उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण एक विषम जनसंख्या में एकल nucleotide बहुरूपताओं के बीच अंतर करने की क्षमता प्रदान करता है, उत्परिवर्ती एलील प्रवर्धन पूर्वाग्रह एक नमूना भीतर अपेक्षाकृत कम प्रतिशत में उपस्थित एलिलों पता लगाने की क्षमता बढ़ा सकते हैं। इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प पिघलने विश्लेषण की संवेदनशीलता में सुधार है कि सुधार का वर्णन है।
उन्मूलन के प्रयासों के दशकों के बावजूद, मलेरिया एक वैश्विक बोझ बनी हुई है। क्षेत्रीय उन्मूलन और वैश्विक उन्मूलन में हाल ही नए सिरे से रुचि मलेरिया रोधी दवाओं के लिए कम संवेदनशीलता के साथ जुड़े भौगोलिक आबादी की विशेषताओं के साथ ही रूपों सहित मलेरिया के लिए जिम्मेदार प्लाज्मोडियम परजीवी प्रजाति है, के बारे में वृद्धि जीनोमिक जानकारी के साथ किया गया।
एक आम आनुवंशिक परिवर्तन, एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs), परजीवी जीनोटाइपिंग के लिए आकर्षक लक्ष्य प्रदान करता है। इन मार्कर दवा प्रतिरोध मार्कर पर नज़र रखने के लिए, लेकिन यह भी नहीं दवा या अन्य चयनात्मक दबाव के तहत मार्कर का उपयोग परजीवी आबादी को ट्रैक करने के लिए न केवल उपयोगी होते हैं।
एसएनपी जीनोटाइपिंग तरीकों दवा प्रतिरोध को ट्रैक करने के साथ ही विशेष रूप से eliminat में होने जा रही क्षेत्रों में मलेरिया नियंत्रण के प्रयासों के जवाब में, जनसंख्या निगरानी के लिए अलग-अलग परजीवी फिंगरप्रिंट के लिए क्षमता प्रदान करते हैंआयन स्थिति।
सूचनात्मक SNPs विशिष्ट जीनोटाइपिंग प्रौद्योगिकियों के लिए नास्तिक हैं कि पहचान की गई है, वहीं उच्च संकल्प पिघलने (मानव संसाधन विकास मंत्री) के विश्लेषण के लिए क्षेत्र आधारित अध्ययन विशेष रूप से अनुकूल है। एक एकल लेबल जांच में अलग-अलग SNPs की आवश्यकता होती है और कई जीनोम (polygenomic) होते हैं कि नमूने में SNPs पता लगाने के लिए सबसे अच्छा है पर 10% संवेदनशीलता का प्रस्ताव है कि मानक फ्लोरोसेंट जांच आधारित विधियों की तुलना में, मानव संसाधन विकास मंत्री 2-5% संवेदनशीलता प्रदान करता है। इस तरह अवरुद्ध जांच और असममित प्राइमर सांद्रता के साथ ही मामूली एलील के प्रवर्धन की ओर पूर्वाग्रह पीसीआर प्रवर्धन annealing तापमान के अनुकूलन के रूप में मानव संसाधन विकास मंत्री के लिए संशोधन, आगे मानव संसाधन विकास मंत्री की संवेदनशीलता को बढ़ा सकते हैं। संवेदनशीलता सुधार विशिष्ट परख पर निर्भर करते हैं, हम मामूली एलील की 1% से कम करने के लिए पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ गई हैं।
मलेरिया उन्मूलन के करीब पहुंच क्षेत्रों में, उभरते या आयातित दवा प्रतिरोध का जल्दी पता लगाने के लिए जनसंपर्क के लिए आवश्यक हैompt प्रतिक्रिया। इसी तरह, polygenomic संक्रमण का पता लगाने और गुप्त स्थानीय जलाशयों से आयातित परजीवी प्रकार के अंतर करने की क्षमता नियंत्रण कार्यक्रमों को सूचित कर सकते हैं।
यह पांडुलिपि आगे रोगी के नमूने में polygenomic संक्रमण की पहचान करने के लिए अपनी संवेदनशीलता को बढ़ाने कि उच्च संकल्प पिघलने प्रौद्योगिकी के लिए संशोधन का वर्णन है।
मलेरिया नियंत्रण और उन्मूलन में नए सिरे से रुचि होने के बावजूद, मलेरिया लगभग संक्रमण के जोखिम में दुनिया की आबादी का आधा और सालाना 550,000 से अधिक लोगों की मृत्यु, उप-सहारा अफ्रीका 1 में विशेष रूप से बच्चों के साथ दुनिया भर में एक बोझ बनी हुई है।
इन नए नियंत्रण और उन्मूलन कार्यक्रमों कम दवा संवेदनशीलता के साथ जुड़े म्यूटेशन के लिए अनुक्रम और विश्लेषण मलेरिया परजीवी के लिए बड़ी संख्या में वृद्धि हुई, डाह के साथ जीनोमिक पुनर्जागरण के द्वारा समर्थित है, और जनसंख्या विशेषताओं 2,3 के लिए कर दिया गया है। एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) सबसे अधिक पहचान आनुवंशिक वेरिएंट 4-7 के बीच में हैं।
पोर्टेबल एसएनपी जीनोटाइपिंग तरीकों पर साइट और वास्तविक समय आबादी निगरानी और 8 पर नज़र रखने की पेशकश करते हैं। व्यक्तिगत परजीवी फिंगरप्रिंटिंग के अलावा, 'आणविक बारकोड' भी एलील आवृत्ति में नाटकीय अस्थायी बदलाव का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता हैके रूप में अच्छी तरह से विचरण प्रभावी जनसंख्या के आकार और संक्रमण 9 की जटिलता के रूप में।
सूचनात्मक SNPs के इस सेट को आसानी से कई जीनोटाइपिंग प्लेटफार्मों के लिए अनुकूल है, वहीं उच्च संकल्प (मानव संसाधन विकास मंत्री) के विश्लेषण के विशेष रूप से संवेदनशील और सरल ऑपरेशन और कम लागत पर उपन्यास म्यूटेशन का पता लगाने के अनुक्रमण और अन्य की तुलना में जहां अध्ययन,-आधारित क्षेत्र के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है पिघलने दृष्टिकोण संसाधन गरीब सेटिंग्स में आकर्षक हैं।
मानव संसाधन विकास मंत्री एक फ्लोरोसेंट रंजक को शामिल किया गया है कि मानक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के साथ शुरू होता है। बाद पीसीआर पिघलने विश्लेषण शिखर amplicon के पिघलने के तापमान को निर्धारित करता है; एक छोटी amplicon में एक भी एसएनपी अंतर पर्याप्त शिखर पिघलने के तापमान (टीएम) मतभेद हो सकता है।
इस विधि के लिए कई शोधन (वर्तमान कई alleles के साथ नमूनों में polyg नाबालिग उत्परिवर्ती alleles चतुर्थ श्रेणी (एटी) SNPs सहित SNPs अंतर है, और पता लगाने के लिए बेहतर जीनोटाइपिंग संकल्प प्रस्तावEnomic संक्रमण)। सबसे पहले, assays के आगे और अलग सांद्रता में मौजूद हैं कि प्राइमरों रिवर्स करने के अलावा एसएनपी क्षेत्र पर केंद्रित लघु जांच को शामिल। ये अवरुद्ध जांच की वजह से जांच-टेम्पलेट उत्पाद का उत्पादन बढ़ाने कि असममित प्राइमर सांद्रता के लिए पीसीआर के दौरान परिलक्षित है, लेकिन अधिक में उत्पादित किनारा करने के लिए बाध्य नहीं कर रहे हैं। अतिरिक्त टेम्पलेट किनारा करने के लिए बाध्य जांच से मिलकर ये अलग डबल असहाय amplicons ~ 20-30 बीपी कर रहे हैं; उनकी काफी 10 बेमेल एक या कई आधार जांच-टेम्पलेट के साथ जुड़े बहुत बड़ा टीएम मतभेद के पूरे amplicon (80-150 बीपी) की बढ़त की तुलना में लंबाई में कमी आई है।
दूसरा, उत्परिवर्ती एलील प्रवर्धन पूर्वाग्रह (Maab) बायस के लिए polygenomic संक्रमणों में कम अनुपात में उपस्थित उत्परिवर्ती alleles के प्रति प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया annealing तापमान को कम करती है। annealing तापमान पूरी तरह से मिलान (जंगली प्रकार) की टीएमएस और बेमेल (उत्परिवर्ती) जांच के बीच निर्धारित हैएस। इस तापमान पर, जंगली प्रकार एलील के बंधन कि प्रवर्धन इस प्रकार दोनों एक भी नमूना 10 में मौजूद हैं जब उत्परिवर्ती एलील की ओर प्रवर्धन biasing, इसकी बेमेल बराबर की तुलना में रुकावट है काफी स्थिर है।
इन मानव संसाधन विकास मंत्री शोधन के साथ, इस तकनीक मौजूद कम से कम 1 में महामारी दक्षिण अमेरिका के 11 में संक्रमण और नए परिवर्तन का पता लगाने के अनुक्रम में एक दूसरे के लिए तुरंत बगल में स्थित कई SNPs के भेदभाव, और परिवर्तन के साथ जुड़े परजीवी के मूल की ट्रैकिंग और पहचान की अनुमति दी गई है polygenomic नमूने 10 में alleles के%।
वृद्धि की संवेदनशीलता पूर्व उन्मूलन की स्थिति और दवा प्रतिरोध उभर के लिए खतरा उन लोगों के करीब पहुंच क्षेत्रों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जल्दी और आसानी से साइट पर कम संवेदनशीलता के साथ जुड़े आयातित परजीवी और SNPs पहचान करने की क्षमता निगरानी प्रयासों और नियंत्रण कार्यक्रमों के बारे में बताते हैंउनके कार्यान्वयन और बढ़ा मलेरिया उन्मूलन और उन्मूलन के प्रयासों के लिए पहचानती आकर्षण के केंद्र की प्रभावशीलता। इस प्रोटोकॉल के लिए विधियों का वर्णन अवरुद्ध जांच पर आधारित है और Maab के लिए वृद्धि की मानव संसाधन विकास मंत्री जीनोटाइपिंग संवेदनशीलता।
सतत मानव संसाधन विकास मंत्री एक के बाद पीसीआर विश्लेषण कदम है; इसलिए, नमूना और परख सेटअप से संक्रमण को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल एक फ्लोरोसेंट intercalating डाई की अतिरिक्त समावेश के साथ, मानक पीसीआर प्रोटोकॉल के समान है डबल असहाय उच्च संकल्प पिघलने चरण के दौरान एकल असहाय डीएनए के लिए। सफल मानव संसाधन विकास मंत्री के विश्लेषण के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक एक मजबूत पीसीआर उत्पाद है। परख डिजाइन महत्वपूर्ण है, और मानव संसाधन विकास मंत्री परख डिजाइन के लिए अनुकूलित कई उपकरण वाणिज्यिक और ऑनलाइन 13 उपलब्ध हैं। ~ 20 आधार जोड़ी के साथ साथ 80-150 आधार जोड़े की Amplicon लंबाई जांच क्षेत्र के भीतर SNPs के साथ ही कई SNPs के हैप्लोवर्गों अंतर करने के लिए एसएनपी या ब्याज काम सबसे अच्छा के SNPs पर केन्द्रित जांच जाम कर दिया। जांच एक 3 'सी 3 स्पेसर या 3 पर एक 2 आधार जोड़ी बेमेल' प्रवर्धन के दौरान विस्तार रोकने के लिए जो अंत, या तो उपयोग अवरुद्ध किया जा सकता है। जांच वाटसन या क्रिक टेम्पलेट कतरा मैच के लिए तैयार किया जा सकता है; विकल्पस्वीकार्य पिघलने चोटियों पैदा करता है जो जांच के डिजाइन निर्धारित करने के लिए अनुभवजन्य परीक्षण पर निर्भर करता है। आगे अतिरिक्त या रिवर्स प्राइमरों अवरुद्ध जांच करने के लिए anneals कि एकल असहाय प्रवर्धन उत्पाद का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जांच आगे कतरा अनुक्रम होता है, तो फिर, प्राइमर अधिक में प्रयोग किया जाता है रिवर्स आम तौर पर एक 1: 5 के अनुपात, और रिवर्स कतरा है कि मैच के जांच के लिए उपाध्यक्ष प्रतिकूल।
इसी प्रकार, मानव संसाधन विकास मंत्री पर्याप्त और मजबूत पीसीआर उत्पाद के साथ सबसे अच्छा काम करता है। पीसीआर प्रतिक्रिया अनुकूलन इष्टतम annealing तापमान निर्धारित करने के लिए ढाल पीसीआर और agarose जैल या Bioanalyzer विश्लेषण की आवश्यकता है। खाका एकाग्रता ऐसे पूर्व प्रवर्धन, टेम्पलेट एकाग्रता 13 बढ़ाने के लिए कम प्राइमर एकाग्रता और चक्र नंबर का उपयोग कर सभी लक्ष्यों की पक्षपातपूर्ण मल्टिप्लेक्स प्रवर्धन जैसे तरीकों का उपयोग बढ़ाया जा सकता है।
साधनों के केवल एक मुट्ठी Maab के साथ संगत कर रहे हैं। कांच केशिकाओं ट्यूबों के तापीय गुणों मैं इस्तेमाल कियाn इन प्रणालियों इस विधि की सुविधा। केशिकाओं के छोटे आंतरिक व्यास के साथ ही कांच के माध्यम से तेजी से गर्मी हस्तांतरण प्लास्टिक के थर्मल इन्सुलेट गुणों के कारण annealing और विकृतीकरण चक्र के बीच में धीमी संक्रमण दर है, जो मानक पीसीआर plasticware, की तुलना में अधिक कठोर तापमान नियंत्रण प्रदान करते हैं। इस विधि के साथ, पता लगाने संवेदनशीलता जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती alleles 10 का एक मिश्रण में एक उत्परिवर्ती एलील की 1% से कम करने के लिए 2-5% से कम किया जा सकता है।
मानव संसाधन विकास मंत्री कैंसर जीन वेरिएंट के लिए स्कैनिंग के लिए संक्रामक रोग निगरानी से सेटिंग और कई आवेदनों की एक किस्म में एसएनपी जीनोटाइपिंग के लिए एक, सुगम, कुशल और किफायती उपकरण है। ऐसे रॉश नैनो और LightCycler प्रणालियों (480 और 96) के रूप में अच्छी तरह से मानक प्रवर्धन, वास्तविक समय, और कॉपी संख्या कार्यक्षमता के अलावा पारिस्थितिकी वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली की पेशकश मानव संसाधन विकास मंत्री के रूप में कई अन्य उपकरणों। उच्च throughput मशीनों का उपयोग करना, मानव संसाधन विकास मंत्री बारकोडिंग की लागत लेससभी अभिकर्मकों और उपभोग्य सहित हमारे हाथ में परख प्रति $ 0.50 की तुलना में एस।
यहाँ वर्णित संदर्भ में, क्षेत्र-आधारित अनुप्रयोगों के लिए कम आबादी विविधता, आयातित परजीवी प्रकार का पता लगाने, और कम दवा संवेदनशीलता के साथ जुड़े SNPs की उपस्थिति और प्रसार सहित मलेरिया नियंत्रण के प्रयासों के साथ जुड़े परिवर्तन के लिए वास्तविक समय आबादी निगरानी की अनुमति देते हैं। विधि शोधन मलेरिया उन्मूलन और उन्मूलन की दिशा में प्रगति सूचित करने के लिए उपयोगी अतिरिक्त संवेदनशीलता प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों प्रौद्योगिकी विकास और प्रशिक्षण के अपने समर्थन के लिए बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन धन्यवाद।
LightScanner Master Mix | BioFire Defense | HRLS-ASY-0003 | |
Light mineral oil | Sigma | M5904 | for BioFire Defense plate-based HRM systems |
TE | Teknova | T0226 | |
Te | Teknova | T0221 | TE buffer with reduced EDTA |
PCR grade water | Teknova | W3330 | |
Plasmodium falciparum standards | MR4 | MRA-151, 156, 205, 330 | MR4.org offers free genomic DNA |
Light Scanner Primer Design Software | BioFire Defense | commercial sofware for HRM assay design | |
LightCycler 480 High Resolution Melting Master Mix | Roche | 4909631001 | For use in LightCycler-480, -96, and nano. 2x concentration |
Bioanalyzer | Agilent | G2938A | Agilent 2100 bioanalyzer |
LightCycler 2.0 | Roche | 3531414001 | Capillary-based system for MAAB |
LightCycler Nano | Roche | 6407773001 | Strip tube-based HRM and amplification |
LightCycler 96 | Roche | 5815916001 | Strip-tube and plate-based HRM and amplification |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | plate-based HRM (96 and 384-well plates) and amplification |
LightScanner-96 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0011 | plate-based HRM (96-well) |
LightScanner-384 | BioFire Defense | LSCN-ASY-0001 | plate-based HRM (96-well) |
96-well plates | Roche | 4729692001 | 96-well plates for HRM (LightCycler |
384-well plates | Roche | 4729749001 | 384-well plates for HRM (LightCycler) |
96-well plates | Bio-Rad | HSP-9665 | 96-well plates for HRM (LightScanner) |
384-well plates | Bio-Rad | HSP-3865 | 384-well plates for HRM (LightScanner) |
LightCycler 8-Tube Strips (clear) | Roche | 6327672001 | strip tubes for HRM (Light Cycler 96 and Light Cycler Nano) |
LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche | 4929292001 | capillaries for HRM |
Optical plate seals | Roche | 4729757001 | other brands also work |