder klasse IV (AT) SNPs, og afsløre mindre mutantalleler i prøver med flere alleler tilstedeværende (POLYGenomic infektioner). Først assayene optage korte prober centreret over SNP region foruden forward og reverse primere, som er til stede i forskellige koncentrationer. Disse blokerede prober er ikke amplificeret under PCR, men binder til den streng, der er produceret i overskud på grund af asymmetriske primerkoncentrationer der øger produktionen af sonden-template produkt. Disse separate dobbeltstrengede amplikoner bestående af probe bundet til overskydende template-strengen er ~ 20-30 bp; deres faldt betydeligt længde sammenlignet med hele amplikon (80-150 bp) føre til meget større Tm forskelle forbundet med en enkelt eller flere baser probe-skabelon, stemmer ikke overens 10.
For det andet, mutant allel forstærkning bias (MAAB) sænker reaktionen annealingstemperatur at forspænde reaktionen mod mutantalleler stede ved lave forhold i polygenomic infektioner. Annealingstemperatur indstilles mellem smeltepunkter på perfekt matchede (vildtype) og uoverensstemmende (mutant) probes. Ved denne temperatur bindingen af vildtype-allelen er stabil nok, at amplifikation hindres i forhold til sin mismatch tilsvarende, således påvirke forstærkningen mod mutante allel, når begge er til stede i en enkelt prøve 10.
Med disse HRM raffinementer, har denne teknologi tillod sporing af oprindelsen og identiteten af parasitter, der er forbundet med epidemiske infektioner i Sydamerika 11 og detektion af nye mutationer, differentiering af flere SNPs placeret umiddelbart ved siden af hinanden i rækkefølge, og mutationer til stede i mindre end 1 % af allelerne i polygenomic prøver 10.
Øget følsomhed er særlig vigtigt i områder, der nærmer pre-elimination status og de udsatte for nye lægemiddelresistens. Evnen til hurtigt og nemt identificere importerede parasitter og SNPs forbundet med nedsat følsomhed på stedet oplyser overvågning indsats og kontrolprogrammer omeffektiviteten af deres implementeringer og identificerer hotspots for øget malaria udryddelse og elimination indsats. Denne protokol beskriver metoderne til blokeret-sonde-baserede og MAAB for øget HRM genotypning følsomhed.
Kontinuerlig HRM er en post-PCR-analyse trin; derfor prøve og assay setup ligner standard-PCR-protokoller, med den yderligere inkorporering af en fluorescerende indlejringsfarvestof bruges til at spore overgangen fra dobbeltstrenget til enkeltstrenget DNA under smelteprocessen trin høj opløsning. Den vigtigste faktor for en vellykket HRM analyse er et robust PCR-produkt. Assay design er nøglen, og flere værktøjer optimeret til HRM assay design er tilgængelige kommercielt og online 13. Amplicon længder på 80-150 basepar med tilhørende ~ 20 basepar blokeret prober centreret over SNP eller SNP'er af interesse virker bedst at differentiere SNPs samt haplotyper af multiple SNPs inden sonden regionen. Prober kan blokeres ved hjælp af enten en 3'C3 spacer eller et par mismatch 2 base ved 3'-enden, som forhindrer forlængelse under amplifikation. Prober kan udformes til at passe til Watson Crick eller template-strengen; valgetafhænger af empirisk test for at afgøre, hvilken sonde design producerer acceptable smeltende toppe. Overskydende frem eller tilbage-primere anvendes til at fremstille enkeltstrenget amplifikationsprodukt, der annealer til de blokerede prober. Hvis proben indeholder den forreste streng sekvensen, derefter revers primer anvendes i overskud, typisk i en 1: 5-forhold, og vice versa for prober, der svarer til den omvendte streng.
Tilsvarende HRM fungerer bedst med tilstrækkelig og robust PCR-produkt. PCR-reaktion optimering kræver gradient PCR og agarosegeler eller Bioanalyzer analyse for at bestemme optimale annealing temperaturer. Skabelon koncentration kan øges ved hjælp af metoder som præ-forstærkning, forudindtaget multiplex forstærkning af alle mål ved hjælp af lav primer koncentration og cyklus numre at øge skabelonen koncentrationen 13.
Kun en håndfuld af instrumenter er kompatible med MAAB. De termiske egenskaber af glas kapillærer rør bruges in disse systemer lette denne fremgangsmåde. Den lille indvendige diameter af kapillærer samt hurtig varmeoverførsel gennem glas tilbyde strengere temperaturkontrol end standard-PCR plastvarer, som har langsommere overgangsfrekvenser mellem annealing og denatureringscykler grund af den termiske isolerende egenskaber af plast. Med denne fremgangsmåde kan afsløring følsomhed nedsættes fra 2-5% til mindre end 1% af en mutant allel i en blanding af vildtype og mutant alleler 10.
HRM er en letkøbt, effektiv og økonomisk værktøj til SNP genotypning i en række forskellige indstillinger og mange applikationer, fra smitsomme sygdomme overvågningen til scanning for kræft genvarianter. Flere andre instrumenter, såsom Roche Nano og LightCycler systemer (480 og 96) samt Eco Real-time PCR-system tilbyde HRM i tillæg til standard forstærkning, real-time, og copy-nummer funktionalitet. Brug højere throughput maskiner koster HRM barcoding less end $ 0,50 per assay i vores hænder, herunder alle reagenser og forbrugsvarer.
I forbindelse beskrevet her, felt-baserede applikationer tillader realtid befolkning overvågning af ændringer i forbindelse med malaria kontrolindsats, herunder befolkning mangfoldighed reduceret, afsløring af importerede parasit typer, og fremkomsten og spredningen af SNPs forbundet med nedsat narkotika følsomhed. Justeringer af metoden tilbyder ekstra følsomhed nyttig til at informere fremskridt mod malaria eliminering og udryddelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Bill og Melinda Gates Foundation for sin støtte til teknologiudvikling og uddannelse.
LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
TE | Teknova | T0226 | |
Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
PCR grade water | Teknova | W3330 | |
Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |